Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione Plasmodium falciparum

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il ruolo dei microRNA eritrocitari nella regolazione genica post-trascrizionale dei trascritti di plasmodium falciparum. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della malaria, come ad esempio il modo in cui gli eventi di splicing dell'RNA con piccoli RNA dell'ospite o del parassita possono influenzare il potenziale traduzionale degli mRNA di fusione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di catturare RNA totali e piccoli insieme in un unico pool, dimostrando la presenza di piccoli RNA e RNA di fusione in una cellula.

Inoltre, questa procedura utilizza la profilazione dei polisomi per mostrare come questi piccoli RNA influenzano la traduzione dei loro prodotti di mRNA di fusione. Per iniziare, impostare la trasfezione con centif 300 microlitri di globuli rossi in mezzo completo per la malaria a 800 volte G per cinque minuti. Lavare due volte gli eritrociti con il terreno RPMI, risospendere le cellule in una miscela citogenica completa al 50% di ematocrito.

Successivamente, trasferire le cellule in un veterinario di elettroporazione e aggiungere 10 microgrammi di micro RNA coniugato con biotina DYS th o un micro RNA di controllo negativo non coniugato. Per elettroporare le cellule, posizionare il veterinario in un elettroporo ed erogare un singolo impulso. Quindi piastrano le cellule e infettatele con plasmodium falciparum dopo quattro ore, come descritto nel protocollo di testo.

Quindi aggiungere 50 microlitri di avid e perline confezionati e spogliati a 10 microgrammi di RNA parassita in una provetta microcentrale e incubare la provetta con rotazione per un'ora a quattro gradi Celsius. Centrifugare la striscia di davan e le perle a 800 volte G per 30 secondi, quindi lavare il pellet con 500 microlitri di tampone RNP contenente una diluizione da uno a 1000 di inibitore dell'RNA. Successivamente eluire l'RNA dalle perle di Resus, sospendendole in 200 microlitri di RNA.

Tampone di eluizione di cattura contenente biotina in eccesso. Incubare le perle per una notte a quattro gradi Celsius con rotazione. Quindi centrifugare le perle a 800 volte G per 30 secondi e raccogliere l'RNA surnatante.

È fondamentale eluire con un eccesso di biotina e utilizzare la quantità minima di streptococco e perline per garantire una corretta eluizione specifica. Ciò riduce l'arricchimento dell'RNA di fondo. Infine, determinare il grado di arricchimento dei trascritti di P falciparum e l'arricchimento del micro RNA mediante R-T-P-C-R quantitativo come descritto nel protocollo di testo per iniziare la separazione dei polisomi.

Per prima cosa metti cinque millilitri di una soluzione di saccarosio al 50% in una provetta per ultracentrifuga. Quindi sovrapporre accuratamente cinque millilitri di una soluzione di saccarosio al 15% sulla soluzione al 50%. Quindi, sigillare il tubo sfumato con perfil e inclinare con cautela il tubo fino a quando non si trova orizzontalmente sul piano di lavoro.

Assicurarsi che il tubo sia in una posizione stabile per evitare che rotoli. Tenere il tubo in questa posizione per almeno due ore per consentire la formazione della sfumatura. Nel frattempo, raccogli circa 100 millilitri di una coltura asincrona di sangue infetto da plasmodio al 3-5% di persit.

Quindi aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura contenente due millimolari ciclo, heide, e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, centrifugare le cellule a 500 volte G per sette minuti e poi lavarle due volte con 80 millilitri di PBS contenente 200 micromolari di cicloheide resus. Sospendi il pellet in PBS con cicloesimide e mettilo sul ghiaccio.

Pellettare le celle e rimuovere il surnatante per stimare il volume del pellet. Quindi licare le cellule in un volume finale di 4,25 millilitri di lisi, tamponare e incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius con rotazione. Precedenti tentativi di profilazione dei polisomi e di specie che causano la malaria hanno rivelato principalmente monos perché la lisi dei ponenti porta alla scomposizione dei polisomi in monozone.

Qui utilizziamo un tampone di lisi che lisi l'eritrocita e i parassiti contemporaneamente per preservare il modello polisomico del plasmodium falciparum, trasferiamo il lisato in provette da microcentrifuga e poi giriamo a 16.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. In una provetta per ultracentrifuga da cinque millilitri pre-raffreddata separata, aggiungere 1,25 millilitri di soluzione fredda di cuscino di saccarosio 0,5 molare utilizzando una siringa con un ago da 27 gauge. Sovrapporre con cura 3,75 millilitri di surnatante di lisato sopra il cuscino di saccarosio.

Centrifugare il campione a 366.000 volte G a quattro gradi Celsius per 146 minuti. Durante questo tempo, riportare lentamente la provetta per ultracentrifuga uccisa con saccarosio in posizione verticale e lasciarla riposare sul ghiaccio per almeno 15 minuti. Dopo aver rimosso il lisato dall'ultracentrifuga, raccogliere con cura il surnatante in un due conico da 15 millilitri.

Conservare il surnatante a meno 80 gradi Celsius per preservare la frazione di RNA non legata dai ribosomi. Successivamente, risospendere il pellet di ribosoma in 500 microlitri di sospensione di Resus, tamponare pipettando per cinque minuti per miscelare e centrifugare il campione a 16.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Per rimuovere il materiale insolubile, rimuovere con cautela il param seal sul tubo del gradiente per evitare di disturbare il gradiente, quindi sovrapporre la sospensione ribosomiale sopra con una siringa e un ago calibro 27.

Dopo aver centrifugato la provetta a 200, 000 volte G a quattro gradi Celsius per 180 minuti, conservare i gradienti a quattro gradi Celsius fino al momento di caricarli sul frazionatore. Posizionare una provetta per ultracentrifuga vuota nel frazionatore a gradiente e lavare il sistema con acqua priva di RNA per cinque minuti. Durante il lavaggio, impostare la sensibilità del rilevatore di assorbanza UV a 254 nanometri a 0,2.

Anche se potrebbe essere necessario regolarlo a seconda del segnale. Quindi, impostare il segnale di base su zero mentre l'acqua scorre attraverso il rilevatore. Dopo aver lavato il collettore, invertire il flusso del fluido attraverso il frazionatore per svuotare le linee e quindi rimuovere la provetta dell'ultracentrifuga vuota.

Far passare una soluzione di saccarosio al 60% attraverso il FRAZIONATORE fino a quando non esce dall'apparato dell'ago. Quindi posizionare il tubo del gradiente caricato nella parte superiore della camera di carico e serrare la guarnizione. Forare il fondo del tubo con l'ago.

Quindi reimpostare la velocità del flusso del frazionatore a 12,5 per 10 e raccogliere frazioni di 18 secondi in provette per microcentrifuga. Avviare il flusso in avanti della soluzione di saccarosio al 60% per eluire le frazioni prima che la prima goccia della soluzione a gradiente entri in una provetta per microcentrifuga. Iniziare sia la raccolta che la registrazione in tempo reale dell'assorbanza al segnale a 254 nanometri.

Quando il segnale assorbente scende bruscamente all'interfaccia della soluzione di saccarosio al 50% e al 60%, arrestare il flusso e la registrazione. Memorizza le frazioni del gradiente a meno 80 gradi Celsius. Quindi invertire il flusso del fluido fino a quando la soluzione al 60% non fuoriesce dalla provetta dell'ultracentrifuga.

Rimuovere il tubo e iniziare l'analisi del gradiente successivo. La trasfezione dei globuli rossi con microRNA 4 5 1, seguita dal recupero degli ibridi di mRNA micro NA biotinilati, ha rivelato un arricchimento dei trascritti di fusione PKAR. La trasfezione di micro RNA simulata o non correlata non ha arricchito il trascritto PKAR.

I dati mostrano i picchi eluciani delle subunità ribosomiali 40 s e 60 s, il ribosoma a DS e le frazioni polisomiali contenenti il numero indicato di ribosomi. I ribosomi sono stati associati ai trascritti isolati da PCI che risiedono all'interno dei globuli rossi. L'analisi del sangue del nord ha dimostrato che i ribosomi e il polisoma erano associati al 18 S e al 28 SRNA.

Insieme a questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la digestione della R nasi H, i saggi di protezione della ribonucleasi e il northern blotting per convalidare ulteriormente la presenza di microRNA MR. Fusioni NA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasfettare i microRNA in eritrociti e successivamente catturare piccoli RNA con RNA totale, compresi i trascritti chimerici. Dovresti anche essere in grado di recuperare il polisoma per determinare l'occupazione ribosomiale e quindi il potenziale traduzionale di questi trascritti di fusione.