Name: Misure di sicurezza e procedure operative in un (A) BSL-4 di laboratorio: 3. aerobiologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Impara le procedure di aerobiologia in laboratorio BSL-4 per la ricerca su patogeni ad alto rischio usando scimmie non umane. Questo metodo garantisce la sicurezza del personale durante esperimenti con aerosol.

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Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani degli Stati Uniti (DHHS) o delle istituzioni e delle aziende affiliate agli autori. Questo lavoro è stato finanziato in parte attraverso il contratto principale del Battelle Memorial Institute con il National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) degli Stati Uniti nell'ambito del contratto n. HHSN272200700016I. J.K.B., K.J., M.R.H., D.P., L.B. e J.W. hanno svolto questo lavoro come dipendenti del Battelle Memorial Institute. I subappaltatori del Battelle Memorial Institute che hanno eseguito questo lavoro sono: J.H.K., un dipendente di Tunnell Government Services, Inc.; e M.G.L., un dipendente del Lovelace Respiratory Research Institute.

Questo protocollo aderisce alle seguenti linee guida per la cura degli animali. Gli animali sono stati alloggiati in una struttura accreditata dall&#39;Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento degli animali da laboratorio Care International. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal National Institute of Allergy e Malattie infettive, Divisione di Ricerca Clinica, cura degli animali e del Comitato Usa ed erano in conformità con le normative Animal Welfare Act, la politica Public Health Service, e la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio raccomandazioni. 1. Aerobiologia: Animal livello di biosicurezza 4 (ABSL-4) Laboratorio Suit <ol><li> Preparazione Laboratorio <ol><li> Completare le procedure di ingresso di laboratorio ABSL-4 suit (descritto in dettaglio in 8). </li><li> Verificare la funzionalità di tutte le attrezzature (ad esempio, attrezzature pletismografia, laptop, bidoni della spazzatura a rischio biologico, contenitori taglienti rischio biologico, dispositivo di monitoraggio soggettos) coinvolti nelle procedure di aerobiologia che si verificano all&#39;interno del laboratorio ABSL-4 vestito secondo il protocollo del produttore. </li><li> Assicurarsi che il carrello di trasferimento è biologicamente pulita prima testare la funzionalità della porta trasferimento rapido (RTP), che collega il carrello di trasporto attraverso la parete alla classe III BSC). </li><li> Maniglia e diluire patogeno solo all&#39;interno BSC certificati. Preparare il patogeno nella formulazione appropriata all&#39;interno di un BSC Classe II che contiene disinfettanti appropriati. Trasportare l&#39;agente patogeno in un contenitore secondario a tenuta d&#39;aria etichettati con un simbolo di rischio biologico sul ghiaccio bagnato nel carrello di trasporto. Passare il patogeno attraverso la RTP nella classe III BSC nel ABSL-4 armadietto di laboratorio, figura 1. </li></ol></li></ol> 2. pletismografia: Animal livello di biosicurezza 4 (ABSL-4) Laboratorio Suit <ol><li> Setup pletismografia e calibrazione <ol><li> Determinare quale metodo di acquisizione pletismografia(Pletismografia head-out o respiratoria induttanza pletismografia [RIP]) saranno utilizzati e collegare i componenti di apparecchiature insieme. </li><li> Calibrare il pletismografo prima dell&#39;esperimento utilizzando il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> pletismografia acquisizione <ol><li> Quando si maneggia NHPs, indossare una coppia esterna di guanti di lattice o di nitrile sopra la parte superiore dei guanti adatti per evitare la contaminazione incrociata e promuovere pratiche sicure. Al termine la manipolazione NHPs, rimuovere questi guanti in più e gettare nel cestino a rischio biologico all&#39;interno della stanza. </li><li> Se si utilizza la testa-out pletismografia, allegare una diga di gomma nuova / dentale per la parte anteriore del cilindro. Tagliare un piccolo foro nella diga per la testa del NHP per passare attraverso la parte superiore del cilindro. Quando si è seduti, la diga crea una tenuta intorno al collo del NHP. </li><li> Se si utilizza RIP, controllare che le bande RIP siano correttamente montati intorno al torace e l&#39;addome del NHP e le connessioni elettroniche sono agganciati Tightly. </li><li> Invia tutti i dati acquisiti dalla procedura pletismografia ai ricercatori nel ABSL-4 gabinetto laboratorio. Esportare il volume e volume minuto i dati di marea per ogni animale mediante un programma compatibile per l&#39;utilizzo durante il processo di aerosol. </li></ol></li></ol> 3. Non umano Primate trasporto e la movimentazione: Animal biosicurezza livello di laboratorio 4 Suit <ol><li> Manipolazione NHP <ol><li> Monitorare e registrare eventuali manipolazioni, amministrazioni, o procedure di routine fisiche sui grafici per ogni NHP. </li><li> Quando un confronto aerosol è completata, posizionare il NHP all&#39;interno del contenitore di trasporto e tornare NHP alla gabbia casa situata nel locale di permanenza degli animali. </li><li> Quando si maneggia un animale vivo, seguire la regola obbligatorio che richiede 2 membri del personale di essere presenti. </li></ol></li><li> Trasporti NHP <ol><li> Determinare il tipo di anestesia, la durata dell&#39;anestesia (copre il trasporto, la pletismografia Acquisizione, e confronto aerosol) e la dose corrispondente dell&#39;anestesia prima della somministrazione. Completamente anestetizzare il NHP sulla base del processo di scelta da parte del personale Medicina comparativa. Se è necessaria l&#39;anestesia supplementare, assicurare tutti gli aghi, taglienti, le siringhe, e tappi vengono scartati in un apposito contenitore situato in una delle camere di procedura animale. Non riassumere gli aghi dopo l&#39;uso. </li><li> Transport anestetizzato NHPs in contenitori trasparenti che sono protetti da un fermo sul coperchio della scatola di trasporto. </li><li> Contenitori da trasporto caricare su un carrello mobile permettono ai ricercatori pienamente adatte a muoversi liberamente utilizzando linee aria respirabile e attraverso la pressione dell&#39;aria porte resistenti (APR), Figura 1. </li><li> Come aria respirabile aggiuntiva per il NHP viene fornito al contenitore di trasporto, ridurre al minimo il tempo di trasporto. </li></ol></li></ol> 4. Aerobiologia: ABSL-4 Cabinet Laboratorio <ol><li> Impostazione di classe III BSC <ol><li>In concomitanza con la preparazione animali effettuate dal personale Medicina comparativa, preparare la classe III BSC. Visivamente verificare che la pressione negativa nella classe III BSC è mantenuta nel range specificato (125 Pa o -0.5 in minima colonna d&#39;acqua (WG), 250 Pa o -1.0 in wg consigliata). Ispezionare la Classe III BSC per eventuali perdite o crepe (vedi Figura 1). </li><li> Fisicamente e ispezionare visivamente la classe III BSC guanti di gomma sintetica e O-ring collegati alla classe III BSC i punti deboli, le lacrime, strappi o putrefazione a secco. Sostituire la classe III danneggiata sintetici guanti di gomma e / o O-ring immediatamente prima dell&#39;uso. A questo punto, la classe III BSC non è contaminato. </li><li> Se si verifica una perdita, mentre la classe III BSC è contaminato, identificare la posizione del personale di violazione e di facility management di allarme e di biosicurezza. Se un guanto di classe III integrato BSC è strappata o violato, sostituire il guanto danneggiata immediatamente seguendo la tecnica adeguatamente addestrato e interClasse III nal BSC procedura operativa standard. </li><li> Per modificare un guanto integrato contenente un piccolo strappo o rottura durante l&#39;esposizione, prima spruzzare lo strappo o rottura eccessivamente la concentrazione appropriata di un doppio ammonio quaternario (n-alchil ammonio cloruro dimetil benzil, n-alchil dimetil etil benzil ammonio cloruro) disinfettante . Non fare movimenti eccessivi durante questo periodo che crea un aumento del flusso d&#39;aria. </li><li> Con cautela, rimuovere gli o-ring esterno (2 di essi) che lasciano il guanto integrato danneggiato ancora attaccato alla classe III BSC. Spostare leggermente il polsino guanto integrato danneggiata dal porto, garantendo nel contempo la tenuta del guanto integrato rimane intatto. Se la tenuta è compromessa, verrà emesso un allarme che indica la procedura non è stato fatto correttamente. Il bracciale guanto integrato deve rimanere attaccato alla porta dopo il secondo O-ring viene rimosso dalla classe III BSC. </li><li> Posizionare una nuova BSC guanto di gomma sintetica Classe III sopra del vecchio guanto In stesso orientamento. Inserire questo nuovo guanto completamente attraverso la porta in modo simile agli altri porti guanti Classe III BSC. </li><li> Sostituire l&#39;O-ring più vicina alla classe III BSC il nuovo guanto integrato. L&#39;utilizzo di una porta guanto integrato adiacente, tirare con attenzione il guanto di gomma sintetica classe III BSC danneggiato all&#39;interno del BSC Classe III. Il nuovo guanto di gomma sintetica classe III fungerà da barriera per mantenere contenimento. Una volta che l&#39;altro guanto di gomma sintetica classe III danneggiato viene rimosso (tirato verso l&#39;interno), sostituire l&#39;altro O-ring esterno e continuare a lavorare. </li><li> Registrare tutti i dettagli riguardanti il ​​guanto lacrima / breccia nella specifica classe III registro BSC libro. Se il guanto integrato danneggiato viene rimosso o una breccia nel contenimento si verifica, il guanto / porte integrato compromesso mantiene ancora un flusso d&#39;aria verso l&#39;interno di 0,47 m 3 / sec. Questo flusso d&#39;aria verso l&#39;interno è lo stesso flusso d&#39;aria utilizzato con una classe II BSC, mantenendo così la coerenza tra classi II e III BSC. </li><li> Ispezionare serbatoio dunk everificare che il serbatoio dunk è riempito con un disinfettante all&#39;altezza segnata all&#39;interno del serbatoio dunk, figura 1. Controllare la concentrazione di disinfettante nel serbatoio dunk è un minimo di 3500 mS utilizzando un misuratore di conducibilità. Questo conducibilità è equivalente alla concentrazione del 5% del disinfettante. </li><li> Assicurarsi che la classe III BSC autoclave è funzionale ed operativa così tutti i rifiuti e le attrezzature contaminate possono essere sterilizzati in autoclave, figura 1. Autoclave solo apparecchiature noto per sostenere i rigori del processo di sterilizzazione. </li><li> Verificare la funzionalità di altri apparecchi aerobiologia (ad esempio, componenti AAMP, laptop) e linee di aria e vuoto coinvolti nella sperimentazione, Figura 2. </li><li> Posizionare segni sulla BSC Classe III indicano lo stato di contaminazione corrente dell&#39;unità. </li></ol></li><li> Assemblaggio e Installazione del sistema di NHP Camera limitatamente alla testa Esposizione <ol><li> Assemblare un 16-l NHP testa solo cha esposizionember inserendo la fornitura in acciaio inox e linee di scarico, figura 2. Configurare la camera in un push / pull, configurazione dinamica collegando l&#39;aria, sottovuoto, e linee di pressione appropriate al AAMP. Collegare il AAMP ad una fonte di alimentazione all&#39;interno del BSC classe III e un computer portatile tramite una porta a tenuta ermetica situato in cima al BSC Classe III (Figura 1). </li><li> Ispezionare la camera di NHP testa solo l&#39;esposizione assemblato per eventuali perdite o crepe, e assicurarsi che la camera di montaggio completo. </li><li> Collegare un generatore di aerosol e aerodinamica dimensione delle particelle strumento di lettura alla camera di esposizione testa solo NHP. </li><li> Aprire la fonte di aria e vuoto per il AAMP. </li><li> Avviare il software del protocollo di aerosol sul computer portatile. Inserire il NHP testa sola camera di esposizione, generatore di aerosol e il flusso biosampler tasso appropriato, e le informazioni amministrative nei menu del software. </li><li> Calcolare il confronto aerosoltempo dai dati acquisiti durante la procedura pletismografia, passo 2.2.4. Se si utilizza la pletismografia testa-out, calcolare la dose prima dell&#39;esposizione di aerosol. Se si utilizza RIP, calcolare la dose simultaneamente durante l&#39;esposizione di aerosol. </li><li> Riempire il generatore di aerosol con l&#39;agente patogeno. </li><li> Attraverso il software di aerosol, ruotare il generatore di aerosol &quot;a&quot; e spruzzare l&#39;interno della testa sola camera di esposizione NHP con il materiale sfida per 10 min. </li><li> Spegnere il generatore di aerosol, svuotare il materiale sfida, e scartare il materiale sfida in un sacco della spazzatura a rischio biologico che si trova all&#39;interno del BSC Classe III. </li></ol></li><li> NHP limitatamente alla testa Esposizione <ol><li> Collegare un biosampler alla testa sola camera di esposizione NHP, riempire il biosampler con i media di raccolta, e fissare la linea del vuoto appropriata al biosampler. </li><li> Controllare la profondità di anestesia del NHP. Se la profondità di anestesia è considerata adeguata ( <em&gt; ad esempio, non risponde agli stimoli esterni, tono muscolare, respiratorio stabile e frequenze cardiache), passare il anestetizzato NHP attraverso la porta di trasferimento rapido (RTP) nella classe III BSC. Se la profondità dell&#39;anestesia è inadeguata, somministrare l&#39;anestesia ulteriore via IV, iniezione diretta, o tramite una pompa di anestetico prima di passare il NHP attraverso la RTP (personale Medicina comparativa in laboratorio tuta). Passare ulteriori forniture anestetici attraverso la RTP. </li><li> Posizionare il NHP in posizione supina sulla rampa di esposizione NHP. </li><li> passare delicatamente la testa del NHP attraverso la diga di gomma / dentale collegato al portale capo della camera di esposizione testa solo NHP. La diga di gomma / dentale garantisce la tenuta è creato intorno al collo del NHP durante l&#39;esposizione di aerosol. </li><li> Verificare che i segni vitali del NHP sono stabili visivamente e con un monitor portatile soggetto. </li><li> Inserire l&#39;ora confronto aerosol calcolata dal punto 4.2.6. e gli identificatori attrezzature necessarie perTinent a ciascuna di aerosol eseguire nel software di aerosol e iniziare il confronto aerosol. </li><li> Verifica dati granulometria durante ogni corsa aerosol con l&#39;aerosol analizzatore di dimensione delle particelle per garantire la distribuzione granulometrica desiderata è raggiunto. Eseguire questa verifica continua o intermittente durante l&#39;esposizione. </li><li> Una volta che il confronto aerosol, rimuovere il NHP dalla camera di esposizione testa sola e pulire il NHP faccia / testa con il disinfettante appropriato per ridurre la contaminazione potenziale per il personale di laboratorio. </li><li> Eliminare la camera d&#39;aria aerosol o lavare i restanti e in ritardo di sviluppo particelle per 5 minuti facendo passare l&#39;aria e il vuoto attraverso la camera. Questa procedura consente di &quot;pulire&quot; e rimuovere le particelle residue dalla camera di esposizione di aerosol per le successive esposizioni aerosol NHP. </li><li> Passare il NHP indietro attraverso la RTP per i ricercatori che si trovano all&#39;interno del laboratorio ABSL-4 tuta aerobiologia. </li><li> Eliminare tutti i diesis used all&#39;interno della classe III BSC in un apposito contenitore designato che rimane nel BSC. Quando l&#39;apposito contenitore è pieno ¾, inserire all&#39;interno del sacchetto della spazzatura. </li><li> Svuotare il generatore di aerosol e qualsiasi residuo di materiale sfida nel sacco della spazzatura a rischio biologico contenente rifiuti, attrezzature usa e getta, e / o ¾ pieno apposito contenitore, se applicabile. </li><li> Svuotare la collezione media dal biosampler di aerosol nei tubi di raccolta opportunamente etichettati e disporli sul ghiaccio bagnato. </li><li> Ripetere i punti da 4.3.1 a 4.3.13 fino a quando tutti i soggetti sottoposti al test in programma sono stati contestati. </li><li> Passare tutti i campioni di aerosol biosampler attraverso la RTP per i ricercatori per la quantificazione e posteriore titolazioni di dosi di aerosol. </li><li> Posizionare il cestino e attrezzature dal confronto aerosol nell&#39;autoclave pass-through attaccato al BSC classe III e selezionare un ciclo di sterilizzazione applicabile (Figura 3). </li><li> Smontare la NHP testa solo CHamber e decontaminare la camera di testa-only e il BSC Classe III con un ciclo a gas paraformaldeide convalidato con indicatori biologici. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Noi definire le procedure aerobiologia utilizzate al IRF-Federico per lavorare con gli agenti patogeni altamente pericolosi (4 Group Risk). Uno scopo di visualizzare le procedure bioaerosol è quello di sottolineare la sicurezza del personale quando si utilizza un BSC Classe III durante la sperimentazione di tali agenti patogeni per evitare infezioni acquisite in laboratorio. BSC classe III mantengono un flusso d&#39;aria direzionale interiore che esaurisce in doppi filtri HEPA per garantire che i patogeni sono contenuti...

La trasmissione del virus avviene generalmente da malattie dirette o contatto fisico, ma molte importanti virali (ad esempio, il morbillo, la varicella, influenza) sono causate da patogeni che vengono trasmessi da aerosol o goccioline respiratorie. Tali agenti patogeni hanno il potenziale di causare una pandemia con conseguenze che vanno dalla malattia lieve diffusa associata a perdita di lavoro (ad esempio, raffreddore) per più rara malattia grave con alta letalità (ad esempio, il vaiolo). Patogeni ad alto conseguenza che si diffondono naturalmente dal aerosol o dal rilascio di aerosol intenzionale (armi biologiche) sono di particolare interesse per aerobiologia 1. Gli esseri umani possono diventare rapidamente infettati con alcuni di questi agenti patogeni da grandi goccioline respiratorie o nuclei di piccole particelle e facilmente diffondere questi agenti patogeni ad altri attraverso le secrezioni salivari, tosse, starnuti e 2. Nella comunità biodifesa Stati Uniti, gli agenti patogeni ad alto conseguenza (per esempio, o altri filovirus NIAID Categoria priorità AC Agenti patogeni e CDC di agenti Bioterrorismo) sono al centro di programmi di ricerca di aerosol a causa della elevata letalità delle infezioni associate 3,4. Progressi scientifici di rilievo nel campo aerobiologia sono stati fatti nell&#39;ultimo decennio grazie ai progressi tecnologici dei dispositivi di aerosol e le strutture ad alto contenimento 5,6. La ricerca presso il National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive (NIH / NIAID), la ricerca di Integrated Facility a Fort Detrick si trova a Frederick, MD, USA (IRF-Frederick) si concentra sui patogeni emergenti ad alta conseguenza che richiedono biosicurezza animale livello 4 (ABSL-4) di contenimento. La missione generale del IRF-Federico è quello di valutare e facilitare lo sviluppo di vaccini candidati e terapie (contromisure mediche). La ricerca con agenti patogeni ad alto conseguenza al IRF-Federico è governata da biosicurezza stringenti e cura degli animali e utilizzare i requisiti. questi requirements sono delineati nel biosicurezza in microbiologiche e laboratori biomedici (BMBL) Manuale 7 e regolamenti federali sul benessere degli animali. Questi requisiti necessari possono limitare il tipo di ricerca che può essere eseguita e l&#39;impatto disegno complessivo dello studio. Come abbiamo precedentemente descritto in questa rivista, tutte le ricerche condotte in un ambiente ABSL-4 richiede particolare cautela, la formazione altamente specializzata, e una infrastruttura 8,9 struttura robusta e ridondante. L&#39;ingresso nel IRF-Federico ABSL-4 laboratorio tuta richiede indossare una pressione positiva incapsulare vestito 8. A pressione positiva incapsulare abiti non sono necessari per entrare nel laboratorio di gabinetto ABSL-4. Indossando un abito macchia, gomma o nitrile, e scarpe vicino-piantati è appropriata quando la manipolazione Gruppo di rischio 4 materiale infetto all&#39;interno di un certificato di classe III biosicurezza Cabinet (BSC) in un ABSL-4 armadietto di laboratorio 7. Al IRF-Frederick, attrezzature aerosol è stato progettato, assemblato e mantenuto in due ermeticamente sigillati BSC di Classe, in acciaio inox, a tenuta d&#39;aria, a pressione negativa III, figura 1. L&#39;IRF-Federico Aerobiologia Nucleo impiega una piattaforma di gestione automatizzata di aerosol ( AAMP) per controllare e monitorare la sperimentazione di aerosol all&#39;interno di questi BSC, figura 2. una pubblicazione precedente ha delineato le funzioni specifiche dei BSC classe III presso l&#39;IRF-Federico e il collegamento con il laboratorio di tuta tramite una porta pass-through 5. La procedura di preparazione della classe III BSC prima sperimentazione è specifico per il IRF. Altri BSC Classe III utilizzati in altri istituti funzionare in modo simile alla Classe III BSC in uso presso l&#39;IRF, ma possono avere diversi meccanismi per il trasporto, l&#39;accesso o l&#39;attracco. Per capire meglio come gli agenti patogeni ad alto conseguenza rimangono infettive e la diffusione attraverso la trasmissione di aerosol, ae sicurosperimentazione robiological deve essere condotta in questi BSC di classe III secondo una procedura flusso di lavoro specifico. I ricercatori sono stati attentamente e accuratamente addestrato per assicurare questo flusso di lavoro è seguito in modo sicuro e coerente. Prima di non umano confronto aerosol primate (NHP), diversi caratterizzazione aerosol o aerosol corse simulate vengono eseguite per testare la stabilità e la sostenibilità di un agente quando è in forma di aerosol. Il processo di aerosol di caratterizzazione imita la sfida attuale di aerosol, e il ricercatore valuta le variabili associate con gli studi di aerosol. Un&#39;altra parte del flusso di lavoro è quello di registrare manipolazioni fisiche, amministrazione o anestetici o altri agenti, o procedure di routine sui grafici per ogni NHP. Questi grafici soggetti vengono analizzati a fondo per garantire la coerenza procedurale e la standardizzazione. I soggetti sono anestetizzati prima di aerosol esposizione. anestetici esempio includono tiletamina / zolazepam, ketamina / Acepromazina, e ketamine. Anestetici sono scelti sulla base di minimizzare la soppressione delle vie respiratorie e la promozione della controllata, la respirazione stato stazionario. Ulteriori forniture di anestesia sono mantenuti nelle camere animali procedura e trasportati sul carrello di trasferimento con il NHP alla aerobiologia ABSL-4 gabinetto laboratorio. All&#39;interno del laboratorio di ABSL-4 tuta, primati non umani sono sottoposti pletismografia tramite uno dei due metodi (ad esempio, pletismografia testa-out, respiratorio pletismografia induttiva [RIP]) per determinare volume corrente inspiratorio e la frequenza respiratoria cambia 10-12. Questi parametri derivati ​​sono utilizzati per il calcolo accurato della dose inalata stimato del patogeno immediatamente prima o durante l&#39;esposizione dell&#39;aerosol. Pletismografia Head-out utilizza un lungo, camera cilindrica che ospita il NHP 13. La caduta di pressione creata quando un animale è nel cilindro viene catturato da un pneumotacografo, trasmesso all&#39;amplificatore elaborazioni corrente alternata / curren diretticonvertitore t, e integrato nel software per derivare i parametri polmonari sopra. RIP utilizza sensori fatte di fili di rame a spirale induttivi che sono incorporati in fasce elastiche intorno al petto del soggetto e l&#39;addome 11,12. Induttivo-condensatore genera un campo magnetico nel sensore. La respirazione cambia il campo magnetico, e le variazioni di tensione risultanti vengono inoltrati da un trasmettitore vicino alla fascia elastica ad un ricevitore nel computer tramite onde radio ad altissima frequenza a breve lunghezza d&#39;onda. Software dedicato determina la frequenza respiratoria e volume corrente da spostamento toracica totale. Il volume minuto (MV) ottenuto tramite pletismografia è utilizzato nel calcolo della dose inalata stimato (D). Nel generare e campionamento un aerosol, la concentrazione di aerosol (AC) è calcolata moltiplicando la concentrazione biosampler (BC) dal volume di supporto (V) e dividendo per risultato della moltiplicazione della portata del biosampler (FL) daltempo di esposizione (T). La formula semplificata è rappresentato come AC = BC x V ÷ FL x T. A sua volta, per il confronto aerosol effettiva NHPs, D è calcolato moltiplicando AC da MV e la durata di esposizione (tempo = T). La formula semplificata è rappresentato come D = AC x MV x T. Lo scopo di questo articolo è quello di dimostrare visivamente l&#39;intera procedura di confronto aerosol con primati non umani da due punti di vista, il lato ABSL-4 laboratorio tuta e il lato ABSL-4 gabinetto laboratorio. Anche se queste procedure possono essere di natura generale per diverse pratiche menzionate, che sono specifici per l&#39;IRF-Federico Aerobiologia Core e rappresentano le pratiche reali utilizzati in questa istituzione. Questo articolo si concentra sulle procedure di biosicurezza necessarie per eseguire in sicurezza un confronto aerosol, non l&#39;aerosol sfida vero e proprio. In queste procedure, stiamo usando un soggetto fittizio per mostrare pratiche di biosicurezza, a causa del rischio associato ad anestetizzare un NHP. Tuttavia, il processo di performing un confronto aerosol è scritto in un modo generale, perché la procedura è la stessa indipendentemente dal patogeno ad alta conseguenza utilizzato. Il nostro obiettivo è di migliorare la conoscenza e la comprensione degli scienziati circa i rigori di condurre studi di aerosol di agenti patogeni ad alto conseguenza in condizioni di massima di contenimento.

<table><tbody><tr><td>Micro-Chem Plus</td><td>Laboratori Chimici Nazionali</td><td>255</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td>Pescatore</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Classe III BSC</td><td>Germfree</td><td>DGB-10</td><td></td></tr><tr><td>Guanti BSC integrati</td><td>Piercan</td><td>10UY2032-9</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma di gestione degli aerosol (AeroMP)</td><td>Biaera Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pletismografia a testa in giù</td><td>Buxco/Data Sciences International</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pletismografia induttiva respriatoria</td><td>Data Sciences International</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di aerosol tangenziale a flusso centrato (CenTAG)</td><td>CH Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizzatore Collison</td><td>BGI Inc.</td><td>CN25</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Getinge</td><td>GEB 2404 AMB-2</td><td></td></tr><tr><td>Tuta a pressione positiva Sperian</td><td>Prodotti di sicurezza Honeywell Prodotti</td><td>BSL 4-2</td><td></td></tr><tr><td>Guanti per tuta esterna (lattice, Ansell Canners and Handlers)</td><td>Fisher</td><td>19-019-601</td><td></td></tr><tr><td>Guanti per tuta esterna (nitrile/gomma, MAPA)</td><td>Fisher</td><td>2MYU1</td><td></td></tr><tr><td>Scrubs</td><td>Cintas</td><td>60975/60976</td><td></td></tr><tr><td>Calzini</td><td>Cintas</td><td>944</td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>Pack-N-Tape</td><td>51131069695</td><td></td></tr><tr><td>Asciugamani</td><td>Cintas</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td><td>O-ring magazzino</td><td>AS568-343</td><td></td></tr><tr><td>Copriscarpe</td><td>Amazon</td><td>B0034KZE22</td><td></td></tr><tr><td>Zip Lube</td><td>Amazon</td><td>B000GKBEJA</td><td></td></tr></tbody></table>

misure di sicurezza e procedure operative in un (a) bsl-4 di laboratorio: 3. aerobiologia

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

Gli studi su aerosol o inalazione di agenti patogeni ad alta conseguenza sono recentemente aumentati di numero a causa della minaccia percepita di rilasci intenzionali di aerosol o di una trasmissione naturale inaspettata di aerosol. I laboratori specifici progettati per eseguire questi esperimenti richiedono enormi controlli ingegneristici per fornire un ambiente di lavoro sicuro e protetto e una manutenzione costante dei sistemi per sostenere la funzionalità. Le cappe di biosicurezza di classe III, note anche come glovebox, sono involucri a tenuta di gas con finestre che non si aprono. Questi armadi sono mantenuti in pressione negativa da doppi sistemi di scarico filtrati HEPA (High Efficiency Particulate-Air) e sono il contenimento primario ideale per l'alloggiamento di apparecchiature di aerosolizzazione. Un flusso di lavoro ben pianificato tra i membri del personale all'interno di un alto contenimento, ad esempio da un laboratorio di tute di biosicurezza animale di livello 4 (ABSL-4) al laboratorio dell'armadio ABSL-4, è una componente cruciale per il successo della sperimentazione. Per un'esecuzione regolare dello studio, la creazione di una rete di comunicazione, lo spostamento di attrezzature e soggetti e l'installazione e il posizionamento delle attrezzature, richiede ai membri del personale di pianificare meticolosamente le procedure prima dell'inizio dello studio. Qui, forniamo una panoramica e una rappresentazione visiva di come viene condotta la ricerca aerobiologica presso il National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Integrated Research Facility a Fort Detrick, Maryland, USA, all'interno di un ambiente ABSL-4.

Il cabinet biosicurezza classe III (BSC) è un armadietto acciaio inox ermeticamente sigillata contenente un ambiente ABSL-4 sotto pressione negativa all&#39;interno di un ABSL-4 cabinet laboratorio (Figura 1). I materiali possono essere introdotti nella BSC da parte del personale che lavora nel ABSL-4 gabinetto laboratorio attraverso un serbatoio in acciaio inox sotto-armadietto-montato (comunemente indicato come un &quot;carro armato dunk&quot; in ABSL-4 o BSL-4 imposta...

Poiché gli agenti patogeni ad alta conseguenza possono potenzialmente infettare i soggetti attraverso particelle sospese nell'aria, l'aerobiologia è stata sempre più applicata nella ricerca sulla patogenesi e nello sviluppo di contromisure mediche. Presentiamo una dimostrazione visiva dettagliata delle procedure aerobiologiche durante una sfida con aerosol in primati non umani in un ambiente di massimo contenimento di livello di biosicurezza animale 4.

Misure di sicurezza e procedure operative in un (A) BSL-4 di laboratorio: 3. aerobiologia

Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una comprensione generale delle procedure aerosol in laboratorio con armadi a sicurezza biologica per animali di livello IV, che supportano la sicurezza dei ricercatori in laboratorio. La visualizzazione di questo protocollo aiuta a illustrare le complessità e i componenti di sicurezza agli amministratori sanitari che stanno valutando la progettazione di edifici simili e ai collaboratori esterni coinvolti nello studio di agenti patogeni ad alto impatto. Il principale vantaggio di questa tecnica, che utilizza armadi a sicurezza biologica di Classe III a pressione negativa per esperimenti con aerosol, è che il personale del laboratorio può condurre in sicurezza ricerche di aerobiologia senza dover indossare tute a pressione positiva.In qualità di aerobiologo responsabile, dimostrerò la procedura insieme a Kyle Bohannon, l'ingegnere aerosol del nostro laboratorio. Verificare il funzionamento della porta di trasferimento rapido, o RTP, e dell'equipaggiamento associato alle procedure di aerobiologia, inclusi i portelli del carrello di trasporto e il collegamento RTP che unisce il carrello attraverso il muro all'armadio di sicurezza biologica di Classe III, o BSC. Fissare il RTP in posizione. Monitorare e registrare qualsiasi manipolazione fisica, somministrazione o procedura di routine su appositi grafici per ogni primate non umano, o NHP. Se è necessaria un'ulteriore anestesia, assicurarsi che tutti i tappi rimossi, aghi usati, oggetti appuntiti e siringhe vengano smaltiti in un contenitore per materiali taglienti. Non rimettere mai il cappuccio sugli aghi dopo l'uso.Trasportare le scimmie non umane anestetizzate in contenitori trasparenti fissati con un chiavistello sul coperchio della cassa di trasporto. Caricare i contenitori di trasporto su un carrello mobile per consentire ai ricercatori completamente dotati di tuta di muoversi liberamente utilizzando linee d'aria respiratoria attraverso le porte resistenti alla pressione d'aria. Al termine di una prova con aerosol, posizionare la scimmia non umana all'interno del carrello di trasporto e riportarla alla gabbia di mantenimento.Contemporaneamente alla preparazione degli animali eseguita dal personale di medicina comparativa, verificare il corretto funzionamento della cappa a sicurezza biologica decontaminata. Accertarsi che la pressione negativa all'interno della cappa di Classe III sia mantenuta entro il range specificato. Ispezionare la cappa di Classe III alla ricerca di eventuali perdite o crepe.Ispezionare i guanti in gomma sintetica e gli o-ring applicati al BSC di Classe III disinfettato per verificare la presenza di punti deboli, strappi, lacerazioni o deterioramento da asciugatura. A questo stadio, il cabinet di sicurezza biologica di Classe III non è contaminato. Sostituire i guanti in gomma sintetica e/o gli o-ring danneggiati del BSC di Classe III.Ispezionare il serbatoio di immersione e verificare che sia riempito di disinfettante fino al livello indicato, ovvero tre pollici sopra la piastra di immersione oppure fino a una linea segnata all'interno del serbatoio. Verificare che la concentrazione del disinfettante nel serbatoio di immersione sia di almeno 3.500 microsiemens, o 3,5 millisiemens, utilizzando un conduttivimetro. Assicurarsi che la cappa di Classe III BSC sia funzionante per ricevere i rifiuti e l'equipaggiamento contaminati al termine dell'esperimento oppure per trasferire, provenienti dal portello dell'autoclave, apparecchiature necessarie ma dimenticate, una sola volta.Autoclavare solo l'equipaggiamento noto per resistere alle sollecitazioni del processo. Verificare il funzionamento di altri strumenti di aerobiologia, ad esempio le connessioni elettriche e le prese di corrente.Posizionare le mani guantate all'interno dei guanti in gomma sintetica collegati alla cappa di Classe III. Assemblare la camera di esposizione solo per la testa di NHP, il tubo di condizionamento e la piattaforma di gestione dell'aerosol. Fissare un generatore di aerosol al tubo di condizionamento e un analizzatore granulometrico aerodinamico alla camera di esposizione solo per la testa di NHP.Ritrarre le mani guantate dai guanti in gomma sintetica applicati. Smaltire i guanti personali come rifiuto biologico ogni volta che le mani guantate vengono rimosse dai guanti in gomma sintetica applicati. Successivamente, avviare il software del protocollo aerosol sul computer portatile.Immettere la camera di esposizione per la sola testa di PSCN, il generatore di aerosol e la portata del biosampler appropriati, nonché le informazioni amministrative, nei menu del software. Ricevere il patogeno già preparato attraverso la porta di trasferimento rapido e riempire il generatore di aerosol con il patogeno. L'apparecchio di sicurezza biologica di Classe III è ora contaminato.Tramite il software dell'aerosol, accendere il generatore di aerosol. Il patogeno proveniente dal generatore di aerosol riempirà la camera di esposizione. Dopo aver spento il generatore di aerosol, svuotare il materiale utilizzato per la sfida e smaltirlo in un sacco per rifiuti biologici situato all'interno della cappa di sicurezza biologica di Classe III.Successivamente, riempire il biosampler con il mezzo di raccolta e collegare il biosampler riempito alla camera di esposizione per sola testa del PNM. Collegare il tubo del vuoto appropriato al biosampler. Verificare che la profondità dell'anestesia del PNM sia adeguata, come dimostrato dall'assenza di risposta agli stimoli esterni, dal tono muscolare e da una frequenza respiratoria e cardiaca stabili.Fare passare il PNM anestetizzato attraverso il RTP all'interno della cappa di classe III. Posizionare il PNM in posizione supina sulla rampa di esposizione. Verificare che i parametri vitali del PNM siano stabili sia visivamente che mediante un monitor portatile per soggetti.Calibrare la pletismografia induttiva respiratoria, o RIP, prima dell'esperimento seguendo il protocollo del produttore. Posizionare le fasce della pletismografia induttiva respiratoria intorno all'addome e al torace del PNM. Verificare che queste fasce siano correttamente posizionate e che i collegamenti elettrici siano saldamente agganciati.Successivamente, posizionare la maschera di calibrazione Numatech sulla proboscide dell'NHP. Verificare quindi che sia stato creato un sigillo intorno alla proboscide dell'NHP. Calibrare le bande RIP con la maschera di calibrazione Numatech utilizzando un software per computer.Al termine, rimuovere la maschera di calibrazione. Registrare i parametri respiratori ed esportare i dati respiratori per ciascun animale tramite un programma compatibile. Far passare delicatamente la testa del PNM attraverso la diga dentale in gomma collegata al portello cranico della camera di esposizione per soli testa di PNM.Assicurarsi che il campo operatorio in gomma crei un sigillo intorno al collo della scimmia non umana durante l'esposizione all'aerosol. Immettere nel software il volume accumulato target dell'aerosol e gli identificatori dell'equipaggiamento necessari relativi a ciascuna esposizione ed avviare la procedura dell'aerosol. Una volta che la scimmia non umana ha respirato il volume accumulato target, il sistema si arresta.Sganciare le cinghie RIP e posizionarle sul letto accanto al PNM. Pulire il PNM con garza imbevuta di soluzione di clorhexidina all'uno-due percento, avendo cura durante la pulizia intorno agli occhi del PNM. Tamponare la testa del PNM per rimuovere l'eccesso di soluzione.Riportare il PNM attraverso il PRT ai ricercatori all'interno del laboratorio di aerobiologia con tuta ABSL-4. Svuotare il generatore di aerosol e qualsiasi materiale di sfida residuo nel sacchetto per rifiuti biologici contenente rifiuti, attrezzature monouso e contenitori per punte e taglienti pieni per 3/4. Svuotare il mezzo di raccolta dal campionatore di aerosol biologico nei tubi di raccolta opportunamente etichettati.Posizionare le provette di raccolta sul ghiaccio bagnato in un contenitore per il bio-saggio appropriato al fine di determinare una dose inalata stimata. Quindi far passare le provette per la raccolta dei campioni e il contenitore attraverso il RTP. Il cabinet di sicurezza biologica di Classe III è un armadio in acciaio inossidabile ermeticamente sigillato, mantenuto sotto pressione negativa, all'interno di un laboratorio con cabinet di sicurezza biologica per animali di Livello IV.I materiali vengono introdotti all'interno della cappa di sicurezza biologica da parte del personale che opera nel laboratorio con cabina di sicurezza animale di livello IV attraverso un serbatoio in acciaio inossidabile montato al di sotto della cappa, o serbatoio di immersione, contenente una soluzione disinfettante al cinque percento a base di ammonio quaternario doppio. Poiché la cappa di sicurezza biologica (BSC) è integrata nel muro che separa il laboratorio con cabina di sicurezza animale da un laboratorio ABSL-4 con tuta, i materiali, gli animali e gli agenti patogeni virali possono essere trasferiti nella cappa anche dal lato del laboratorio con tuta, utilizzando un carrello di trasporto e un RTP. Una volta aperte le porte del carrello di trasferimento verso il laboratorio ABSL-4 con tuta, la cappa di sicurezza biologica di Classe III viene considerata contaminata.Gli oggetti all'interno della cappa possono essere manipolati dall'esterno da personale che indossa guanti in gomma sintetica di vari tipi. Questi oggetti, esclusi i campioni infettivi, vengono rimossi dalla cappa dopo sterilizzazione mediante autoclave a doppia porta o disinfezione tramite il bagno immersione. Verificando che la cappa di sicurezza biologica di Classe III e l'equipaggiamento per bioaerosol funzionino correttamente, si mantiene un ambiente sicuro e pienamente operativo, essenziale per la sicurezza del personale.Seguendo scrupolosamente queste procedure e pratiche, non sono state registrate infezioni acquisite in laboratorio durante la ricerca sugli bioaerosol presso l'Integrated Research Facility di Frederick. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita tempestivamente, consentendo di esporre più primati non umani in un solo giorno. Durante l'esecuzione di questa procedura, ricordarsi di mantenere un'adeguata profondità di anestesia.Senza una sedazione costante, l'acquisizione della pletismografia diventa molto più complessa. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri esperimenti di aerobiologia che coinvolgono specie più piccole, come conigli e topi. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'aerobiologia per controllare le variabili che influenzano la dosimetria, come temperatura, umidità relativa ed efficienza del biosampler, al fine di erogare una dose inalata precisa.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle precauzioni di biosicurezza utilizzate durante esperimenti aerobiologici. Precauzioni come il cambio frequente dei guanti personali dovrebbero ridurre il rischio di infezioni acquisite in laboratorio.

safety-precautions-operating-procedures-an-bsl-4-laboratory-3

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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