Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Questo video mostra un metodo per catturare le dinamiche di riparazione dei tessuti su uno stereomicroscopio utilizzando l'imaging time-lapse. Ciò si ottiene allevando prima gli embrioni di zebrafish allo stadio larvale quando la pinna caudale si è sufficientemente sviluppata a una dimensione in cui le amputazioni possono essere facilmente eseguite. Questo si ottiene in genere dopo la schiusa.

Il secondo passo consiste nell'amputare la pinna caudale usando un ago da siringa. Il terzo passo consiste nel montare le larve in una camera di imaging e catturare un filmato time-lapse su uno stereomicroscopio. Il passo finale consiste nel quantificare la rigenerazione della pinna caudale utilizzando un software di analisi di imaging come Bit Plains S o il software open source J.Hi.My studi di laboratorio sulla riparazione delle ferite e sulla rigenerazione dei tessuti utilizzando il pesce zebra come modello.

Oggi dimostreremo un metodo che cattura la dinamica di questi processi in tempo reale utilizzando la stereoscopia in campo chiaro. Oggi dimostreremo un metodo che cattura i primi processi di rigenerazione dei tessuti utilizzando la pinna caudale larvale del pesce zebra. Il metodo di imaging presentato offre l'opportunità di osservare e analizzare i comportamenti dell'intero tessuto in una semplice impostazione del microscopio, che è facilmente adattabile a qualsiasi stereomicroscopio dotato di funzionalità time-lapse.

Quindi iniziamo. Allevamento di zebrafish Agli stadi larvali. La riparazione della ferita nella pinna caudale può essere osservata al meglio dopo le fasi di schiusa, poiché la pinna caudale si è sufficientemente sviluppata a questo punto e le amputazioni possono essere facilmente eseguite senza danneggiare il midollo spinale o altri tessuti.

Nelle immediate vicinanze, raccogli le uova e incubale in un'incubatrice a 28 gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, rimuovere gli embrioni morti e risciacquare con un terreno embrionale contenente lo 0,03% di soluzione salina istantanea dell'acquario oceanico. Se necessario, aggiungere al piatto un terreno embrionale con fenotiroide allo 0,003% per prevenire la pigmentazione delle larve.

Per questa dimostrazione, abbiamo lasciato che gli embrioni si sviluppassero fino a due giorni dopo la fecondazione nell'incubatrice, quando le larve si sono schiuse dalla loro preparazione della camera di imaging. In questa fase, forniamo due metodi per costruire la camera di imaging. Il primo metodo consiste in una camera di imaging realizzata con tubi in PVC o teflon per acqua potabile, che può essere acquistata in qualsiasi negozio di ferramenta.

Utilizzare tubi con un diametro esterno di 25 millimetri e uno interno di 20 millimetri in quanto hanno le dimensioni appropriate per l'attacco del vetrino coprioggetti. Tagliare il tubo per ottenere anelli spessi 10 millimetri il più uniformi possibile. Usa la carta vetrata per levigare i bordi e risciacqua con acqua ed etanolo.

Lasciare asciugare la camera all'aria. Il secondo metodo consiste nell'utilizzare una camera di imaging prefabbricata con fondo in vetro tecnico opaco, con parte superiore in vetro o la creazione di una camera di imaging da una piccola capsula di Petri. Per creare la tua camera di imaging, utilizza una piastra di Petri da 35 o 50 millimetri e pratica un foro da 10 millimetri nel coperchio.

Quindi applica del grasso al silicone all'esterno del vetrino coprioggetto e attacca un vetrino coprioggetto quadrato o rotondo di 25 x 25 millimetri all'esterno con una punta della pipetta pulita per garantire che l'agros di montaggio rimanga saldamente attaccato. Durante la procedura di imaging, fissare una rete di plastica sottile all'interno del vetrino coprioggetto. Questo può essere ottenuto tagliando la rete alla dimensione del diametro dell'anello interno e quindi tagliando un piccolo rettangolo circa tre volte la dimensione delle larve al centro della rete.

Montaggio e imaging delle larve pre-infortunio. Questa fase è adatta per la successiva quantificazione della rigenerazione delle alette. Innanzitutto, preparare una soluzione agro a basso punto di fusione allo 0,5% nel terreno embrionale per l'immobilizzazione del campione che trasferisce la larva anestetizzata nella soluzione aro che è stata mantenuta a 42 gradi Celsius.

In un blocco riscaldante, trasferisci le larve con una goccia di agro in una piccola capsula di Petri e posiziona le larve su un lato. Utilizzando una punta del micro caricatore con tappo, lasciare solidificare l'aros e aggiungere la soluzione di trica. Procedere allo stereomicroscopio che verrà utilizzato in seguito.

Per l'imaging time-lapse, utilizziamo uno stereomicroscopio zes discovery V 12 e il software di visione Axio per la dimostrazione. Innanzitutto, regolare le impostazioni del microscopio selezionando l'obiettivo e l'ingrandimento appropriati per l'imaging. Quindi selezionare la modalità di rilevamento della fotocamera sul microscopio nel software alvis.

Seleziona la modalità live per visualizzare la larva sullo schermo. Aprire la finestra delle proprietà per rilevare automaticamente la luminosità, regolare manualmente il contrasto alla base di transilluminazione del microscopio. Sposta le larve fuori dal campo visivo e seleziona la funzione di correzione dell'ombreggiatura.

Per ridurre al minimo il rumore di fondo, riposiziona le larve nel campo visivo e scatta un'istantanea. Salva l'immagine per prepararti alla ferita. Rimuovi le larve dagli aros raschiando prima gli aeros dalla testa.

Ciò consente alle larve di essere in grado di scivolare fuori dall'aeros tirando delicatamente la testa lontano dal test di amputazione aeros rimanente. Preparare una piastra aeros all'1,5% utilizzando una soluzione istantanea di sale oceanico. Sotto uno stereomicroscopio, posizionare le larve lateralmente sull'aros solidificato e amputare la parte distale della pinna caudale con un ago da siringa calibro 23.

Montaggio delle larve per l'imaging time-lapse. Presenteremo due metodi di imaging time-lapse. Nel primo metodo, mostreremo come visualizzare le larve nell'anello della camera dopo il montaggio delle larve.

Raschiare accuratamente gli agro solidificati che circondano la pinna caudale distale con una punta per pipetta micro loader con tappo. Ciò consente una corretta guarigione della ferita o la rigenerazione dei tessuti Senza trattenere il tessuto, cercare di non ferire ripetutamente la pinna. Durante questa procedura, rimuovere i detriti indesiderati che interferiscono con la procedura di imaging dalla camera sostituendo la vecchia soluzione.

Con la soluzione fresca di Trica, applicare grasso siliconico sulla parte superiore della camera e riempire l'anello della camera con una soluzione di trica fresca. Applicare un vetrino sulla parte superiore per sigillare la camera metodo due. In questo metodo, ti mostreremo come visualizzare le larve in una capsula di Petri con piano di vetro.

Montare le larve sul coperchio, coprirle e riempirlo completamente. Con soluzione di trica. Raschiare gli agros dalla pinna caudale.

Quindi, applicare il grasso siliconico sul bordo superiore della camera inferiore e riempire la camera con la soluzione di trica. Decantare accuratamente la soluzione di trica dal coperchio e capovolgere il coperchio per immergere la larva nella soluzione di trica della camera inferiore, operazione che può essere eseguita con una leggera angolazione. Per evitare sacche d'aria, la camera sarà sigillata con l'imaging time-lapse del grasso siliconico per garantire il mantenimento di una temperatura adeguata di 28 gradi Celsius.

Assemblare una camera di incubazione riscaldata fatta di pluriball di cartone per l'isolamento e una cupola cablata utilizzata per l'incubazione dell'uovo di gallina come fonte di calore. Posizionare la camera di incubazione attorno al microscopio e regolare la temperatura a 28 gradi Celsius. Per circa 10-20 minuti o fino a quando la temperatura non si è stabilizzata, aprire la parte anteriore della camera di incubazione riscaldata e posizionare la camera di imaging sul microscopio.

Stare in piedi con il vetrino coprioggetto rivolto verso l'alto verso l'obiettivo. Posizionare la pinna larvale in modo che due terzi del campo visivo rimangano liberi per garantire la cattura della crescita e la rigenerazione della pinna nel corso della procedura di imaging. Senza dover riposizionare le larve nella finestra di acquisizione multidimensionale 60 del software, selezionare l'opzione Z stack e time-lapse nella scheda Zack e la modalità slice

Selezionare lo spessore della fetta, quindi selezionare la modalità di avvio, arresto. Definisce le posizioni superiore e inferiore della pila nella tabella time-lapse. Selezionare l'intervallo e la durata del filmato, quindi premere il pulsante di avvio per avviare la registrazione.

Entro la prima ora, controlla i confini e Zack delle larve. Se necessario, riposizionare le larve nel tempo poiché potrebbero essersi spostate a causa della crescita o delle differenze nella composizione degli agros. Salvare il file al termine della registrazione time-lapse e procedere con la fase di post-elaborazione e quantificazione dell'analisi dei dati.

In questa sezione, discutiamo diversi modi per analizzare i dati generati dal metodo uno imas. Innanzitutto, discuteremo come determinare la crescita delle pinne con il software imas. Apri il filmato time-lapse nel software Amaris e salva i file nel formato di file MRS.

Per migliorare le prestazioni del software, selezionare la vista ortogonale per visualizzare il filmato come proiezione. Per misurare la lunghezza dell'aletta, selezionare l'opzione Aggiungi nuovi punti di misurazione nella barra degli strumenti in alto a sinistra. In Configura elenco di valori statistici visibili, selezionare i valori statistici da visualizzare in modalità linea.

Nella scheda delle impostazioni, selezionare le coppie nelle proprietà delle etichette, selezionare il nome e la distanza per visualizzare la distanza tra i punti A e B accanto alla linea di misurazione, passare alla modalità di modifica e tenere premuto il pulsante Maiusc per selezionare il primo punto in corrispondenza della pinna distale. Quindi utilizzare la stessa configurazione per selezionare il secondo punto all'estremità distale del no accord. La distanza verrà visualizzata nell'immagine e potrà essere esportata nella scheda delle statistiche.

Selezionando il pulsante del disco, esporta tutto in basso a destra. In alternativa all'opzione dei punti di misurazione, il visualizzatore di sezioni può essere utilizzato per misurare le distanze nella modalità di visualizzazione delle sezioni. Scorrere fino alla posizione desiderata e fare clic sulla prima e sulla seconda posizione con il tasto sinistro del mouse, verrà visualizzata la distanza.

Questa opzione, tuttavia, non consente l'esportazione dei dati. Ora discuteremo brevemente come determinare l'area delle alette utilizzando il software open source. Immagine J.Apri il filmato TimeLapse nell'immagine J utilizzando un plug-in che riconosce il formato di file Zeiss Axio vision.

In alternativa, caricare in una sequenza TIFF non compressa. Ciò garantirà che le informazioni sul file vengano salvate in analizza seleziona imposta scala per definire la distanza e i pixel e la distanza nota, se non conservate nel file. Inoltre, impostare la lunghezza dell'unità su micrometri.

Nella barra degli strumenti. Seleziona lo strumento di selezione della mano libera e delinea la ferita tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse. Mentre si disegna lungo i bordi della ferita.

Fare clic sull'opzione di misurazione in Analizza per visualizzare l'area dei risultati rappresentativi della ferita. L'amputazione della pinna porta a una parziale rigenerazione nel corso di 36 ore dopo l'amputazione. Le misurazioni dell'area della pinna mostrano che l'amputazione della pinna innesca una diminuzione del tessuto della pinna fino a circa 14 ore dopo l'amputazione, presumibilmente a causa della morte cellulare, che è seguita da una sottile lunghezza di rigenerazione.

Il confronto tra la pinna amputata e quella rigenerata mostra un aumento di 2,48 volte della lunghezza della pinna entro 36 ore. L'amputazione innesca inizialmente un effetto corda di borsa caratterizzato da contrazioni attraverso i cavi di actina e miosina che sono presenti nelle celle della piega delle pinne, estrudono dalla ferita di amputazione e vengono successivamente eliminati. La lunghezza del corpo aumenta inizialmente, ma la pinna non si rigenera.

Durante le prime fasi. A circa 14 ore dall'amputazione, la pinna inizia a crescere dalla posizione prossimale a quella distale. In sintesi, i nostri risultati dimostrano che l'amputazione innesca la contrazione della ferita, che può essere essenziale per promuovere l'estrusione cellulare.

Una volta completato il processo, la pinna inizia a rigenerarsi. Sembra che si verifichi la crescita delle pinne durante lo sviluppo. Indipendentemente da questo processo, abbiamo presentato un metodo che consente l'osservazione dei processi dinamici di riparazione tissutale utilizzando larve di zebrafish viventi.

Questa procedura richiede alcuni aspetti che abbiamo testato per ottimizzare il risultato. Un chiaro vantaggio del metodo di imaging presentato è che è facilmente adattabile a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una fotocamera CCD e del software TimeLapse. Offre inoltre un'alternativa a basso costo al più costoso sistema di imaging confocale.

Sebbene questo metodo non utilizzi la fluorescenza o il rilevamento cellulare, può essere ampliato per tali applicazioni utilizzando un sistema automatizzato per il controllo della frantumazione e un software di deconvoluzione post imaging per osservare ulteriormente i processi di riparazione e rigenerazione delle ferite con risoluzione subcellulare. Questo metodo può fornire agli studenti una migliore comprensione dei processi biologici di base, della riparazione e della rigenerazione dei tessuti sottostanti. La chiarezza ottica e la facilità con cui il pesce zebra embrionale e larvale può essere utilizzato e l'adattabilità del sistema a qualsiasi stereomicroscopio lo rendono adatto per l'insegnamento della biologia delle vertebre di base in un ambiente scolastico.