Su ordine Microdialisi Probe design
21 luglio 2015
Microdialisi è una tecnica comunemente usata nella ricerca delle neuroscienze. Pertanto sonde commerciali sono in gran demand.In questo lavoro un gruppo sonda è spiegato in dettaglio per costruire una concentrica, sonda di microdialisi affidabile, su misura per meno di $ 10.
L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere la realizzazione di una sonda personalizzata per microdialisi. Questo viene ottenuto innanzitutto tagliando un tubo di politetrafluoroetilene e della silice fusa nelle dimensioni corrette. Il secondo passaggio consiste nell'inserire la silice fusa all'interno del tubo utilizzando una cannula come guida.
Successivamente, una membrana dialitica viene posizionata sopra la silice fusa. L'ultimo passaggio consiste nell'infilare il manicotto metallico sulla parte rimanente della silice fusa e nell'utilizzare una resina epossidica per sigillare le giunzioni e garantire una lunghezza di scambio di due millimetri. In definitiva, le istruzioni presentate in questo video mostreranno come costruire una sonda personalizzata per microdialisi robusta e affidabile, come alternativa a una sonda commerciale, in grado di misurare con precisione il recupero in vitro di neuropeptidi e molecole di piccole dimensioni.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'assemblaggio della sonda per microdialisi descritto in dettaglio può essere adattato a qualsiasi applicazione e può essere realizzato per meno di 10. Per iniziare, tagliare un pezzo di tubo in politetrafluoroetilene dello spessore di 1,6 millimetri e con un diametro interno di 350 micron in sezioni lunghe 2,5 centimetri. Tagliare un'estremità della sezione con un angolo di 45 gradi per facilitare il collegamento del tubo di uscita.
Successivamente, utilizzare della carta vetrata per rendere ruvida la superficie esterna del tubo in PTFE al fine di favorire l'adesione di una colla epossidica. Tagliare un tratto di silice fusa in un pezzo lungo 2,25 centimetri. Inserire un ago da 30 gauge nella fibra cava in PTFE a un centimetro dall'estremità piatta.
Piegare il PTFE e forare la guaina nel punto di piegatura. Inserire la silice fusa nel tubo in PTFE utilizzando l'ago come guida. Rimuovere quindi delicatamente l'ago e posizionare la silice fusa in modo che sporga di cinque millimetri dall'estremità piana del tubo in PTFE.
Usare una goccia di colla a base di cianoacrilato per fissare la silice fusa nel punto di perforazione e lasciarla indurire tutta la notte. Preparare la colla epossidica aggiungendo 30 parti di indurente giallo a 70 parti di colla epossidica nera e mescolando delicatamente. Successivamente, tirare una membrana di dialisi in polisulfone con un cutoff di 30 kilodalton, un diametro interno di 210 micrometri e un diametro esterno di 245 micrometri.
Posizionare con attenzione sulla silice fusa. Inserire la membrana nel tubo in PTFE e regolare la membrana a 5,5 millimetri utilizzando un bisturi affilato. Segnare un punto sulla membrana con una penna sottile per definire la lunghezza di scambio di due millimetri a partire dall'estremità della membrana.
Quindi, utilizzare un ago sottile per applicare una piccola quantità di colla epossidica sulla punta della membrana. Successivamente, usare la colla epossidica per sigillare il giunto tra la membrana dialitica e la fibra in PTFE. Tornare indietro e aggiungere una quantità sufficiente di colla epossidica sulla membrana fino al punto di riferimento.
Per garantire una lunghezza di scambio diffusivo di soli due millimetri, lasciare indurire la colla epossidica durante la notte. Utilizzare una pinza per staccare con attenzione pezzi di un centimetro da un ago da 25 gauge al fine di creare maniche metallici. Quindi infilare il manicotto metallico sulla parte rimanente della silice fusa e utilizzare la colla epossidica rimanente per sigillare il giunto tra il manicotto metallico e il tubo in PTFE.
La guaina metallica consente in seguito il collegamento del tubo di ingresso con una sonda per microdialisi. Infine, applicare una colla a caldo intorno alla biforcazione della sonda per una fissazione e stabilizzazione aggiuntiva del dispositivo. Questo schema mostra un dettaglio del funzionamento interno della sonda per microdialisi.
Due millimetri della membrana dialitica in polisolfone sono esposti all'estremità della sonda, consentendo il recupero di metaboliti a basso peso molecolare come glucosio e ATP, e acetilcolina. Qui viene mostrata la capacità della sonda di recuperare in vitro piccole molecole a basso peso molecolare come glucosio, lattato, acetilcolina e ATP. La percentuale di recupero è molto più elevata per queste molecole, che hanno un peso intorno ai 500 Dalton, rispetto a molecole più grandi come l'angiotensina II, la sostanza P e la somatostatina, che superano i 1000 Dalton.
Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire sonde per microdialisi resistenti e affidabili come alternativa a quelle commerciali.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto il processo di fabbricazione di una sonda personalizzata per microdialisi, un'alternativa economicamente vantaggiosa rispetto alle sonde commerciali. La procedura illustra i passaggi necessari per realizzare una sonda affidabile in grado di misurare neuropeptidi e piccole molecole in vitro.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Tecniche di microdialisi
- Produzione di sonde
Sfondo
- La microdialisi è ampiamente utilizzata nella ricerca in neuroscienze.
- Esiste una forte domanda di sonde per microdialisi affidabili.
- Le sonde realizzate su misura possono essere più economiche rispetto alle opzioni commerciali.
- Comprendere la costruzione di queste sonde può potenziare le capacità di ricerca.
Scopo dello studio
- Fornire istruzioni dettagliate per la costruzione di una sonda personalizzata per microdialisi.
- Offrire un'alternativa economica alle sonde commerciali.
- Garantire misurazioni accurate di neuropeptidi e molecole piccole.
Metodi Utilizzati
- Taglio di tubi in politetrafluoroetilene e silice fusa a dimensioni specifiche.
- Inserimento della silice fusa nel tubo mediante cannula per guidare l'operazione.
- Posizionamento di una membrana di dialisi sopra la silice fusa.
- Fissaggio dell'insieme con un manicotto metallico e resina epossidica per garantire durata.
Risultati principali
- È possibile costruire una sonda per microdialisi su misura affidabile e robusta.
- La sonda è in grado di misurare con precisione il recupero in vitro di neuropeptidi.
- Il costo totale dell'assemblaggio della sonda è inferiore a 10 dollari.
Conclusioni
- I microsondi personalizzati rappresentano un'alternativa praticabile alle opzioni commerciali.
- Istruzioni dettagliate possono consentire ai ricercatori di costruire autonomamente i propri sonde.
- Questo metodo può migliorare l'accessibilità delle tecniche di microdialisi nella ricerca neuroscientifica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La fabbricazione personalizzata di sonde per microdialisi offre una soluzione economicamente vantaggiosa per la ricerca in neuroscienze, consentendo un monitoraggio preciso della dinamica neurochimica nel liquido cerebrospinale. Riducendo il costo delle sonde a meno di 10 $, questo metodo ne migliora l'accessibilità per le istituzioni pubbliche e favorisce un impiego su larga scala negli studi preclinici. L'approccio facilita la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico fornendo dati affidabili sul recupero di piccole molecole e neuropeptidi, informando le decisioni di avanzamento o interruzione nei primi stadi dei processi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso il recupero quantitativo di glucosio, lattato, acetilcolina, ATP e neuropeptidi nell'intervallo di massa 100-1.600 Da.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo metriche di recupero in vitro riproducibili (circa il 20% per le piccole molecole, 2-6% per i neuropeptidi) per chiarire l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso.
- Valore predittivo: Genera informazioni meccanicistiche che migliorano la selezione del portafoglio distinguendo gli effetti dei composti in base al peso molecolare e alle proprietà fisico-chimiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, stabilendo una membrana dialitica con un cut-off molecolare definito (30 kDa) e una lunghezza di scambio (2 mm).
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso dimensioni costanti delle sonde e prestazioni uniformi della membrana tra diverse classi di sostanze.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma e l'adattamento a lunghezze di scambio maggiori per diversi modelli animali, supportando la prontezza per schermature ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le misurazioni neurochimiche nella fase di scoperta alla validazione preclinica monitorando sostanze rilevanti per la patologia della malattia.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Guida le decisioni precliniche di prosecuzione o interruzione dello sviluppo attraverso dati quantitativi di recupero che riflettono la permeabilità della barriera ematoencefalica e l'accessibilità del bersaglio.
- Allineamento dei Biomarcatori: Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali consentendo il rilevamento di neuropeptidi e metaboliti nel fluido extracellulare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti, fornendo letture neurochimiche quantitative che supportano la comprensione meccanicistica e la selezione dei composti.
- Biologia della scoperta Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici mediante la misurazione del recupero in vitro di neurotrasmettitori e metaboliti endogeni.
- Screening: Fornisce sistemi pronti all'uso per saggi con output riproducibili per la valutazione degli effetti dei composti sul flusso neurochimico.
- Analitica: Fornisce misurazioni quantitative della variabile dipendente (percentuali di recupero) che consentono il confronto tra diverse condizioni e l'analisi delle relazioni struttura-attività.
- Ricerca traslazionale Collega la scoperta al lavoro preclinico generando dati pertinenti all'interazione con il bersaglio in sistemi rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per il monitoraggio neurochimico che può essere adattata tra progetti e sistemi modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica tramite la misurazione neurochimica diretta.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità grazie all'assemblaggio di sonde economiche e personalizzabili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione e l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi biologici nella fase di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio attraverso dati di recupero affidabili che informano i criteri di avanzamento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nei principi della microdialisi, nella manipolazione delle membrane e nelle tecniche di incollaggio adesivo.
- Necessita di strumentazione per il taglio di precisione (bisturi, pinze), la preparazione delle superfici (carta vetrata) e la polimerizzazione (resina epossidica notturna o colla a caldo).
- Richiede una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per quanto riguarda le dimensioni delle sonde, la lunghezza di scambio e la preparazione delle membrane, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento relative a diversi cutoff di peso molecolare, materiali della membrana e lunghezze di scambio nei vari sistemi modello.
- Comprende limitazioni pratiche come il tempo necessario per il montaggio manuale, la riproducibilità dipendente dall'abilità dell'operatore e la necessità di una validazione in vitro per ogni lotto.
