Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'incapsulamento di una linea cellulare catabolica termogenica e le sue applicazioni in vitro e potenzialmente in vivo. Per iniziare questa procedura, preparare una sospensione cellulare di alginato di sodio e trasferirla in una siringa da cinque millilitri. Il passaggio successivo consiste nell'utilizzare un dispositivo di incapsulamento per produrre microsferule di alginato.

I microsferette vengono quindi ricoperte con una soluzione polionica di poli-L-lisina e il nucleo di alginato viene successivamente rimosso per formare una membrana semipermeabile attorno a una sospensione cellulare. Il passaggio finale consiste nel coltivare in co-coltura le cellule incapsulate con altre linee cellulari o nell'iniettarle nei tessuti adiposi di topi. Alla fine, l'analisi ematica immunitaria mostra un'attività lipolitica maggiore negli adipociti coltivati in co-coltura con microcapsule contenenti adipociti carenti di aldeide deidrogenasi.

Sebbene l'immunoeistochimica mostri un trapianto riuscito di cellule incapsulate nei tessuti adiposi di topi, questo metodo può fornire informazioni sulla termogenesi e sul tessuto apus. Può inoltre essere applicato ad altri modelli animali esistenti per fornire un sistema modello sperimentale a basso costo per testare subset cellulari in vivo. Per le scoperte biomediche, tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di livello due con flusso laminare.

Per iniziare, rimuovere il vecchio mezzo dal fiasco di coltura cellulare e risciacquare i preadipociti con 10 millilitri di PBS. Rimuovere il PBS e risospendere le cellule in due millilitri di tripsina 0,25% EDTA. Prelevare un'aliquote di 10 microlitri dalla sospensione cellulare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Secondo le istruzioni del produttore, aggiungere DMEM alle cellule residue per ottenere la quantità ideale di cellule e centrifugare a 480 ×g a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver determinato la quantità di cellule necessaria seguendo le indicazioni nel testo del protocollo, sospendere il pellet cellulare in un volume appropriato di una soluzione al 2% di alginato di sodio. Trasferire la soluzione di cellule in alginato di sodio in una siringa da cinque millilitri.

Rimuovere eventuali bolle d'aria nella soluzione e capovolgere la siringa per creare una bolla d'aria di un millilitro. Per prepararsi all'incapsulamento, posizionare un piccolo becher contenente 144 millilitri di una soluzione di cloruro di calcio 100 millimolare. Sotto l'ugello dell'ago del dispositivo di incapsulamento, fissare l'elettrodo all'incapsulato con la punta posizionata approssimativamente a 2,5 centimetri sopra la superficie della soluzione di cloruro di calcio.

Inserire saldamente la siringa contenente la soluzione cellulare di alginato di sodio nella pompa per siringa. Collegare il tubo di gomma all'apertura della siringa. Premere lo stantuffo finché la soluzione cellulare di alginato di sodio non entra per metà nel tubo.

Regolare la tensione a 5,4 chilovolt e impostare il diametro a 12,06 millimetri sulla pompa per siringa. Regolare la velocità a tre millilitri all'ora. Avviare la pompa, accendere l'incapsulamento e mantenere la tensione a 5,4 chilovolt.

Chiudere il vetro della cappa ed evitare qualsiasi vibrazione non necessaria fino al completamento della formazione dei microgranuli di alginato. Dopo che tutta la soluzione è passata attraverso l'ago, indurire i microgranuli sferici di alginato nella soluzione di cloruro di calcio per ulteriori 20 minuti prima del rivestimento con polilisina policationica o PLL. Una volta che i microgranuli sferici di alginato sodico contenenti cellule si sono solidificati, rimuovere il becher contenente i microgranuli dal dispositivo di incapsulamento.

Trasferire le microsfere in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Rimuovere la soluzione di cloruro di calcio dal pellet di microsfere. Lavare le microsfere aggiungendo 30 millilitri di una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e agitando delicatamente il tubo a mano.

Lasciare sedimentare le microperle per gravità. Quindi utilizzare una pipetta da 25 millilitri per rimuovere la soluzione di cloruro di sodio in questo modo. Lavare le microperle un totale di tre volte.

Successivamente, aggiungere la soluzione di PLL 0,05% ai microsferini. Utilizzare 10 millilitri di soluzione di PLL per ogni millilitro di soluzione di alginato di sodio. Eseguire il vortex a 1000 rotazioni al minuto per 10 minuti, condizione generalmente sufficiente per il rivestimento con PLL.

Dopo aver confermato la formazione del rivestimento di PLL, rimuovere la soluzione di PLL e lavare le capsule tre volte con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, come mostrato in precedenza, per rimuovere prima il nucleo alternativo dai microsferette rivestite con PLL. Aggiungere 30 millilitri di una soluzione di citrato di sodio 50 millimolare al tubo da 50 millilitri. Attendere cinque minuti o fino a quando tutto l'alginato di sodio si sarà disciolto. Lavare le capsule tre volte con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% come indicato in precedenza.

Dopo il terzo lavaggio, trasferire 20 millilitri di mezzo di coltura nel tubo e trasferire tutte le capsule contenenti le cellule in una fiala da coltura cellulare; coltivare le cellule encapsulate in condizioni standard di coltura cellulare. Le cellule ospiti per questa procedura devono essere coltivate in piastre a 24 pozzetti fino a confluenza. Utilizzare il mezzo di coltura per fibroblasti preparato come descritto nel protocollo allegato.

Testo per la coltura di preadipociti. Trasferire le microcapsule nella piastra a 24 pozzetti contenente cellule ospiti confluenti; aggiungere le microcapsule per ottenere un monocstrato in ogni pozzetto; indurre la differenziazione dei preadipociti con il mezzo di differenziazione. Incubare per 48 ore.

Dopo 48 ore, sostituire il mezzo con differentiation.Medium. Two e rimpiazzare il mezzo con fresh differentiation.Medium.Two ogni 48 ore. Le proteine provenienti dalle cellule verranno analizzate mediante western blot ogni 48 ore.

Ogni fase della produzione delle microsfere può essere osservata al microscopio. Una microsfera di alginato è mostrata a un ingrandimento di 20x. Prima del rivestimento con PLL, dopo la codifica con PLL e dopo la dissoluzione del nucleo di ginnet, in uno studio quantitativo l'espressione della lipasi trigliceridica del tessuto adiposo o A TGL è stata confrontata tra tre adipociti T3L1 coltivati in co-coltura con microcapsule acellulari di tipo selvaggio o contenenti adipociti deficienti di aldeide deidrogenasi 1A1.

L'espressione più elevata di A TGL negli adipociti coltivati in co-cultura con un L DH uno A uno deficitario in microcapsule contenenti adipociti indica un'attività lipolitica più alta. In uno studio in vivo, cellule encapsulate etichettate con GFP sono state iniettate nel deposito di grasso intra-addominale di topi. Ottanta giorni dopo, il cuscinetto di grasso iniettato mostrava ammassi discolorati di cellule encapsulate.

Una sezione inclusa in paraffina del deposito di grasso intraaddominale, colorata con ematossilina ed eosina, mostra ammassi di microcapsule impiantate contenenti cellule e adipociti dell'ospite. La stessa sezione analizzata in luce fluorescente mostra cellule trapiantate marcate con GFP all'interno di microcapsule rotonde integre. L'espressione di GFP è inoltre un indicatore della vitalità cellulare dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica di incapsulamento ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie metaboliche per esplorare possibili trattamenti per l'obesità, la resistenza all'insulina nel diabete di tipo due, l'infiammazione, il cancro e gli organismi modello.