A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare il calcio o l'ossido nitrico in un vaso appena isolato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo viene realizzato innanzitutto mediante l'isolamento meccanico e la preparazione del vaso. Successivamente, il vaso viene incubato nel colorante marcante per il calcio o in un colorante marcante per l'ossido nitrico con acido onico.

Quindi il vaso viene fissato a una piastra rivestita di silicone con una griglia e dei perni per garantire una visione stabile durante l'acquisizione con microscopia a due fotoni. Infine, si esegue l'acquisizione con microscopia a due fotoni e i risultati vengono quantificati. Questo video mostra l'aumento della segnalazione del calcio intracellulare nelle cellule endoteliali di vasi sanguigni isolati in risposta a variazioni della concentrazione di calcio extracellulare.

Infine, questo metodo permetterà ai ricercatori di monitorare le variazioni di calcio o di ossido nitrico nelle cellule endoteliali o nelle cellule muscolari lisce di un vaso sanguigno appena isolato. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che può fornire una migliore risoluzione del segnale e misurazioni precise dei processi intracellulari nei tessuti vascolari. Qui, questa tecnologia è stata applicata in combinazione con dadi classici, non geometrici, per misurare il transitorio di calcio e la produzione di ossido nitrico in singole cellule su una orca cava isolata.

Riteniamo che questa tecnica contribuirà ad approfondire la nostra conoscenza sui meccanismi che regolano i livelli intracellulari di calcio e di ossido all'interno dei diversi tipi di cellule vascolari. L'immagine microscopica con eccitazione a due fotoni di cellule vive, in particolare in tessuti integri come i vasi sanguigni, offre i vantaggi di un segnale ad alta risoluzione e di una bassa fluorescenza di fondo fuori fuoco. La localizzazione ristretta dell'eccitazione a due fotoni illumina un singolo volume focale nel tessuto, riduce notevolmente l'assorbimento fuori fuoco e diminuisce la diffusione della luce, consentendoci di osservare la dinamica di fluoruri in tessuti altamente autofluorescenti contenenti fibre di collagene ed elastina.

Dopo aver isolato l'aorta di ratto, secondo il protocollo descritto nel testo, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette a punta fine e forbici microchirurgiche per dissezionare il tessuto adiposo e quello connettivo dall'aorta. Una volta pulita, tagliare l'organo in senso longitudinale e trasferirlo in soluzione salina fisiologica per un uso successivo. Per preparare il cocktail di carico, aggiungere sette microlitri di una soluzione pronta di colorante flu oh 4:00 AM ad una concentrazione di un millimolare in DMSO a 450 microlitri di PSS priva di calcio.

Quindi aggiungere 40 microlitri di una soluzione al 10% di acido acetico non basata su DMSO al cocktail di carico per favorire la dispersione dei metil esteri di acetato e migliorare il carico del colorante per il calcio. Posizionare le aorte dissezionate in provette da 500 microlitri contenenti il cocktail di carico. Coprire le provette con della stagnola e collocarle su un agitatore rotante a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo aver seguito il protocollo testuale per fissare il tessuto aortico sulla superficie di una piastra rivestita di silicone, posizionare la piastra sotto l'obiettivo di un microscopio verticale a due fotoni e installare un obiettivo ad immersione in acqua 25x sopra il campione, posizionandolo correttamente. Installare un filtro di emissione corrispondente nel portafiltro del microscopio. Mediante il software, attivare il laser a infrarossi a due fotoni e regolare l'eccitazione del laser a 820 nanometri in luce trasmessa. Utilizzando la regolazione grossolana dell'obiettivo, individuare l'aorta e mettere a fuoco l'obiettivo sulla superficie endoteliale.

Passare al microscopio in modalità di scansione laser a due fotoni, assicurandosi che il laser di eccitazione sia in modalità bloccata. I rilevatori non DS vengono attivati con una potenza laser compresa tra il cinque e il dieci percento. Iniziare la scansione in tempo reale.

E infine, regolare l'obiettivo per mettere a fuoco le cellule endoteliali o muscolari lisce. Acquisire immagini sequenziali in base al protocollo sperimentale indicato nel testo. Salvare le immagini in un formato che includa i metadati necessari per eseguire l'elaborazione delle immagini e il calcolo; scaricare e installare il pacchetto di elaborazione delle immagini Fiji, rilasciato sotto licenza pubblica generale.

Utilizzando il software, aprire un file di immagine. Successivamente, quando richiesto, separare i canali di luce trasmessa e fluorescente, utilizzando solo i canali fluorescenti per l'analisi dei dati all'interno del programma Fiji. Fare clic sulla scheda analizza e scorrere verso il basso fino all'opzione strumenti.

Quindi fare clic sulla scheda Gestore ROI e verrà visualizzata una nuova finestra. Successivamente, nella scheda Analizza, fare clic su Imposta misure e selezionare le misure specifiche di interesse. Per le misurazioni dei transitori di calcio.

Utilizzare l'opzione del valore medio di grigio. Quindi, con lo strumento di tracciamento circolare, iniziare a delineare le regioni di interesse e, nel gestore delle ROI, fare clic su "aggiungi" per ogni ROI selezionata. Una volta tracciate tutte le cellule di interesse, nella scheda "altro" del gestore delle ROI, selezionare la misurazione multipla.

Infine, salvare direttamente le misurazioni oppure copiarle e incollarle in un foglio di calcolo ed eseguire i calcoli seguendo il protocollo descritto nel testo. Utilizzando il protocollo descritto in questo video, le cellule endoteliali dell'aorta sono facili da individuare grazie alla loro forma e al forte segnale fluorescente. Le cellule muscolari lisce saranno anch'esse visibili nello stesso campo insieme alle cellule endoteliali, consentendo una migliore comprensione di come i due tipi cellulari rispondano congiuntamente ma in modo indipendente a diversi agonisti e stimoli, dimostrando l'utilità di questo metodo.

Sono state determinate le misurazioni della risposta all'acetilcolina o a un vasodilatatore potente del calcio dipendente dall'endotelio CHA, come mostrato qui, dopo l'aggiunta di CH, un aumento della fluorescenza delle cellule endoteliali rispetto alle cellule in PSS da solo, indicando un rapido incremento del contenuto intracellulare di calcio che lentamente ritorna al valore basale. Questo protocollo è adatto anche per la rilevazione della produzione di ossido nitrico endoteliale. In questo esperimento, le cellule endoteliali aortiche sono state caricate con DAF FM D acetato.

La produzione di ENO colorante aumentava in maniera dipendente dal calcio in risposta a una stimolazione CH, e questa risposta veniva bloccata dall'inibitore della sintasi OCH endoteliale L name. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia cardiovascolare. L'uso della procedura sperimentale qui descritta, insieme a numerosi modelli animali geneticamente modificati disponibili, offre nuove prospettive per l'applicazione di FSA FAR della microscopia a due fotoni nella ricerca di base e traslazionale.

L'utilizzo di questo approccio potrebbe fornirvi una comprensione approfondita e un'analisi meccanicistica di specifiche vie di segnalazione intracellulare all'interno delle cellule dei vasi sanguigni. Dopo aver visto questo video, imparerete come applicare questa tecnica per il monitoraggio in tempo reale dei livelli di calcio e di ossido nitrico all'interno delle singole cellule di vasi sanguigni appena isolati.