Isolamento fisico di Endospore da campioni ambientali da mirata Lisi di cellule vegetative

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di separare le endospore batteriche da campioni di comunità microbiche complesse, come i sedimenti. Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia sulla presenza e l'abbondanza di endospore nei campioni naturali. Si basa su una differenza di resistenza tra endospore e cellule vegetative nei confronti delle sostanze chimiche e del calore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il metodo non è distruttivo per le endospore, quindi possono essere utilizzate per esperimenti a valle come la coltivazione, la quantificazione e i test metabolici.

Sebbene abbiamo progettato questo metodo per funzionare con l'ecologia dei batteri che formano endospore, può essere utilizzato anche in campi come l'esobiologia o l'industria alimentare, in cui le spore possono essere benefiche o dannose. Dopo aver preparato le soluzioni e le attrezzature secondo il protocollo di testo, sotto una cappa di biosicurezza sterilizzata ai raggi UV, utilizzare misurini metallici fiammati con etanolo per aggiungere tre grammi di campione di sedimento a provette sterili da 50 millilitri pre-pesate. Utilizzando una buretta sterile graduata, aggiungere al campione 15 millilitri di una soluzione sterile di esametafosfato di sodio all'1% filtrato o SHMP.

Con un dispersore o omogeneizzatore di liquidi e un rotore di dispersione sterile, omogeneizzare il campione a 17.500 giri/min per un minuto. Lasciare riposare il campione per due minuti e ripetere l'omogeneizzazione. Lasciare riposare il campione per 10 minuti affinché le particelle più pesanti si depositino.

Trasferire il surnatante contenente la biomassa cellulare in una provetta pulita da 50 millilitri, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere un'altra aliquota di 15 millilitri di SHMP al pellet sedimentato e ripetere l'omogeneizzazione prima di raccogliere il surnatante e combinarlo con la prima aliquota. Centrifugare il campione a 20 volte G per un minuto e trasferire il surnatante in una provetta fresca da 50 millilitri prima di scartare il pellet.

Una volta che l'unità di filtrazione e la pompa a vuoto sono state preparate secondo il protocollo di testo, utilizzare la fiamma dell'etanolo per sterilizzare le pinze per aggiungere una membrana sterile in nitrocellulosa all'unità di filtrazione. Aggiungere metà del campione di surnatante appena preparato sull'unità di filtrazione a membrana e utilizzare la pompa a vuoto per raccogliere le cellule sulla membrana. Quando il liquido è passato completamente attraverso il filtro, arrestare la pompa del vuoto.

Utilizzare una pinza sterilizzata per rimuovere con cura la membrana e inserirla in una capsula di Petri sterile. Con un pezzo fresco di membrana sterile, ripetere la filtrazione con la restante metà della soluzione. Per separare le endospore dalle cellule vegetative nella biomassa appena raccolta, scongelare la membrana se era congelata e utilizzare forbici, sterilizzate a etanolo, fiammate, per tagliarla in pezzi più piccoli.

Trasferire i pezzi di membrana in una provetta sterile da due millilitri e aggiungere 900 microlitri di tampone 1X TE. Mescolare accuratamente mediante vortice per rilasciare la biomassa dalla membrana. Incubare la provetta a 65 gradi Celsius e 80 giri/min per 10 minuti.

Quindi, rimuovere il tubo dall'incubatrice e lasciarlo raffreddare per 15 minuti. Aggiungere 100 microlitri di lisozima appena preparato a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro e incubare il campione a 37 gradi Celsius e 80 giri/min per 60 minuti per lisare le cellule vegetative. Al termine della lisi, aggiungere al campione 250 microlitri di idrossido di sodio 3 normale e 250 microlitri di soluzione SDS al 6%.

Incubare a temperatura ambiente e 80 giri/min per 60 minuti. Successivamente, preparare un'unità di filtrazione sterile che contenga membrane di 25 millimetri di diametro mediante sterilizzazione in autoclave. Dopo che l'unità di filtrazione si è raffreddata, posizionare su di essa una membrana di nitrocellulosa di 25 millimetri di diametro 0,2 micrometri.

Aggiungere il campione sulla membrana e utilizzare la pompa a vuoto per filtrare il liquido, catturando le endospore sulla membrana, mentre il materiale delle cellule vegetative passa attraverso. Per lavare via i residui di detergente, aggiungere due millilitri di soluzione fisiologica sterile alla membrana e applicare la pompa del vuoto. Quando il liquido è completamente filtrato, spegnere la pompa e lasciare la membrana sull'unità di filtrazione.

Per eseguire il trattamento con DNasi direttamente sulla membrana, aggiungere sulla membrana 450 microlitri di acqua sterile, 50 microlitri di tampone di reazione DNasi 1X e 0,5 microlitri di enzima DNasi e lasciare riposare a circa 25 gradi Celsius per 15 minuti. Il DNA extracellulare precedentemente rilasciato dalle cellule lisate viene digerito enzimaticamente e poi lavato via. Ciò garantisce che la preparazione finale dell'endospora sia priva di DNA esterno, che è fondamentale per l'analisi a valle come l'analisi molecolare.

È importante ricordare che non devono esserci perdite sull'apparato filtrante e che il campione non si secca. Dopo l'incubazione aggiungere un millilitro di soluzione fisiologica e accendere la pompa per lavare via l'enzima residuo dal campione. Utilizzare una pinza sterile per trasferire la membrana contenente le endospore in una capsula di Petri sterile.

Analizzare il campione secondo il protocollo di testo. Il protocollo dimostrato in questo video di lisi mirata delle cellule vegetative si traduce in un campione di endospore purificato e in un aumento significativo della frazione di endospore formanti firmicutes. Nel sequenziamento con amplicone del gene dell'RNA ribosomiale 16S, le firmicute in campioni non trattati corrispondono solo all'8%-19% delle sequenze.

Al contrario, dopo il trattamento i pazienti hanno rappresentato il 90,6% e l'83,9% del campione ricco di endosporine. I due ordini principali di firmicutes che formano endospore, bacillales e clostridiales erano arricchiti, mentre i firmicutes non endospori che formavano come i lactobacillales erano assenti. L'efficacia del trattamento è stata dimostrata anche utilizzando colture pure.

Sono state trattate una preparazione di endospore e una coltura cellulare vegetativa, tutte le cellule sono state incubate e la crescita è stata misurata con una densità ottica di 600 nanometri. Come mostrato qui, la crescita è stata osservata per le colture di endospore, mentre non è stata osservata alcuna crescita nella coltura di E.Coli trattata, indicando che le cellule vegetative sono danneggiate in modo irreversibile. Una volta padroneggiata, e se le soluzioni e le attrezzature sono state preparate in precedenza, questa tecnica dovrebbe essere eseguita in circa cinque ore.

È importante ricordare di evitare tutte le contaminazioni lavorando in condizioni sterili e garantendo la sterilità delle soluzioni e di tutte le attrezzature. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la coltivazione, l'isolamento e i test metabolici per rispondere a ulteriori domande sull'identificazione del ceppo e sul potenziale metabolico delle endospore. Inoltre, l'estrazione del DNA a valle e il sequenziamento metagenomico possono essere eseguiti per analizzare la diversità delle specie e la presenza genica.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come separare le endospore dai campioni ambientali. Non dimenticare che lavorare con detergenti come la SDS può essere estremamente pericoloso. Non dimenticare di indossare dispositivi di protezione individuale.