Name: Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Impara l'incapsulamento di cellule cataboliche termogeniche per la ricerca sul metabolismo e l'obesità. Questo metodo utilizza microsfere di alginato per studiare la dissipazione energetica in vivo nei tessuti adiposi.

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Vorremmo ringraziare Jennifer Petrosino e David Disilvestro aiuto editoriale. Questa ricerca è stata sostenuta dal Premio numero 20020728 del consiglio Egg americano e Premio numero 10040042 da Novo Nordisk Farmaceutici, nonché dalla Food Innovation Center, Ufficio per gli Affari Internazionali, Center for Advanced Functional Foods ricerca, e l&#39;imprenditoria a OSU, nonché la National Science Foundation concessione CEE-0914790 (LJL). Il progetto descritto è stato sostenuto dal Premio Numero R21OD017244 (OZ) e UL1RR025755 (OSUCCC) dal Centro Nazionale per la Ricerca Risorse, finanziato dall&#39;Ufficio del Direttore, National Institutes of Health (OD) e sostenuto dal NIH tabella di marcia per la ricerca medica e NSC P30CA16058. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del Centro nazionale per le risorse di ricerca o il National Institutes of Health.

Il protocollo di studio è stato approvato da The Ohio State University comitati etici. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal protocollo IACUC. Tutte le procedure sono state eseguite sotto l&#39;armadio di livello 2 di biosicurezza con flusso laminare. Abbiamo seguito tutti i requisiti e le procedure di sicurezza standard. La tecnica di microincapsulazione per la preparazione di microcapsule è stata eseguita come descritto 17, 18. 1. Preparativi di materiali <ol><li> Preparare 10 ml di 2% di soluzione di alginato di sodio in soluzione salina fisiologica autoclavato (0,9% NaCl in acqua). Preparare 0,05% soluzione PLL in salina fisiologica. Preparare queste soluzioni il giorno prima e mescolare durante la notte. Filtrare le soluzioni con 0,22 micron filtro prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare citrato di sodio 50 mM e 100 mM CaCl 2 0.9% soluzioni di NaCl e sterilizzare in autoclave. </li><li> Autoclavare tutti soluzioni, aghi, elettrodi, e bicchieri. Pulire accuratamente aghi puliti con fili per evitare intasamenti. </li><li> Determinare la quantità appropriata di cellule da utilizzare per le capsule (102 microcapsule sono necessari per ogni cm 2 di pozzo e ci sono circa 500 cellule per capsula 18). Usare 1 ml di alginato di sodio per due milioni di cellule. </li><li> Preparare una &#39;crescita dei fibroblasti Medium&#39; di siero di vitello contenente il 10%, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina in un alto livello di glucosio (4.500 mg / l di glucosio) a medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM). <ol><li> Preparare una &#39;Differenziazione medio I&#39; contenente 10% di siero fetale bovino, 10 ug / ml di insulina, 1 mM dexametasone, 0,5 mM xantina 3-isobutil-1-metil, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina DMEM. </li><li> Preparare contenente siero un &#39;Differenziazione medio II&#39; 10% fetale bovino, 10 ug / ml di insulina, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina DMEM. </li></ol></li><li> Preparare buffer di lisi contenente tablet inibitore della proteasi uno per 10 ml di Radio-Immunoprecipitazione tampone (RITampone PA). </li></ol> 2. alginato Microbeads Preparazione (Figura 1A) <ol><li> Rimuovere il vecchio mezzo da pallone di coltura cellulare. Lavare le cellule con 10 ml di PBS. Portare le cellule in sospensione con 0,25% tripsina-EDTA (2 ml per un pallone T175 confluenti). </li><li> Contare le cellule in sospensione di cellule utilizzando un emocitometro. Utilizzare 10 ml un&#39;aliquota dalla sospensione cellulare e contare le cellule secondo le istruzioni del produttore. Centrifugare le restanti cellule in terreno centrifugazione a 480 xg a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Sospendere il pellet cellulare in alginato di sodio, come descritto al punto 1.4. Trasferire la soluzione di sodio alginato-cella a una siringa da 5 ml. </li><li> Rimuovere le bolle d&#39;aria nella soluzione, aggiungere un ago 23-gauge e capovolgere la siringa per creare una tasca 1 ml di aria. </li><li> Mettere un piccolo bicchiere (180 ml) contenente 144 ml di CaCl mM soluzione 100 2 sotto il beccuccio ago della encapsulator. Collegare l&#39;elettrodo al encapsulator con la punta approximdiatamente 2,5 centimetri sopra la superficie della soluzione di CaCl 2 100 mM. </li><li> Inserire saldamente la siringa contenente la soluzione di alginato di sodio-cellule nella pompa a siringa. Attaccare il tubo di gomma per l&#39;apertura della siringa. Spingere lo stantuffo fino a quando la soluzione di alginato di sodio a cellule entra a metà del tubo. Regolare la tensione di 5,4 kV. Impostare il diametro 12,06 millimetri sulla pompa a siringa. Regolare la velocità di 3 ml / h. Avviare la pompa. Accendere encapsulator e mantenere la tensione a 5,4 kV. </li><li> Chiudere la finestra della cappa ed evitare inutili vibrazioni fino alla fine della formazione delle microsfere di alginato. Dopo tutta la soluzione passa attraverso l&#39;ago, solidificare microsfere sferiche alginato nella soluzione di CaCl 2 100 mM per ulteriori 20 minuti prima del rivestimento con PLL. </li></ol> 3. Microbeads rivestimento con PLL (Figura 1B) <ol><li> Rimuovere il bicchiere contenente le microsfere a forma di palla di sodio alginato-cellula e trasferire questi microbeads in una provetta da centrifuga da 50 ml. Rimuovere CaCl soluzione 2 dal pellet microperla. </li><li> Lavare le microsfere a forma di palla alginato di cellule aggiungendo 30 ml di NaCl allo 0,9%. Agitare il tubo a mano delicatamente. Rimuovere 0,9% NaCl con 25 ml pipetta dopo le microsfere sono precipitati per gravità. Ripetere altre due volte per un totale di 3 lavaggi. </li><li> Utilizzare 10 ml di soluzione PLL 0,05% per ogni 1 ml di soluzione di alginato di sodio. Aggiungere il PLL 0,05% e agitare a 1000 giri al minuto per 10 min. Nota: Di solito, 10 min è sufficiente per il rivestimento PLL. </li><li> Dopo si forma PLL cappotto, rimuovere la soluzione PLL e lavare le capsule 3 volte come descritto al punto 3.2. </li></ol> 4. Rimozione di alginato core (Figura 1C) <ol><li> Aggiungere 30 ml di 50 mM soluzione di citrato di sodio. Attendere 5 minuti o fino a quando tutta l&#39;alginato di sodio è disciolto. Lavare capsule tre volte come descritto al punto 3.1.1. </li><li> Rimuovere il 0,9% NaCl, aggiungere 20 ml di mezzo di coltura al tubo 50 mle trasferire tutte le capsule contenenti le cellule in un pallone di coltura cellulare. Maneggiare cellule incapsulate in condizioni standard di coltura cellulare 18. </li></ol> 5. Le domande vitro per lo studio xenotrapianto e Host cellulari interazioni o Cinetica di Metabolita Afflusso / Efflux tra cellule (Figura 2) <ol><li> Cellule ospiti Cultura il 24 pozzetti fino confluenti per co-culture. Utilizzare il &#39;fibroblasti crescita medio&#39; per preadipocytes coltura. </li><li> Trasferire microcapsule in 24 piastra contenente cellule ospiti confluenti bene. Aggiungere microcapsule per ottenere un monostrato (102 microcapsule / cm 2 di pozzo). </li><li> Indurre la differenziazione pre-adipociti con Differenziazione Media I. Ogni 48 ore, cambio media differenziazione Media II per sei giorni. Lisare le cellule in tampone RIPA. Utilizzare 50 proteine ​​g per condizione di analizzare l&#39;espressione proteica con Western Blot. </li></ol> 6. In Vivo Domanda di Trattento di obesità (figura 3) <ol><li> Mescolare 4% isoflurano con l&#39;ossigeno per l&#39;induzione di anestesia e 2% isoflurano con ossigeno per il mantenimento dell&#39;anestesia. Confermare adeguata profondità dell&#39;anestesia per pizzico piedi. <ol><li> Applicare una pomata anti-prurito sugli occhi per proteggere le cornee si secchi. </li></ol></li><li> Utilizzare cellule incapsulate che sono etichettati in modo permanente con proteina fluorescente artificiale, come la proteina fluorescente verde (GFP). </li><li> Utilizzare una siringa da 3 ml e un ago calibro 20 per iniettare cellule incapsulate. <ol><li> Iniettare 0,5 x 10 6 cellule sospese in 0,2 ml di soluzione in ciascuno depot grasso catetere che si trova nella zona intraperitoneale tra un gonadi e reni come mostrato in figura 3. Utilizzare questo volume di PBS e il numero di cellule per topo con un peso medio di 40 g. Regolare numero di cellule e volume in topi che hanno peso diverso o per la determinazione degli effetti dose-dipendente. </li></ol></li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Vari metodi sono stati utilizzati per incapsulare cellule, comprese l&#39;essiccazione, estrusione, ed emulsione 19. In questo metodo, le perline alginato vengono estrusi attraverso un ago, poi rivestito con PLL e il nucleo alginato sarà sciolto per completare l&#39;incapsulamento. Anche se questo metodo è stato usato per anni, formazione delle perline con la dimensione desiderata e la forma sferica è ancora difficile. La dimensione delle capsule è fortemente dipendente dalla viscosità della soluzione di algi...

L&#39;aumento dell&#39;incidenza delle malattie croniche 1 ha stimolato studi sul trapianto di popolazioni di cellule terapeutiche 2. Le cellule staminali singenici o allogeniche sono i tipi di cellule più comunemente usati per queste applicazioni 2. Tuttavia, questi trattamenti non consentono il controllo della differenziazione e migrazione delle cellule staminali dopo l&#39;impianto e non sono convenienti. Il trapianto di cellule geneticamente modificate con funzioni benefiche anticipa migliorare il trattamento di molte malattie. Tuttavia, le modifiche genetiche di cellule vengono riconosciuti dal sistema immunitario dell&#39;ospite, quindi, questi trattamenti richiedono immunosoppressione 3. L&#39;incapsulamento di cellule che producono l&#39;insulina è stato sviluppato dal Dr. Chang 4. La tecnica si basa sulla incapsulamento delle cellule in goccioline alginato che vengono immerse in una soluzione di cloruro di calcio. Molecole alginato consistono di acido mannuronico (M) e guluronico (G) e possono essere collegati da Ca 2+. Dopo gelificazione, le perle sono sospese una soluzione di poli-L-lisina (PLL). Durante questa fase, PLL lega al G e M nelle molecole alginato che stabilisce membrana della capsula. La porosità della membrana della capsula può essere modulata variando le concentrazioni M e PLL, il tempo di incubazione, e la temperatura. Il legame del PLL dipende anche dal tipo e dalla concentrazione di alginato. Matrici alginato reticolato con ioni Ca 2+, sono instabili in ambiente fisiologico o in soluzioni tampone comuni con alta concentrazione di fosfato e ioni citrato. Questi buffer possono estrarre Ca 2+ dal alginato e liquefare il nucleo. Liquefazione del nucleo alginato fornisce spazio all&#39;interno delle capsule per il movimento e la crescita cellulare. Cellule incapsulate in alginato polyanionic con policationico poli-L-lisina (APL) sono impermeabili per immunoglobuline ma hanno afflusso di nutrienti e l&#39;efflusso di tossine. Queste proprietà consentono APL lungo termine survival di cellule incapsulate dopo il trapianto in host geneticamente diverse. Elliott et al. Riportato la sopravvivenza di funzionamento delle cellule pancreatiche suina incapsulati in un paziente umano nove anni dopo l&#39;impianto 5. Tecniche di incapsulamento possono essere classificati in microincapsulazione (3-800 micron) e macroincapsulazione (maggiore di 1000 micron). Le microcapsule sono più durevoli macrocapsules 6. Fin dalla sua scoperta dal Dr. Chang e colleghi nel 1964, microincapsulazione è stato ampiamente utilizzato per l&#39;incapsulamento delle cellule anabolizzanti che producono insulina, altri ormoni e molecole bioattive 7. Questi trattamenti hanno affrontato diverse sfide nel tessuto ospite tra cui la fibrosi e la risposta immunitaria 8. Inizialmente, gli effetti collaterali legati alla qualità dei biopolimeri sono stati risolti. Tuttavia, il trapianto di cellule anabolizzanti avvia ancora effetti collaterali, quali la fibrosi, come risultato di ormone overproduzione di fuori di una ghiandola specializzata. Negli ultimi decenni, l&#39;obesità e il diabete di tipo 2 ha raggiunto proporzioni epidemiche 9. Più del 30% delle persone adulte in tutto il mondo sono in sovrappeso e obesi 10. Aumento intra-addominale (IAB) la formazione di grasso aumenta l&#39;incidenza di infiammazione cronica e promuove diabete di tipo 2, le malattie cardiovascolari, alcuni tipi di cancro, e di altre patologie 11-13. Molte evidenze suggeriscono che la patogenesi associato con il grasso IAB può essere evitato dagli adipociti specifici. Recenti studi hanno dimostrato che il trapianto di adipociti sottocutanei in regione IAB può migliorare il metabolismo e ridurre l&#39;obesità e insulino-resistenza nei roditori in vivo 14. Efficace riduzione di obesità e insulino resistenza è stata associata con adipociti termogenica grado di dissipare l&#39;energia sotto forma di calore 15,16. Modifica termogenica adipociti può essere ottenuto mediante trasfezione stabiledi geni che partecipano al disaccoppiamento protonico mitocondriale, come la proteina di disaccoppiamento 1 (Ucp1) o di geni che regolano l&#39;espressione di altri geni Ucp1 e termogenica 15,16. Nostri studi recenti hanno dimostrato che la deficienza in aldeide deidrogenasi 1 a1 (Aldh1a1) porta al rimodellamento termogenico di grasso IAB che riduce l&#39;obesità e insulino-resistenza in questi topi 17,18. In particolare, l&#39;incapsulamento di termogenico Aldh1a1 carente (Aldh1a1 - / -) preadipocytes media stesso effetto terapeutico di grassi IAB in obesi topi wild-type, suggerendo nuove opportunità terapeutiche per il trattamento di IAB grasso 18. Nelle impostazioni sperimentali, le cellule incapsulate permettono ai ricercatori di studiare gli effetti di specifiche popolazioni cellulari in modo economicamente vantaggioso 19. Qui si discute il metodo di incapsulamento di una linea cellulare catabolico termogenica e il suo laboratorio e applicazione terapeutica in un modello murino di obesità. Il protocollo descrive three fasi per la produzione di microcapsule (Figura 1): la formazione delle microsfere di alginato (Figura 1A), la formazione del policationico poli-L-lisina (PLL) membrane sulla superficie di microsfere (Figura 1B), e la rimozione del nuclei di alginato (Figura 1C).

<table><tbody><tr><td>Dispositivo di incapsulamento (VAR V1)</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Pompa a siringa KD scientific</td><td>KD scientific</td><td>780100Y</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus&nbsp;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Alginato di sodio</td><td>Sigma</td><td>MKBP8122V</td><td>Nessuno Bromuro</td></tr><tr><td>di poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>020M5006V</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>SLBJ2662V</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Citrato di sodio tribasico diidrato</td><td>Sigma</td><td>030M0200</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>SLBD2595V</td><td>Nessuno Gel</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Anticorpo primario ATGL (da coniglio)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2138S</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario (anti coniglio)</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Tampone per test di radioimmunoprecipitazione (RIPA)</td><td>Boston BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Tamponato con fosfato soluzione salina (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Cortizone 10 unguento anti-prurito</td><td>Cortizone 10</td><td>C4029138</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Siero neonato di vitello (CS)</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Insulina (bovina)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Nessuno</td></tr><tr><td>Compresse da cocktail con inibitore della proteasi</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Nessuno</td></tr></tbody></table>

incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo depositi tessuti

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Incapsulamento delle cellule è stato sviluppato per intrappolare cellule vitali all&#39;interno delle membrane semi-permeabili. Le cellule incapsulate trapiantate possono scambiare metaboliti a basso peso molecolare in tessuti dell&#39;ospite trattato per conseguire sopravvivenza a lungo termine. La membrana semipermeabile permette innestato cellule incapsulate per evitare il rigetto da parte del sistema immunitario. La procedura di incapsulamento è stato progettato per consentire un rilascio controllato di composti bioattivi, come l&#39;insulina, altri ormoni e citochine. Qui si descrive un metodo per l&#39;incapsulamento di cellule catabolici, che consumano lipidi per la produzione di calore e la dissipazione di energia (termogenesi) nel tessuto adiposo intra-addominale di topi obesi. L&#39;incapsulamento di cellule catabolici termogenica potrebbe essere potenzialmente applicabili alla prevenzione e il trattamento dell&#39;obesità e il diabete di tipo 2. Un&#39;altra potenziale applicazione di cellule catabolici può includere la disintossicazione da alcool o altri metaboliti tossici e inquinanti ambientali.

La Figura 1 mostra che ogni fase della produzione microsfere può essere controllato al microscopio. La Figura 2A mostra come co-coltura adipociti con un monostrato di cellule incapsulate. Figura 2B è un esempio rappresentativo di uno studio quantitativa utilizzando adipociti / microcapsule co-culture sono stati descritti nella sezione 5. Lisati degli adipociti sono stati analizzati usando Western Blot. Cellule incapsulate non sono state analizzate in questo esperimento....

Qui, presentiamo un protocollo per l'incapsulamento di cellule cataboliche, che consumano lipidi per la produzione di calore nel tessuto adiposo intra-addominale e aumentano la dissipazione di energia nei topi obesi.

Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'incapsulamento di una linea cellulare catabolica termogenica e le sue applicazioni in vitro e potenzialmente in vivo. Per iniziare questa procedura, preparare una sospensione cellulare di alginato di sodio e trasferirla in una siringa da cinque millilitri. Il passaggio successivo consiste nell'utilizzare un dispositivo di incapsulamento per produrre microsferule di alginato.I microsferette vengono quindi ricoperte con una soluzione polionica di poli-L-lisina e il nucleo di alginato viene successivamente rimosso per formare una membrana semipermeabile attorno a una sospensione cellulare. Il passaggio finale consiste nel coltivare in co-coltura le cellule incapsulate con altre linee cellulari o nell'iniettarle nei tessuti adiposi di topi. Alla fine, l'analisi ematica immunitaria mostra un'attività lipolitica maggiore negli adipociti coltivati in co-coltura con microcapsule contenenti adipociti carenti di aldeide deidrogenasi.Sebbene l'immunoeistochimica mostri un trapianto riuscito di cellule incapsulate nei tessuti adiposi di topi, questo metodo può fornire informazioni sulla termogenesi e sul tessuto apus. Può inoltre essere applicato ad altri modelli animali esistenti per fornire un sistema modello sperimentale a basso costo per testare subset cellulari in vivo. Per le scoperte biomediche, tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di livello due con flusso laminare.Per iniziare, rimuovere il vecchio mezzo dal fiasco di coltura cellulare e risciacquare i preadipociti con 10 millilitri di PBS. Rimuovere il PBS e risospendere le cellule in due millilitri di tripsina 0,25% EDTA. Prelevare un'aliquote di 10 microlitri dalla sospensione cellulare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.Secondo le istruzioni del produttore, aggiungere DMEM alle cellule residue per ottenere la quantità ideale di cellule e centrifugare a 480 ×g a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver determinato la quantità di cellule necessaria seguendo le indicazioni nel testo del protocollo, sospendere il pellet cellulare in un volume appropriato di una soluzione al 2% di alginato di sodio. Trasferire la soluzione di cellule in alginato di sodio in una siringa da cinque millilitri.Rimuovere eventuali bolle d'aria nella soluzione e capovolgere la siringa per creare una bolla d'aria di un millilitro. Per prepararsi all'incapsulamento, posizionare un piccolo becher contenente 144 millilitri di una soluzione di cloruro di calcio 100 millimolare. Sotto l'ugello dell'ago del dispositivo di incapsulamento, fissare l'elettrodo all'incapsulato con la punta posizionata approssimativamente a 2,5 centimetri sopra la superficie della soluzione di cloruro di calcio.Inserire saldamente la siringa contenente la soluzione cellulare di alginato di sodio nella pompa per siringa. Collegare il tubo di gomma all'apertura della siringa. Premere lo stantuffo finché la soluzione cellulare di alginato di sodio non entra per metà nel tubo.Regolare la tensione a 5,4 chilovolt e impostare il diametro a 12,06 millimetri sulla pompa per siringa. Regolare la velocità a tre millilitri all'ora. Avviare la pompa, accendere l'incapsulamento e mantenere la tensione a 5,4 chilovolt.Chiudere il vetro della cappa ed evitare qualsiasi vibrazione non necessaria fino al completamento della formazione dei microgranuli di alginato. Dopo che tutta la soluzione è passata attraverso l'ago, indurire i microgranuli sferici di alginato nella soluzione di cloruro di calcio per ulteriori 20 minuti prima del rivestimento con polilisina policationica o PLL. Una volta che i microgranuli sferici di alginato sodico contenenti cellule si sono solidificati, rimuovere il becher contenente i microgranuli dal dispositivo di incapsulamento.Trasferire le microsfere in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Rimuovere la soluzione di cloruro di calcio dal pellet di microsfere. Lavare le microsfere aggiungendo 30 millilitri di una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e agitando delicatamente il tubo a mano.Lasciare sedimentare le microperle per gravità. Quindi utilizzare una pipetta da 25 millilitri per rimuovere la soluzione di cloruro di sodio in questo modo. Lavare le microperle un totale di tre volte.Successivamente, aggiungere la soluzione di PLL 0,05% ai microsferini. Utilizzare 10 millilitri di soluzione di PLL per ogni millilitro di soluzione di alginato di sodio. Eseguire il vortex a 1000 rotazioni al minuto per 10 minuti, condizione generalmente sufficiente per il rivestimento con PLL.Dopo aver confermato la formazione del rivestimento di PLL, rimuovere la soluzione di PLL e lavare le capsule tre volte con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, come mostrato in precedenza, per rimuovere prima il nucleo alternativo dai microsferette rivestite con PLL. Aggiungere 30 millilitri di una soluzione di citrato di sodio 50 millimolare al tubo da 50 millilitri. Attendere cinque minuti o fino a quando tutto l'alginato di sodio si sarà disciolto. Lavare le capsule tre volte con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% come indicato in precedenza.Dopo il terzo lavaggio, trasferire 20 millilitri di mezzo di coltura nel tubo e trasferire tutte le capsule contenenti le cellule in una fiala da coltura cellulare; coltivare le cellule encapsulate in condizioni standard di coltura cellulare. Le cellule ospiti per questa procedura devono essere coltivate in piastre a 24 pozzetti fino a confluenza. Utilizzare il mezzo di coltura per fibroblasti preparato come descritto nel protocollo allegato.Testo per la coltura di preadipociti. Trasferire le microcapsule nella piastra a 24 pozzetti contenente cellule ospiti confluenti; aggiungere le microcapsule per ottenere un monocstrato in ogni pozzetto; indurre la differenziazione dei preadipociti con il mezzo di differenziazione. Incubare per 48 ore.Dopo 48 ore, sostituire il mezzo con differentiation.Medium. Two e rimpiazzare il mezzo con fresh differentiation.Medium.Two ogni 48 ore. Le proteine provenienti dalle cellule verranno analizzate mediante western blot ogni 48 ore.Ogni fase della produzione delle microsfere può essere osservata al microscopio. Una microsfera di alginato è mostrata a un ingrandimento di 20x. Prima del rivestimento con PLL, dopo la codifica con PLL e dopo la dissoluzione del nucleo di ginnet, in uno studio quantitativo l'espressione della lipasi trigliceridica del tessuto adiposo o A TGL è stata confrontata tra tre adipociti T3L1 coltivati in co-coltura con microcapsule acellulari di tipo selvaggio o contenenti adipociti deficienti di aldeide deidrogenasi 1A1.L'espressione più elevata di A TGL negli adipociti coltivati in co-cultura con un L DH uno A uno deficitario in microcapsule contenenti adipociti indica un'attività lipolitica più alta. In uno studio in vivo, cellule encapsulate etichettate con GFP sono state iniettate nel deposito di grasso intra-addominale di topi. Ottanta giorni dopo, il cuscinetto di grasso iniettato mostrava ammassi discolorati di cellule encapsulate.Una sezione inclusa in paraffina del deposito di grasso intraaddominale, colorata con ematossilina ed eosina, mostra ammassi di microcapsule impiantate contenenti cellule e adipociti dell'ospite. La stessa sezione analizzata in luce fluorescente mostra cellule trapiantate marcate con GFP all'interno di microcapsule rotonde integre. L'espressione di GFP è inoltre un indicatore della vitalità cellulare dopo il suo sviluppo.Questa tecnica di incapsulamento ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie metaboliche per esplorare possibili trattamenti per l'obesità, la resistenza all'insulina nel diabete di tipo due, l'infiammazione, il cancro e gli organismi modello.

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Primarie preadipociti bianchi isolati dal tessuto adiposo bianco nei topi possono essere differenziate in cellule del beige / brite. Presentato qui è un sistema affidabile modello cellulare per studiare la regolazione molecolare della "doratura" di grasso bianco.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

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Qui, presentiamo micro-frammentazione senza enzimi adiposi umani utilizzando un dispositivo di sistema chiuso. Questo nuovo metodo consente l'ottenimento di ammassi sub-millimetrici di tessuto adiposo adatto per il trapianto in vivo, la coltura in vitro e l'ulteriore isolamento e caratterizzazione delle cellule.

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Questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è adatto per il rilevamento di isole innestate nella cavità intraperitoneale. In particolare, non richiede l'uso di agenti bioleganti o sutura.

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Impara l'incapsulamento di cellule cataboliche termogeniche per la ricerca sul metabolismo e l'obesità. Questo metodo utilizza microsfere di alginato per studiare la dissipazione energetica in vivo nei tessuti adiposi.

Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

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