Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Questo video dimostra un metodo per catturare la dinamica del riparo tissutale su un microscopio stereoscopico mediante imaging in time-lapse. Questo viene realizzato innanzitutto allevando embrioni di pesce zebra fino allo stadio larvale, quando la pinna caudale si è sufficientemente sviluppata fino a raggiungere una dimensione che permette di effettuare agevolmente amputazioni. Ciò viene tipicamente ottenuto dopo la schiusa.

Il secondo passaggio consiste nell'amputare la pinna caudale utilizzando un ago per siringa. Il terzo passaggio prevede il montaggio delle larve in una camera per imaging e l'acquisizione di un filmato in time-lapse mediante un microscopio stereoscopico. L'ultimo passaggio consiste nel quantificare la rigenerazione della pinna caudale utilizzando un software di analisi delle immagini come Bit Plains S o il software open source ImageJ. Ciao. Il mio laboratorio studia la riparazione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti utilizzando il pesce zebra come modello.

Oggi dimostreremo un metodo che cattura la dinamica di questi processi in tempo reale mediante microscopia stereoscopica a campo chiaro. Oggi illustreremo un approccio in grado di registrare le prime fasi della rigenerazione dei tessuti utilizzando la pinna caudale del larva di pesce zebra. Il metodo di imaging presentato offre l'opportunità di osservare e analizzare comportamenti su scala del tessuto intero in un semplice sistema microscopico, facilmente adattabile a qualsiasi microscopio stereoscopico dotato di funzionalità per acquisizioni sequenziali nel tempo.

Iniziamo. Allevamento dei zebrafish fino alle fasi larvali. La riparazione della ferita nella pinna caudale può essere osservata al meglio dopo le fasi di schiusa, poiché la pinna caudale si è sufficientemente sviluppata entro questo momento e le amputazioni possono essere eseguite facilmente senza danneggiare il midollo spinale o altri tessuti.

In prossimità, raccogliere le uova e incubarle in un incubatore a 28 gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, rimuovere gli embrioni morti e sciacquare con mezzo embrionale contenente una soluzione salina per acquario all'0,03% di Instant Ocean. Se necessario, aggiungere al piatto del mezzo embrionale con fenotiroxina allo 0,003% per prevenire la pigmentazione delle larve.

Per questa dimostrazione, lasciamo sviluppare gli embrioni fino a due giorni dopo la fecondazione nell'incubatrice, quando le larve sono schiuse dalle loro uova, prima della preparazione della camera di imaging. In questo passaggio, forniamo due metodi per costruire la camera di imaging. Il metodo uno prevede una camera di imaging realizzata con tubi in PVC o teflon di qualità idonea al contatto con acqua potabile, reperibili in qualsiasi negozio di ferramenta.

Utilizzare un tubo con un diametro esterno di 25 millimetri e un diametro interno di 20 millimetri, poiché questa dimensione è adatta per l'attacco del vetrino coprioggetti. Tagliare il tubo per ottenere anelli spessi 10 millimetri, il più uniformemente possibile. Utilizzare della carta vetrata per levigare i bordi e risciacquare con acqua ed etanolo.

Lasciare asciugare l'aria nella camera. Il secondo metodo consiste nell'utilizzare una camera per imaging con fondo in vetro opaco già preconfezionata oppure nel realizzare una camera per imaging a partire da una piccola piastra di Petri. Per costruire autonomamente la camera per imaging, utilizzare una piastra di Petri da 35 o 50 millimetri e praticare un foro da 10 millimetri nel coperchio.

Applicare successivamente della vaselina siliconica all'esterno del vetrino e fissare un vetrino coprioggetto quadrato o rotondo di 25 per 25 millimetri all'esterno utilizzando la punta pulita di una pipetta per assicurare che l'agar di montaggio rimanga saldamente attaccato. Durante la procedura di acquisizione delle immagini, fissare una sottile rete di plastica all'interno del vetrino coprioggetto. Questo può essere ottenuto tagliando la rete alle dimensioni del diametro interno dell'anello e successivamente ritagliando un piccolo rettangolo al centro della rete, di dimensioni pari a circa tre volte quella delle larve.

Montaggio e acquisizione d'immagini delle larve prima della lesione. Questo passaggio è adatto per la successiva quantificazione della rigenerazione della pinna. Preparare innanzitutto una soluzione al 0,5% di agarosio a basso punto di fusione nel mezzo per embrioni, per l'immobilizzazione del campione, trasferendo la larva anestetizzata nella soluzione di agarosio mantenuta a 42 gradi Celsius.

In un blocco riscaldante, trasferire le larve con una goccia di agros in una piccola capsula di Petri e posizionare le larve di lato. Utilizzando una punta micro loader con tappo, far solidificare l'agros e aggiungere la soluzione trica. Procedere quindi al microscopio stereoscopico che verrà utilizzato in seguito.

Per l'acquisizione di immagini in time-lapse, utilizziamo un microscopio stereoscopico ZES Discovery V12 e il software Axio Vision a scopo dimostrativo. Prima di tutto, regolare le impostazioni del microscopio selezionando l'obiettivo e l'ingrandimento appropriati per l'acquisizione delle immagini. Successivamente, selezionare la modalità di rilevamento della telecamera sul microscopio all'interno del software Alvis.

Selezionare la modalità live per visualizzare la larva sullo schermo. Aprire la finestra delle proprietà per rilevare automaticamente la luminosità e regolare manualmente il contrasto alla base di trasilluminazione del microscopio. Spostare le larve fuori dal campo visivo e selezionare la funzione di correzione dell'ombreggiatura.

Per ridurre al minimo il rumore di fondo, riposizionare i larvi nel campo visivo ed acquisire un'immagine. Salvare l'immagine per prepararsi alla ferita. Rimuovere i larvi dagli aros staccando prima gli aeros dalla testa.

Questo permette alle larve di potersi sfilare dagli aros tirando delicatamente la testa lontano dal resto dell'aeros nell'assay di amputazione. Preparare una piastra di aros all'1,5% utilizzando una soluzione salina di Instant Ocean. Sotto un microscopio stereoscopico, posizionare le larve di lato sul aros solidificato e amputare la parte distale della pinna caudale con un ago per siringa da 23 gauge.

Montaggio delle larve per l'acquisizione di immagini in time-lapse. Presenteremo due metodi di acquisizione in time-lapse. Nel primo metodo, mostreremo come acquisire immagini delle larve all'interno dell'anello della camera dopo il montaggio delle larve.

Staccare con attenzione l'agarosio solidificato intorno alla pinna caudale distale utilizzando la punta di una pipetta micro loader con tappo. Questo consente una corretta guarigione della ferita o rigenerazione del tessuto. Senza immobilizzare il tessuto, evitare di danneggiare ripetutamente la pinna. Durante questa procedura, rimuovere i detriti indesiderati che interferiscono con la procedura di imaging dalla camera, sostituendo la soluzione vecchia.

Con una soluzione fresca di Trica, applicare del grasso siliconico sulla parte superiore della camera e riempire l'anello della camera con soluzione fresca di trica. Applicare una lamella di vetro sulla parte superiore per sigillare la camera, metodo due. In questo metodo, vi mostreremo come acquisire immagini delle larve in una piastra di Petri con fondo di vetro.

Montare i larve sul coperchio, coprire con un'ampolla e riempire il coperchio. Con soluzione trica. Raschiare via gli agros dalla pinna caudale.

Successivamente, applicare della vaselina siliconica al bordo superiore della camera inferiore e riempire la camera con soluzione trica. Versare con attenzione la soluzione trica dal coperchio e capovolgere il coperchio per immergere il larva nella soluzione trica della camera inferiore, operazione che può essere eseguita con un leggero angolo. Per evitare la formazione di sacche d'aria, la camera verrà sigillata con la vaselina siliconica e sottoposta a imaging in time-lapse per garantire il mantenimento di una temperatura adeguata di 28 gradi Celsius.

Assemblare una camera di incubazione riscaldata realizzata in cartone con imbottitura in pluriball per l'isolamento termico e un coperchio cablato, come quelli utilizzati per l'incubazione delle uova di pollo, come fonte di calore. Posizionare la camera di incubazione attorno al microscopio e regolare la temperatura a 28 gradi Celsius. Per circa 10-20 minuti, o fino a quando la temperatura si sarà stabilizzata, aprire la parte anteriore della camera di incubazione riscaldata e posizionare la camera di acquisizione immagini sul microscopio.

Posizionarsi con il coprioggetto rivolto verso l'alto, in direzione dell'obiettivo. Disporre la pinna larvale in modo che due terzi del campo visivo rimangano liberi, per garantire l'acquisizione della crescita e della rigenerazione della pinna nel corso della procedura di imaging. Senza dover riposizionare le larve nella finestra di acquisizione multidimensionale da 60, selezionare nella scheda Zack l'opzione stack Z e quella per l'acquisizione temporale in modalità slice.

Selezionare lo spessore della sezione, quindi scegliere la modalità start stop. Definire le posizioni superiore e inferiore dello stack nella tabella time-lapse. Selezionare l'intervallo e la durata del filmato, quindi premere il pulsante di avvio per iniziare la registrazione.

Nella prima ora, verificare i confini delle larve di and Zack. Se necessario, riposizionare le larve nel tempo, poiché potrebbero essersi spostate a causa della crescita o di differenze nella composizione dell'agros. Salvare il file al termine della registrazione in time-lapse ed eseguire l'analisi dei dati del passaggio di post-elaborazione e quantificazione.

In questa sezione, discutiamo diversi modi per analizzare i dati generati dal metodo uno imas. Innanzitutto, illustreremo come determinare la crescita delle pinne mediante il software imas. Aprire il filmato in time-lapse nel software Amaris e salvare i file in formato MRS.

Per migliorare le prestazioni del software, selezionare la vista ortogonale per visualizzare il filmato come proiezione. Per misurare la lunghezza della pinna, selezionare l'opzione aggiungi nuovi punti di misurazione nella barra degli strumenti in alto a sinistra. Nell'elenco Configura valori statistiche visibili, selezionare i valori statistici da visualizzare in modalità linea.

Nella scheda impostazioni, selezionare coppie nelle proprietà delle etichette, quindi scegliere nome e distanza per visualizzare la distanza tra i punti A e B accanto alla linea di misurazione. Passare alla modalità modifica e tenere premuto il tasto Maiusc per selezionare il primo punto all'estremità distale della pinna. Utilizzare quindi la stessa configurazione per selezionare il secondo punto all'estremità distale del no accord. La distanza verrà visualizzata nell'immagine e potrà essere esportata nella scheda statistiche.

Selezionando il pulsante del disco "esporta tutto" in basso a destra. In alternativa all'opzione dei punti di misurazione, il visualizzatore di sezioni può essere utilizzato per misurare le distanze nella modalità di visualizzazione della sezione. Scorrere fino alla posizione desiderata e fare clic sulla prima e sulla seconda posizione con il tasto sinistro del mouse; la distanza verrà visualizzata.

Questa opzione, tuttavia, non consente l'esportazione dei dati. Ora discuteremo brevemente come determinare l'area delle pinne utilizzando il software open source ImageJ. Aprire il filmato TimeLapse in ImageJ utilizzando un plugin che riconosce il formato di file Zeiss Axio Vision.

In alternativa, carica una sequenza TIFF non compressa. Ciò garantisce che le informazioni del file vengano salvate; sotto Analizza, seleziona Imposta scala per definire la distanza in pixel e la distanza nota, se non già preservate nel file. Inoltre, imposta l'unità di lunghezza in micrometri.

Nella barra degli strumenti, selezionare lo strumento di selezione a mano libera e delineare la ferita tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse. Mentre si disegna lungo i margini della ferita.

Fare clic sull'opzione misura sotto analizza per visualizzare l'area dei risultati rappresentativi della ferita. L'amputazione della pinna provoca una rigenerazione parziale nel corso di 36 ore successive all'amputazione. Le misurazioni dell'area della pinna mostrano che l'amputazione induce una riduzione del tessuto della pinna fino a circa 14 ore dopo l'amputazione, presumibilmente a causa della morte cellulare, seguita successivamente da una rigenerazione ridotta in lunghezza.

Il confronto tra la pinna amputata e quella rigenerata mostra un aumento di 2,48 volte nella lunghezza della pinna entro 36 ore. L'amputazione inizialmente induce un effetto a cordone stringitore, caratterizzato da contrazioni mediate da filamenti di actina e miosina, presenti nelle cellule del ripiegamento della pinna, che fuoriescono dalla ferita d'amputazione e vengono successivamente eliminate. La lunghezza del corpo aumenta inizialmente, ma la pinna non rigenera.

Nelle fasi iniziali. Circa 14 ore dopo l'amputazione, la pinna inizia a crescere partendo da posizioni prossimali verso quelle distali. In sintesi, i nostri risultati dimostrano che l'amputazione induce il restringimento della ferita, processo che potrebbe essere essenziale per promuovere l'espulsione cellulare.

Una volta completato il processo, la pinna inizia a rigenerarsi. Sembra avvenire una crescita della pinna di tipo embriogenetico. Indipendentemente da questo processo, abbiamo presentato un metodo che consente l'osservazione dei processi dinamici di riparazione tissutale utilizzando larve di zebrafish vive.

Questa procedura richiede alcuni aspetti specifici che abbiamo testato al fine di ottimizzare i risultati. Un chiaro vantaggio del metodo di imaging presentato è che può essere facilmente adattato a qualsiasi microscopio stereoscopico dotato di una fotocamera CCD e di un software TimeLapse. Offre inoltre un'alternativa economica rispetto ai sistemi di imaging confocali, più costosi.

Sebbene questo metodo non utilizzi la fluorescenza o il rilevamento cellulare, può essere ampliato per tali applicazioni sfruttando un sistema automatizzato per il controllo degli artefatti da frantumazione e un software di deconvoluzione post acquisizione immagini, per osservare ulteriormente i processi di riparazione e rigenerazione delle ferite con risoluzione subcellulare. Questo metodo può fornire agli studenti una comprensione più approfondita dei processi biologici fondamentali alla base della riparazione e rigenerazione dei tessuti. La trasparenza ottica e la facilità con cui è possibile utilizzare lo zebrafish embrionale e larvale, unitamente alla versatilità del sistema, adattabile a qualsiasi microscopio stereoscopico, lo rendono adatto all'insegnamento della biologia dei vertebrati in un contesto scolastico.