Misure di sicurezza e procedure operative in un (A) BSL-4 di laboratorio: 3. aerobiologia

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una comprensione generale delle procedure aerosol in laboratorio con armadi a sicurezza biologica per animali di livello IV, che supportano la sicurezza dei ricercatori in laboratorio. La visualizzazione di questo protocollo aiuta a illustrare le complessità e i componenti di sicurezza agli amministratori sanitari che stanno valutando la progettazione di edifici simili e ai collaboratori esterni coinvolti nello studio di agenti patogeni ad alto impatto. Il principale vantaggio di questa tecnica, che utilizza armadi a sicurezza biologica di Classe III a pressione negativa per esperimenti con aerosol, è che il personale del laboratorio può condurre in sicurezza ricerche di aerobiologia senza dover indossare tute a pressione positiva.

In qualità di aerobiologo responsabile, dimostrerò la procedura insieme a Kyle Bohannon, l'ingegnere aerosol del nostro laboratorio. Verificare il funzionamento della porta di trasferimento rapido, o RTP, e dell'equipaggiamento associato alle procedure di aerobiologia, inclusi i portelli del carrello di trasporto e il collegamento RTP che unisce il carrello attraverso il muro all'armadio di sicurezza biologica di Classe III, o BSC. Fissare il RTP in posizione.

Monitorare e registrare qualsiasi manipolazione fisica, somministrazione o procedura di routine su appositi grafici per ogni primate non umano, o NHP. Se è necessaria un'ulteriore anestesia, assicurarsi che tutti i tappi rimossi, aghi usati, oggetti appuntiti e siringhe vengano smaltiti in un contenitore per materiali taglienti. Non rimettere mai il cappuccio sugli aghi dopo l'uso.

Trasportare le scimmie non umane anestetizzate in contenitori trasparenti fissati con un chiavistello sul coperchio della cassa di trasporto. Caricare i contenitori di trasporto su un carrello mobile per consentire ai ricercatori completamente dotati di tuta di muoversi liberamente utilizzando linee d'aria respiratoria attraverso le porte resistenti alla pressione d'aria. Al termine di una prova con aerosol, posizionare la scimmia non umana all'interno del carrello di trasporto e riportarla alla gabbia di mantenimento.

Contemporaneamente alla preparazione degli animali eseguita dal personale di medicina comparativa, verificare il corretto funzionamento della cappa a sicurezza biologica decontaminata. Accertarsi che la pressione negativa all'interno della cappa di Classe III sia mantenuta entro il range specificato. Ispezionare la cappa di Classe III alla ricerca di eventuali perdite o crepe.

Ispezionare i guanti in gomma sintetica e gli o-ring applicati al BSC di Classe III disinfettato per verificare la presenza di punti deboli, strappi, lacerazioni o deterioramento da asciugatura. A questo stadio, il cabinet di sicurezza biologica di Classe III non è contaminato. Sostituire i guanti in gomma sintetica e/o gli o-ring danneggiati del BSC di Classe III.

Ispezionare il serbatoio di immersione e verificare che sia riempito di disinfettante fino al livello indicato, ovvero tre pollici sopra la piastra di immersione oppure fino a una linea segnata all'interno del serbatoio. Verificare che la concentrazione del disinfettante nel serbatoio di immersione sia di almeno 3.500 microsiemens, o 3,5 millisiemens, utilizzando un conduttivimetro. Assicurarsi che la cappa di Classe III BSC sia funzionante per ricevere i rifiuti e l'equipaggiamento contaminati al termine dell'esperimento oppure per trasferire, provenienti dal portello dell'autoclave, apparecchiature necessarie ma dimenticate, una sola volta.

Autoclavare solo l'equipaggiamento noto per resistere alle sollecitazioni del processo. Verificare il funzionamento di altri strumenti di aerobiologia, ad esempio le connessioni elettriche e le prese di corrente.

Posizionare le mani guantate all'interno dei guanti in gomma sintetica collegati alla cappa di Classe III. Assemblare la camera di esposizione solo per la testa di NHP, il tubo di condizionamento e la piattaforma di gestione dell'aerosol. Fissare un generatore di aerosol al tubo di condizionamento e un analizzatore granulometrico aerodinamico alla camera di esposizione solo per la testa di NHP.

Ritrarre le mani guantate dai guanti in gomma sintetica applicati. Smaltire i guanti personali come rifiuto biologico ogni volta che le mani guantate vengono rimosse dai guanti in gomma sintetica applicati. Successivamente, avviare il software del protocollo aerosol sul computer portatile.

Immettere la camera di esposizione per la sola testa di PSCN, il generatore di aerosol e la portata del biosampler appropriati, nonché le informazioni amministrative, nei menu del software. Ricevere il patogeno già preparato attraverso la porta di trasferimento rapido e riempire il generatore di aerosol con il patogeno. L'apparecchio di sicurezza biologica di Classe III è ora contaminato.

Tramite il software dell'aerosol, accendere il generatore di aerosol. Il patogeno proveniente dal generatore di aerosol riempirà la camera di esposizione. Dopo aver spento il generatore di aerosol, svuotare il materiale utilizzato per la sfida e smaltirlo in un sacco per rifiuti biologici situato all'interno della cappa di sicurezza biologica di Classe III.

Successivamente, riempire il biosampler con il mezzo di raccolta e collegare il biosampler riempito alla camera di esposizione per sola testa del PNM. Collegare il tubo del vuoto appropriato al biosampler. Verificare che la profondità dell'anestesia del PNM sia adeguata, come dimostrato dall'assenza di risposta agli stimoli esterni, dal tono muscolare e da una frequenza respiratoria e cardiaca stabili.

Fare passare il PNM anestetizzato attraverso il RTP all'interno della cappa di classe III. Posizionare il PNM in posizione supina sulla rampa di esposizione. Verificare che i parametri vitali del PNM siano stabili sia visivamente che mediante un monitor portatile per soggetti.

Calibrare la pletismografia induttiva respiratoria, o RIP, prima dell'esperimento seguendo il protocollo del produttore. Posizionare le fasce della pletismografia induttiva respiratoria intorno all'addome e al torace del PNM. Verificare che queste fasce siano correttamente posizionate e che i collegamenti elettrici siano saldamente agganciati.

Successivamente, posizionare la maschera di calibrazione Numatech sulla proboscide dell'NHP. Verificare quindi che sia stato creato un sigillo intorno alla proboscide dell'NHP. Calibrare le bande RIP con la maschera di calibrazione Numatech utilizzando un software per computer.

Al termine, rimuovere la maschera di calibrazione. Registrare i parametri respiratori ed esportare i dati respiratori per ciascun animale tramite un programma compatibile. Far passare delicatamente la testa del PNM attraverso la diga dentale in gomma collegata al portello cranico della camera di esposizione per soli testa di PNM.

Assicurarsi che il campo operatorio in gomma crei un sigillo intorno al collo della scimmia non umana durante l'esposizione all'aerosol. Immettere nel software il volume accumulato target dell'aerosol e gli identificatori dell'equipaggiamento necessari relativi a ciascuna esposizione ed avviare la procedura dell'aerosol. Una volta che la scimmia non umana ha respirato il volume accumulato target, il sistema si arresta.

Sganciare le cinghie RIP e posizionarle sul letto accanto al PNM. Pulire il PNM con garza imbevuta di soluzione di clorhexidina all'uno-due percento, avendo cura durante la pulizia intorno agli occhi del PNM. Tamponare la testa del PNM per rimuovere l'eccesso di soluzione.

Riportare il PNM attraverso il PRT ai ricercatori all'interno del laboratorio di aerobiologia con tuta ABSL-4. Svuotare il generatore di aerosol e qualsiasi materiale di sfida residuo nel sacchetto per rifiuti biologici contenente rifiuti, attrezzature monouso e contenitori per punte e taglienti pieni per 3/4. Svuotare il mezzo di raccolta dal campionatore di aerosol biologico nei tubi di raccolta opportunamente etichettati.

Posizionare le provette di raccolta sul ghiaccio bagnato in un contenitore per il bio-saggio appropriato al fine di determinare una dose inalata stimata. Quindi far passare le provette per la raccolta dei campioni e il contenitore attraverso il RTP. Il cabinet di sicurezza biologica di Classe III è un armadio in acciaio inossidabile ermeticamente sigillato, mantenuto sotto pressione negativa, all'interno di un laboratorio con cabinet di sicurezza biologica per animali di Livello IV.

I materiali vengono introdotti all'interno della cappa di sicurezza biologica da parte del personale che opera nel laboratorio con cabina di sicurezza animale di livello IV attraverso un serbatoio in acciaio inossidabile montato al di sotto della cappa, o serbatoio di immersione, contenente una soluzione disinfettante al cinque percento a base di ammonio quaternario doppio. Poiché la cappa di sicurezza biologica (BSC) è integrata nel muro che separa il laboratorio con cabina di sicurezza animale da un laboratorio ABSL-4 con tuta, i materiali, gli animali e gli agenti patogeni virali possono essere trasferiti nella cappa anche dal lato del laboratorio con tuta, utilizzando un carrello di trasporto e un RTP. Una volta aperte le porte del carrello di trasferimento verso il laboratorio ABSL-4 con tuta, la cappa di sicurezza biologica di Classe III viene considerata contaminata.

Gli oggetti all'interno della cappa possono essere manipolati dall'esterno da personale che indossa guanti in gomma sintetica di vari tipi. Questi oggetti, esclusi i campioni infettivi, vengono rimossi dalla cappa dopo sterilizzazione mediante autoclave a doppia porta o disinfezione tramite il bagno immersione. Verificando che la cappa di sicurezza biologica di Classe III e l'equipaggiamento per bioaerosol funzionino correttamente, si mantiene un ambiente sicuro e pienamente operativo, essenziale per la sicurezza del personale.

Seguendo scrupolosamente queste procedure e pratiche, non sono state registrate infezioni acquisite in laboratorio durante la ricerca sugli bioaerosol presso l'Integrated Research Facility di Frederick. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita tempestivamente, consentendo di esporre più primati non umani in un solo giorno. Durante l'esecuzione di questa procedura, ricordarsi di mantenere un'adeguata profondità di anestesia.

Senza una sedazione costante, l'acquisizione della pletismografia diventa molto più complessa. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri esperimenti di aerobiologia che coinvolgono specie più piccole, come conigli e topi. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'aerobiologia per controllare le variabili che influenzano la dosimetria, come temperatura, umidità relativa ed efficienza del biosampler, al fine di erogare una dose inalata precisa.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle precauzioni di biosicurezza utilizzate durante esperimenti aerobiologici. Precauzioni come il cambio frequente dei guanti personali dovrebbero ridurre il rischio di infezioni acquisite in laboratorio.