Legame dell'anticorpo Specificità per Kappa (Vκ) umani (IgM) Anticorpi catena contenenti chiari: Polysialic Acid (PSA) Allegato alla NCAM come caso di studio

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare gli antigeni per gli anticorpi con potenziale terapeutico con particolare attenzione all'isotipo IgM. Questo metodo colma una lacuna di conoscenze in campo biomedico e può aiutare a identificare nuovi biomarcatori e agenti immunoterapici per la ricerca sul cancro e le malattie del sistema nervoso centrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che apre le porte a una classe di anticorpi trascurata con un grande potenziale terapeutico.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi e al trattamento di tutte le malattie che possono essere prese di mira dalle terapie basate su anticorpi. Ciò che questa materia può fornire informazioni sugli antigeni degli anticorpi IgM e sui tessuti in crescita e sulle sottocolture. Può anche essere una piaga per altri isotipi di anticorpi di tutte le specie.

Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ho realizzato un legame specifico e prominente dell'anticorpo IgM in diverse applicazioni biochimiche. A dimostrare la procedura saranno Robert Kahoud e Jens Watzlawik. Per iniziare questa procedura, fai un taglio sul cranio verso la parte anteriore all'altezza dell'orecchio e stacca il cranio.

Quindi, posiziona delicatamente il cervello in un tubo da 15 millilitri e conservalo immediatamente su ghiaccio secco. Dopo cinque minuti, trasferisci il cervello su una carta da pesa pulita e rimuovi rapidamente il cervelletto e il tronco encefalico usando una lama di rasoio pulita. Quindi, pesare il cervello congelato prima di trasferirlo nuovamente nella provetta da 15 millilitri con ghiaccio.

Aggiungere un tampone di lisi ghiacciato a una concentrazione finale di 150 microgrammi di tessuto cerebrale per microlitro di tampone di lisi. Quindi, omogeneizzare il cervello in tampone di lisi mediante triturazione attraverso una punta di pipetta da un millilitro seguita da triturazione attraverso una siringa da cinque millilitri dotata di un ago da 27 gauge. Successivamente, incubare il lisato cerebrale per altri 30 minuti su ghiaccio per consentire la completa lisi dei tessuti.

Dopo 30 minuti, rimuovere il detersivo, il materiale insolubile e i lipidi cerebrali per la centrifugazione seriale. Scartare la mielina e i detriti cellulari contenenti pellet, ma conservare il surnatante dopo ogni fase di centrifugazione. Aliquotare il lisato cerebrale e conservarlo a 80 gradi Celsius.

In questa fase, preparare 200 millilitri di IP Buffer con BSA e altri 200 millilitri di IP Buffer senza BSA. Per la reazione di immunoprecipitazione, trasferire 100 microlitri di impasto di agarosio di proteina L in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di tampone IP con BSA al tubo.

Quindi, mescolalo manualmente per inversione. Successivamente, lavare le perle di agarosio Protein L quattro volte mediante centrifugazione. Successivamente, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet di agarosio e ripetere la procedura di lavaggio altre tre volte.

Quindi, aggiungere BSA fresco contenente tampone IP alla proteina L agarosio e incubarla per una notte su un rullo a quattro gradi Celsius. In 800 microlitri di tampone IP contenente BSA e 30 milligrammi di tessuto cerebrale lisato, aggiungere 20 microgrammi di anticorpo sperimentale, anticorpo di controllo o PBS. Incubare 30 milligrammi di tessuto cerebrale lisizzato in un tampone IP ghiacciato con anticorpi IgM in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millimetri durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, centrifugare le perle di proteina L agarosio in una centrifuga da banco. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet di agarosio. Quindi, aggiungere la soluzione fredda di lisato cerebrale di anticorpi all'agarosio proteico L.

Incubare l'antigene anticorpale, la proteina L agarosio sospensione per due ore su un rullo a quattro gradi Celsius. Dopo due ore, lavare il complesso antigenico anticorpale attaccato all'agarosio L attraverso la centrifugazione. Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere un millilitro di tampone IP ghiacciato contenente lo 0,2% di BSA.

Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta utilizzando un tampone IP ghiacciato contenente lo 0,2% di BSA e altre due volte utilizzando un tampone IP ghiacciato senza BSA. Successivamente, ridurre il complesso antigenico anticorpale attaccato all'agarosio L.Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per scartare il surnatante fino a quando non rimangono circa 50 microlitri della soluzione sopra il pellet di agarosio proteico L. Quindi, utilizzare una pipetta da 10 microlitri per rimuoverlo completamente.

Tenere tutti i campioni sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 40 microlitri di tampone di eluizione IP a ciascuna provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Muovi con le dita il tubo sei volte e riscaldalo per cinque minuti a 95 gradi Celsius.

Successivamente, posizionare il campione sul ghiaccio per due minuti e farlo girare per 30 secondi. Quindi, trasferire 35 microlitri di surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 millimetri senza disturbare il pellet. Quindi, confermare l'assenza di perle di proteina L agarosio risciacquando una piccola quantità di campione diluito sulla parete interna della provetta.

Se sono presenti perle di proteina L agarosio, centrifugare il campione per altri 30 secondi a 13.000 volte g e trasferire il surnatante in una provetta pulita. Ripetere questo passaggio fino a quando non sono rilevabili perle di agarosio. Quindi, caricare 10-20 microlitri di campioni diluiti per pozzetto su un gel di poliacrilammide SDS SDS e un sistema tampone SDS di tris-glicina e far funzionare il gel per circa un'ora a 100 volt sul banco di lavoro senza ulteriore raffreddamento.

Successivamente, trasferire le proteine su una membrana in PVDF. Le proteine vengono trasferite per due ore e mezza nella cella frigorifera a 100 volt utilizzando un tampone di trasferimento freddo. Bloccare la membrana con il 10% in peso per volume di latte in polvere in polvere in PBS-T per un'ora a 25 gradi Celsius su un agitatore orbitale da banco.

Lavalo due volte per 10 minuti ogni volta con PBS-T. Sondare la membrana con anticorpo primario al 5% BSA in PBS-T. Incubare su un agitatore orbitale nella cella frigorifera per una notte.

La mattina successiva, lavare la membrana una volta con eccesso di PBS-T a 25 gradi Celsius seguito da tre lavaggi con PBS-T per 10 minuti ciascuno su uno shaker orbitale. Successivamente, aggiungere l'anticorpo secondario e il 5% di latte in polvere in polvere PBS-T alla membrana e incubarla per un'ora a 25 gradi Celsius su uno shaker orbitale. Successivamente, lavare la membrana una volta con PBS-T in eccesso a 25 gradi Celsius seguita da tre lavaggi con PBS-T per 10 minuti ciascuno su uno shaker orbitale.

Miscelare un millilitro del componente A del substrato HRP a chemiluminescenza potenziata raffreddato con un millilitro del componente B a 25 gradi Celsius. Trasferisci la membrana su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi, asciugare il contenitore con carta assorbente prima di trasferire nuovamente la membrana su di esso.

Immediatamente, aggiungere due millilitri del substrato HRP a chemiluminescenza potenziato premiscelato alla membrana e incubarlo per due minuti a 25 gradi Celsius. Inclinare il contenitore a mano ogni 20 secondi per inumidire uniformemente la membrana. Successivamente, trasferisci la membrana in una custodia di plastica trasparente e rimuovi il liquido in eccesso e le bolle d'aria con carta assorbente.

Fissare con nastro adesivo la guaina di plastica nella cassetta e chiuderla. Questa figura mostra che HigM12 immunoprecipita il suo antigene dai lisati cerebrali cerebrali e agisce come agente di rilevamento nei Western blot. Né l'anticorpo di controllo dell'isotipo né le perle di agarosio L immunoprecipitano un antigene simile, il che dimostra la specificità del pull down.

Qui, i Western blot che utilizzano lisati del SNC da topi wild type e NCAM knockout dimostrano la specificità del legame di HIgM con il PSA contenente NCAM'La digestione enzimatica del tessuto del SNC da topi wild type utilizzando ENDO-NF identifica il PSA attaccato a NCAM come l'apitopo legante specifico per HIgM12. Utilizzando il metodo qui descritto, si ottengono colture microgliali di ratto IBA-1 positive di elevata purezza. A differenza della microglia, gli antigeni di superficie delle cellule bersaglio HIgM12 e A2B5 sono stati altamente arricchiti in colture di OPC di ratto in condizioni di cellule vive.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro 13 ore lavorative. Seguendo questa procedura, altri metodi come Biacore o la tecnologia di risonanza plasmonica di superficie possono essere impiegati per identificare le affinità di legame degli anticorpi alle costanti di associazione e associazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro, delle immunoterapie e degli autoanticorpi naturali per identificare gli apitopi di carboidrati su proteine simili come antigeni per gli anticorpi IgM terapeutici nell'uomo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare gli antigeni glicoproteici per il lavoro di ricerca contenente anticorpi IgM umani. I dati forniscono un nuovo obiettivo per la terapia della SM. PSA ENCAP, il trattamento anticorpale che abbiamo sviluppato, è uno dei primi a mostrare un miglioramento funzionale in una scatola di attività utilizzando il modello rigoroso che è nella malattia e nella malattia svalutante simile alla sclerosi multipla.