Name: Legame dellanticorpo Specificità per Kappa (Vκ) umani (IgM) Anticorpi catena contenenti chiari: Polysialic Acid (PSA) Allegato alla NCAM come caso di studio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Scopri come identificare antigeni per anticorpi IgM terapeutici mediante immunoprecipitazione e Western blotting su tessuto cerebrale. Questo metodo consente di rilevare nuovi biomarcatori per la ricerca sul cancro e le malattie del sistema nervoso centrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 e R21 NS073684), la National Science Foundation (premio alla carriera), il Premio Partnership Minnesota per la biotecnologia e medicina genomica, la National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) , e la Mayo Clinic center for clinica e traslazionale Scienza (CCATS). Gli autori riconoscono il sostegno delle Fondazioni Applebaum, Hilton, Peterson e Sanford, la Luna e Marilyn Parco Fondo Directorship e la famiglia McNeilus.

I brevetti per gli anticorpi che promuovono la rimielinizzazione e la riparazione del SNC sono rilasciati e di proprietà della Mayo Clinic. Gli autori hanno un potenziale conflitto di interessi.

Umani autoanticorpi naturali IgM sono interessanti candidati per immunoterapie e hanno dimostrato il potenziale terapeutico per il trattamento di varie malattie tra cui il cancro e disturbi del SNC 1-7. Vantaggiosamente, questi anticorpi non suscitare una risposta immunitaria in cui la generazione di anticorpi neutralizzanti riduce sostanzialmente la dose terapeutica efficace ed efficacia. È importante sottolineare che tutti gli anticorpi con potenziale terapeutico sono stati di isotipo IgM e appartengono al repertorio NAb 3-5,8,9,37,40,42-45. Un ostacolo importante per il potenziale applicazione clinica di anticorpi IgM è l&#39;identificazione dei loro antigeni, che sono indeterminati in molti casi. tecniche standard impiegate per gli anticorpi IgG spesso non sono applicabili a individuare l&#39;antigene di un IgM. Questo protocollo descrive l&#39;identificazione di PSA-NCAM come antigene per la rigenerazione IgM umane HIgM12, efficace in modelli animalidi MS e SLA 15-18. La metodologia utilizzata è principalmente applicabile a tutti gli anticorpi umani con specifiche catene Vκ luce VκI, VκIII e VκIV e anticorpi di topo con catene leggere VκI, indipendentemente isotipo del anticorpale. La fase più critica in questo protocollo è l&#39;uso di anticorpi IgM in applicazioni di cromatografia di affinità. Più in particolare, gli anticorpi di successo sono tenuti ad agire come agenti di pull-down in immunoprecipitazione per isolare o per arricchire un antigene di complessi tessuto- o cella-cultura lisati. frazioni antigene arricchite possono essere confrontati con immunoprecipitazione da anticorpi di controllo isotipo e successivamente analizzati per le differenze mediante spettrometria di massa. Un requisito essenziale o limitazione di questa fase è la presenza della corretta anticorpi Vκ catena leggera e dell&#39;ospite (uomo, topo) per consentire di legame alle proteine ​​L agarosio anticorpo. L&#39;uso di proteine ​​mannan vincolante legato a agarosio (anche callelectina d mannosio-binding) al posto di proteine ​​L agarosio è un potenziale alternativa al immunoprecipitare IgM specifici senza catene leggere Vκ. Tuttavia, come affermato da Arnold et al. 35, antigene-bound anticorpi IgM non si legano alle proteine ​​mannan vincolante, come i glicani bersaglio sembrano diventare inaccessibile una volta che il IgM ha legato al suo antigene. Sulla base di questi risultati mannan-binding protein non può essere utilizzato come matrice legame immunoprecipitare antigene-caricato IgM molecole 35. Altre alternative potenziali potrebbero essere l&#39;uso di anticorpi anti-IgM IgG agarosio-bound secondari 46,47 o l&#39;uso di perline magnetiche tensioattivi attivato 48. anticorpi IgG diretti contro IgM potrebbero essere chimicamente reticolato di agarosio A o G agarosio al fine di ridurre la portata di anticorpo eluite insieme con l&#39;antigene di interesse. Un corretto confronto tra diverse varianti di IgM immunoprecipitazione rispetto ad antigeni identificati con successo is difficile perché la maggior parte immunoprecipitazione sono stati eseguiti per isolare o esaurire IgM senza ulteriore interesse per i loro antigeni. Inoltre, immunoprecipitazione utilizzando IgM sono stati utilizzati principalmente per confermare un già noto o previsto antigene singolo con l&#39;esposizione di anticorpi ad antigeni purificati 49. Uno svantaggio di IgG agarosio accoppiamento diretto contro IgM umana è un basso rendimento (10 - 15%) del immunoprecipitato siero molecole IgM rispetto al materiale di partenza 50. Al contrario, sfere magnetiche superficie attiva sono state applicate con successo agli anticorpi di diversi isotipi tra IgM per immunoprecipitare scrapie associate fibrille 48. Questo metodo non è limitato a kappa specifica (Vκ) o catene lambda (λ) o un host particolare e può ampliare notevolmente lo spettro di anticorpi IgM utilizzati in immunoprecipitazione. Un altro passo importante nel protocollo è la capacità del anticorpale a funzionare come un detantiriflesso anticorpo (anticorpo primario) in Western blot o altre piattaforme di screening. anticorpi successo deve indirizzare loro antigene con sufficientemente elevata affinità per consentire l&#39;antigene vincolante in presenza di detergenti non ionici o possibilmente ionici. Alte anticorpi affinità sono comuni tra anticorpi IgG affinità-maturato, ma meno comune tra gli anticorpi IgM, che è uno dei motivi per cui ci sono relativamente pochi gli anticorpi IgM disponibili in commercio come agenti di rilevamento in ambienti biochimici. Alta affinità di legame degli anticorpi è un requisito per immunoprecipitazione di antigeni molecolari e per Western blotting. L&#39;abbassamento delle concentrazioni detergente o la completa assenza di detergenti in buffer IP e buffer di lisi consente antigene targeting anticorpi a bassa affinità attraverso il suo dominio Fab. Al contrario, la capacità dell&#39;anticorpo di indirizzare proteina L agarosio tramite la sua porzione Fc non è sostanzialmente influenzato tra i controlli isotipo su una gamma di diverse concen detergentistrazioni. Tuttavia, bassa concentrazione di detergente in tampone di lisi e tampone IP previene rottura della membrana cellulare e l&#39;isolamento di molecole specifiche. Analogamente, una bassa concentrazione di detersivo nel buffer blot lavaggio occidentali (ad esempio, PBS-T) permette legame di anticorpi a bassa affinità antigene, ma allo stesso tempo aumenta il legame non specifico e quindi non è un&#39;opzione. La presenza di un nucleo proteina dell&#39;antigene è un altro requisito per questo metodo. Proteine ​​con modificazioni post-(ad esempio, glicoproteine, lipoproteine) e le proteine ​​non modificate, ma non lipidi unico o carboidrati, sono rilevabili in Western blot. Non è possibile immunoprecipitare lipidi (ad esempio, sfingolipidi) da lisati tessuti o cellule in presenza o assenza di detergenti. Le proprietà fisico-chimiche di detergenti e lipidi sono troppo simili per consentire interazioni selettive lipidi-anticorpo, mentre allo stesso tempo detergenti sono essenziali per interromperemembrane per consentire isolamento selettivo di molecole specifiche. A nostra conoscenza, immunoprecipitazione e formato da soli carboidrati, in assenza di un nucleo proteine, non sono stati precedentemente riportati. Questo diventa particolarmente rilevante perché gli anticorpi IgM frequentemente bersaglio carboidrati e glicolipidi, che non sono necessariamente collegate ad una unità di proteine. Altre tecniche cromatografiche sono necessari per la separazione e immunologica identificazione dei lipidi e carboidrati in assenza di un nucleo proteine. Ad esempio, la cromatografia su strato (TLC) dei lipidi cellulari con conseguente rilevazione di anticorpi sulla piastra TLC (immuno-TLC) può essere implementato 51,52. Altri anticorpi anti-PSA sono stati descritti in studi e risultati precedenti rispetto HIgM12 nonché la presenza di anticorpi anti-IgM PSA (clone 2-2B). L&#39;anticorpo più comunemente usato nel settore della PSA è un anticorpo IgG (clone 735) disponibile come MONOC topolonal o policlonale di coniglio anticorpo 53. Questo anticorpo anti-PSA IgG rileva PSA su SynCAM e NCAM su diversi tipi di cellule del sistema nervoso centrale, tra cui cellule microgliali 41. In contrasto con l&#39;anticorpo anti-PSA IgG, IgM umane HIgM12, HIgM42 e l&#39;anti-PSA topo IgM (clone 2-2B) sono in grado di indirizzare PSA su SynCAM (ma su NCAM) in vari stadi postnatali embrionali precoci in topi , mentre SynCAM non polysialylated è facilmente rilevabile 15. Gli anticorpi IgM utilizzati non sono in grado di rilevare PSA sulle cellule microgliali (figure 3 + 4). Una possibile spiegazione per le differenze osservate tra isotipi di anticorpi può essere bassi livelli di PSA-SynCAM rispetto ai livelli di PSA-NCAM in combinazione con legame di anticorpi IgM contro l&#39;anti-PSA IgG l&#39;affinità potenzialmente inferiore. Per verificare questa ipotesi, abbiamo effettuato immunoprecipitazione negli animali NCAM KO in fase embrionale E17 con una grande quantità di SynCAM presente e usato HIgM12 come un &quot;agente di pull-down&quot; &lt;sup&gt; 15. In E17 WT littermate controlli HIgM12 immunoprecipitato PSA-NCAM in una misura che ha mostrato intensità simili di &quot;tirato giù&quot; PSA-NCAM rispetto al IgM catena pesante come rilevato da densitometria nella successiva Western Blot utilizzando antigeni eluiti. Questo risultato suggerisce almeno affinità sufficiente HIgM12 alla sua PSA bersaglio. In contrasto con WT littermate controlla HIgM12 non ha rilevato PSA attaccato al SynCAM negli animali NCAM KO. Identici risultati sono stati ottenuti in immunoprecipitazione utilizzando l&#39;umana anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 e HIgM42, così come il topo anti-PSA IgM (clone 2-2B) sono stati in grado di indirizzare il PSA SynCAM in Western blot da WT e NCAM KO animali a stadi di sviluppo embrionale e postnatale. Data la bassa quantità di HIgM12 necessaria (0,1 mg / ml) per rilevare specificamente PSA collegato a NCAM in Western blot utilizzando piccole quantità di tessuto del sistema nervoso centrale (0,1 mcg CNS tessuto per pozzetto) 15 sembra essere improbabile che i bassi affinità da soli sonoresponsabile completa mancanza di rilevamento PSA-SynCAM da HIgM12 in tre diversi metodi. Concludiamo che ci sono differenze significative tra anticorpi anti-PSA IgM e l&#39;anticorpo anti-IgG PSA spesso pubblicato (clone 735). Non è chiaro il motivo per cui in commercio anticorpi anti-PSA IgM non sono stati utilizzati più di frequente in passato per confermare i risultati ottenuti con l&#39;anticorpo IgG antiPSA 735. Questo è particolarmente interessante perché HIgM12 ha già dimostrato l&#39;efficacia in diversi modelli di malattia. Mentre gli altri anticorpi anti-PSA IgM possono avere effetti terapeutici simili non è chiaro se l&#39;anticorpo anti-IgG PSA (clone 735) ha un risultato terapeutico simile a modelli di MS e SLA. In breve, i metodi descritti qui sono stati utilizzati principalmente per identificare l&#39;antigene dei rigenerativi HIgM12 anticorpo umano per sostenere eventuali studi clinici per la SM e, eventualmente, altre malattie neurodegenerative. L&#39;identificazione di formicaigens per anticorpi con attività biologica è passo essenziale per capire la loro meccanismo di azione. Questo diventa particolarmente rilevante nel contesto di numerosi anticorpi monoclonali attualmente in fase di sperimentazione per la sicurezza e l&#39;efficacia in studi umani. Mentre il numero di anticorpi IgM clinicamente testati fino ad oggi è di piccole dimensioni, i recenti progressi nella IBRIDOMA insieme ad un crescente numero di studi che evidenziano il potenziale terapeutico di questa classe di anticorpi 1-10,37,40,42-45 sollecita lo sviluppo di nuove o metodi modificati applicabile per identificare non proteici antigeni IgM.

Anticorpi di isotipo IgM dimostrano grande potenziale terapeutico per il trattamento di varie malattie compresi il cancro e disturbi del SNC 1-7. Il gruppo Vollmers &#39;identificato numerosi anticorpi nei pazienti affetti da cancro per l&#39;uso potenziale come biomarcatori specifici tumorali o terapie attivi che sono in grado di uccidere le cellule maligne inducendo percorsi apoptotici 4,8,9. È interessante notare che tutti gli anticorpi identificati con potenziale terapeutico sono di isotipo IgM e appartengono al gruppo di &quot;anticorpi naturali&quot; (BA). Allo stesso modo, il gruppo del Rodriguez identificato mouse e anticorpi umani che stimolano la rimielinizzazione nelle lesioni del midollo spinale cronica demielinizzati in modelli di sclerosi multipla (SM). Identico al anticorpi con effetti anti-cancro, tutti gli anticorpi rimielinizzazione di promozione sono NAbs e di isotipo IgM 1,6,7,10. Gli antigeni precise per IgM più identificati sono ancora undetermined compreso l&#39;anticorpo remyelination di promozione umana rHIgM22, attualmente in fase I di sperimentazione clinica per i pazienti affetti da SM 11. Nonostante i ripetuti sforzi da parte di esperti in materia di lipidi e carboidrati di ricerca sia in ambito accademico e in collaborazione con l&#39;industria 11, i tentativi di individuare l&#39;antigene di rHIgM22 non hanno avuto successo. Il fallimento delle tecniche standard utilizzati per identificare gli antigeni di anticorpi IgG a lavorare con anticorpi IgM identifica una necessità critica per affinare metodi specifici per questi anticorpi che molto probabilmente carboidrati di destinazione o lipidi antigeni. Il focus di questo manoscritto è l&#39;anticorpo umano rigenerativa HIgM12 e le procedure sperimentali utilizzate per identificare il suo antigene. Anticorpo HIgM12 è stata identificata da pazienti con macroglobulinemia di Waldenstrom, stimola la crescita dei neuriti in vitro 12-14 e si rivolge acido polysialic (PSA) attaccato alla molecola di adesione delle cellule neurali (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 estende la durata della vita in un modello murino di SLA 17 e migliora risultato funzionale nel virus murino encefalomielite di Theiler (TMEV) topi -infected. In particolare, HIgM12 stimola l&#39;attività del motore orizzontale e verticale spontanea nei topi e aumenta cronicamente demielinizzati numero di diametro piccole e medie assoni del midollo spinale otto settimane dopo una singola, a basso dosaggio di intraperitoneale iniettato anticorpi 18. La molecola di adesione delle cellule neurali (NCAM) è una glicoproteina di immunoglobuline (Ig) superfamiglia espresso sulla superficie cellulare dei neuroni, glia, muscolo scheletrico e cellule natural killer 19-25. I tre principali isoforme NCAM chiamati NCAM180, NCAM140 e NCAM120, sono varianti di splicing alternativo di un trascritto primario che variano solo nella loro dominio citoplasmatico. All&#39;interno del CNS, NCAM è la principale molecola polysialylated (&gt; 95%) con lunghe omopolimeri carica negativa acido sialico. Polysialic uncid con n&gt; 10 è definito PSA ma le strutture oligomeriche più brevi esistono, che sono anche biologicamente rilevanti. Altre proteine ​​polysialylated espresse nel SNC sono SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 e una subunità del canale del sodio 25 (per una rassegna vedi 29). I metodi descritti qui consentire l&#39;identificazione antigene per immunoglobuline umane e di topo contenenti (catene leggere VκI, VκIII o VκIV per anticorpi umani e catene leggere VκI per gli anticorpi di topo) specifici kappa (Vκ) catene leggere indipendentemente isotipo del anticorpi (ad esempio, IgG, IgM , IgA, IgD o IgE). Questa limitazione si basa sull&#39;uso di proteine ​​L agarosio per immunoprecipitazione con anticorpi di isotipo IgM. Strategie alternative possono includere lectine mannosio vincolante e secondarie anticorpi IgG anti-IgM covalentemente legati alla agarosio perline, che possono ampliare l&#39;applicabilità di questo metodo per più anticorpi IgM incLuding quelli con catene leggere lambda (λ) (vedi la discussione). Rapporti di catene leggere IgM Vκ siero rispetto alle catene leggere IgM λ derivati ​​da individui sani sono 1,5: 1 30. In base al metodo cromatografico qui utilizzato per separare, arricchire, e immunologicamente rilevare alcune molecole 31, tutti gli antigeni devono includere almeno un dominio proteina piccola. Specifico epitopo di legame del anticorpo può essere all&#39;interno o all&#39;esterno del dominio di proteine ​​(per esempio, in glicoproteine, lipoproteine). passaggi biochimici iniziale utilizzato per identificare l&#39;antigene specifico per HIgM12, rispettivamente per restringere l&#39;elenco di potenziali candidati, sono i passi più importanti in questo metodo. preparati specifici tipo di cellula e caratterizzazioni morfologia a base di cellule sono descritti per le cellule gliali, ma questa metodologia possono essere estrapolati per accogliere altri tipi di cellule all&#39;interno o al di fuori del sistema nervoso centrale. Vi è un urgentenecessità di sviluppare nuove o modificate le tecniche applicabili per il crescente numero di anticorpi IgM con un potenziale terapeutico per diverse malattie umane in particolare in quei casi (la maggior parte degli antigeni IgM), dove i bersagli degli anticorpi sono strutture di carboidrati o lipidi.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>Alto glucosio, con glutammina, con piruvato di sodio, 500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml, L-glutammina, piruvato di sodio, glucosio alto</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Integratore di N-2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Integratore di B-27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>senza sero, 10 ml</td></tr><tr><td>di siero fetale bovino - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Acqua sterile per irrigazione</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1.000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina bromidrato</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &middot; xHBr, peso molecolare 30.000-70.000 g/mol, 50 mg</td></tr><tr><td>frazione di albumina sierica bovina V</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>frazione da shock termico, senza proteasi, pH 7, purezza 98%, 100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, Peso molecolare: 180,16 g/mol, reagente ACS, 500 g</td></tr><tr><td>di tripsina dal pancreas bovino</td><td>Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>essenzialmente privo di sale, polvere liofilizzata, 9.000 unità BAEE/mg di proteina</td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi I dal pancreas bovino</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Tipo IV, polvere liofilizzata, 2.000 unità Kunitz/mg di proteina</td></tr><tr><td>Proteina di base ricombinante di ratto FGF</td><td>R& D systems</td><td>3339-FB-025</td><td>BSA come proteina trasportatrice, 25 &#181; g, liofilizzato, > 95%, 16,2 kDa</td></tr><tr><td>Proteina PDGF-AA di ratto ricombinante</td><td>R& Sistemi D</td><td>1055-AA-50</td><td>senza portante, 50 &#181; g, liofilizzato, > 97%, E. coliderivato, 12,5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml, senza glutammina, senza acido aspartico, senza acido glutammico</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>cristallino, 1 kg, grado reattivo, peso molecolare 30,03 g/mol (come monomero)</td></tr><tr><td>Tris[idrossimetil]amminometano (Tris bas</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg, puro al 99,8%, polvere</td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg, polvere</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C2H5NO2, Peso molecolare: 75,07 g/mol, Polvere cristallina bianca, 5 kg</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, Peso molecolare: 58,44 g/mol, 5 kg</td></tr><tr><td>di fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, Peso molecolare: 119,98 g/mol, 500 g</td></tr><tr><td>Soluzione tamponata con fosfato 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>Senza calcio e magnesio, 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm Piatto per colture cellulari trattato con TC</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>Piastra per colture cellulari da 60 mm, polistirene trattato con TC, 20/confezione,</td></tr><tr><td>sterile Falcon 60 mm x 15 mm Piastra di Petri</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>Piastra di Petri batteriologica non trattata con TC, 20/confezione</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 pozzetti, fondo piatto (confezionato singolarmente), irradiata con raggi gamma, area di crescita 9,5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; pallone per colture tissutali</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2; Pallone per colture cellulari con collo inclinato a forma di U con tappo di chiusura Pierce</td></tr><tr><td>&trade; Protein L Plus Agarosio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, agarosio perlato al 6% reticolato (CL-6B), capacità legante: da 10 a 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricato</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10 pozzetti, 50 &; l, per l'uso con celle di elettroforesi Mini-PROTEAN</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF, 0,45 &; m, rotolo da 26,5 cm x 3,75 m</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-acido polisialico-NCAM, clone</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 microlitri, Ospite: topo, monoclonale IgM</td></tr><tr><td>4x tampone campione Laemmli</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x tampone campione di proteine premiscelate</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, puro al 98%, 14,2</td></tr><tr><td>M Endoneuraminidasi-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 microlitri, 200 & micro; g/ml, 3.500 U/mg</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti da 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Cerchi n. 1; Spessore: da 0,13 a 0,17 mm; Dimensioni: 25 mm</td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml, senza calcio, magnesio, fenolo rosso</td></tr><tr><td>papaina</td><td>Worthington Biochemical Cooperation</td><td>LS003119</td><td>polvere liofilizzata, 100 mg</td></tr><tr><td>di solfato di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M-2643-500G</td><td>polvere, 500 g</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml, 200 mM&nbsp;</td></tr></tbody></table>

legame dell&#39;anticorpo specificità per kappa (vκ) umani (igm) anticorpi catena contenenti chiari: polysialic acid (psa) allegato alla ncam come caso di studio

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Gli anticorpi dell'isotipo IgM sono spesso trascurati come potenziali terapie negli studi sull'uomo, nei modelli animali di malattie umane e come agenti di rilevamento nelle tecniche standard di laboratorio. Al contrario, diverse IgM umane hanno dimostrato la loro efficacia in modelli tumorali e modelli di disturbi del SNC, tra cui la sclerosi multipla (SM) e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Le ragioni della loro mancanza di considerazione includono difficoltà nell'esprimere, purificare e stabilizzare gli anticorpi IgM, difficoltà nell'identificare antigeni (non proteici), basso legame di affinità e lacune di conoscenza fondamentali nella ricerca sui carboidrati e sui lipidi. 
Questo manoscritto utilizza HIgM12 come esempio per fornire un protocollo dettagliato per rilevare antigeni mediante Western blotting, immunoprecipitazioni e immunocitochimica. HIgM12 ha come bersaglio l'acido polisialico (PSA) attaccato alla molecola di adesione delle cellule neurali (NCAM). Per valutare l'importanza di NCAM per il legame a HIgM12 è stato utilizzato tessuto cerebrale di topo di topo wild type (WT) e NCAM knockout (KO) privo delle tre principali varianti di splicing del sistema nervoso centrale (SNC) NCAM180, 140 e 120. Un'ulteriore digestione enzimatica del tessuto del SNC e delle cellule del SNC in coltura utilizzando endoneuraminidasi ci ha portato a identificare il PSA come l'epitopo di legame specifico per HIgM12.

Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti studiando IgM specifici PSA-antigeni umani nel SNC. viene mostrato l&#39;uso di anticorpi IgM umani contenenti specifiche catene leggere Vκ in contesti biochimici e di immunocitochimica fluorescenti. HIgM12 immunoprecipita suo antigene da lisati cerebrale cervello e agisce come un agente (anticorpo primario) di rilevamento in Western blot. Nessuno dei due anticorpi controllo isotipico né L perline agarosio immunoprecipitato un antigene simile, il che dimostra la specificità del tirare verso il basso (Figura 1). Western blot utilizzando SNC lisati da topi WT e KO NCAM dimostrano la specificità del HIgM12 vincolante per PSA contenenti NCAM (Figura 2A). Digestione enzimatica del sistema nervoso centrale del tessuto da topi WT utilizzando ENDO-NF identifica PSA attaccato al NCAM come specifico epitopo vincolante per HIgM12 (Figura 2B). Utilizzando il metodo descritto qui, ratto IBA-1-positive colture microgliali di elevata purezza sono ottenuti (Figura 3). Disponibile in commercio anticorpo anti-PSA (clone 2-2B) non etichetta superficie cellulare o piscine interne PSA nel fisso e permeabilizzate cellule microgliali IBA-1-positivi al microscopio a fluorescenza. In linea con la letteratura pubblicata in precedenza, che riporta nessuna espressione sulla superficie cellulare di PSA-NCAM nelle cellule microgliali 16,41 HIgM12 non etichettare antigeni di superficie delle cellule di microglia di ratto purificati. È interessante notare che l&#39;etichettatura HIgM12 dei risultati microglia fisse e permeabilizzate in un intracellulare, modello perinucleare che non si limita a organelli specifici (Figura 3). I risultati sono in contrasto con quelli ottenuti usando un anticorpo anti-IgG PSA (clone 735) 26, che si rivolge PSA-SynCAM in microglia a livello del Golgi 41. In contrasto con la microglia, HIgM12e antigeni di superficie delle cellule bersaglio A2B5 in culture di ratto OPC altamente arricchito in condizioni di cellule vive (Figura 4). Culture OPC contengono ~ 5% contaminare cellule microgliali. La Figura 5 illustra un modello praticamente identico superficie cellulare colorazione tra il HIgM12 e anti-PSA monoclonale (clone 2-2B) in GFAP-positivi astrociti (Figura 5A). Etichettatura immunofluorescenza degli astrociti WT ENDO-NF-digerito rispetto al buffer di controllo trattati con astrociti WT utilizzando HIgM12 dimostra la presenza di PSA astrociti (Figura 5B). La presenza degli astrociti PSA-positivi in vivo deve ancora essere confermata. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> Figura 1: HIgM12 agisce come un &quot;pull-down&quot; Agente in immunoprecipitazione immunoprecipitazione dal lisato totale del cervello di tre mesi di età topi utilizzando HIgM12, controllo isotipico umana HIGM.126 o agarosio L perline solo come agenti &quot;a tendina&quot;. proteine ​​eluite sono state eseguite in Western blot con membrane esplorati contro HIgM12. pesi molecolari delle proteine ​​eluite da perline HIgM12 rivestite erano nella gamma di 160 - 200 kDa oltre alla IgM catena pesante (~ 65 - 73 kDa). Questo dato è stato modificato da J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> Figura 2: Obiettivi HIgM12 l&#39;acido Polysialic (PSA) Moiety su NCAM. A. omogenati di cervello da P7, P13, P16 e P27 NCAM totali topi KO e controlli littermate eterozigoti sono stati eseguiti in Western blot con membrane sondato contro HIgM12, PSA e β-actina come controllo di caricamento. <strong&gt; B. 10 ug di adulti WT cervello di topo lisato in 1% NP40 in PBS, pH 6,5 è stata trattata con endoneuraminidase N (endo-N) (eso) neuraminidasi con α2-3 specificità polimero acido polysialic (sialidasi) o PBS notte a 37 ° C, eseguito come doppietti in Western blot e sondato contro HIgM12, PSA e β-actina come controllo di caricamento. Questo dato è stato modificato da J. Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> Figura 3: l&#39;assenza di PSA su Rat microglia si riflette da una mancanza di HIgM12 Labeling microglia di ratto sono state coltivate per 48 ore in poli-D-lisina rivestite coprioggetto di vetro e sia etichettato in diretta su ghiaccio con HIgM12 o dopo la fissazione con HIgM12 o anti. -PSA mAb (clone 2-2B). Le cellule sono state triple etichettato con microglia marcatore IBA-1 (verde), HIgM12 / PSA (rosso) e DAPI (blu). Le immagini mostrano la mancanza di superficie delle cellule microgliali legame con HIgM12 (riga superiore) e la mancanza di anti-PSA vincolante (clone 2-2B) alla superficie delle cellule e negozi interni nel ratto primaria microglia (fila inferiore). Basata sulla morfologia bipolare e assenza di IBA-1 colorazione, piccola cella PSA-positivi (fila inferiore) è stato suggerito come un OPC. Nelle cellule fisse, HIgM12 colorazione determinato un punctated, modello perinucleare che non è stato limitato a organelli specifici ed è stato considerato vincolante non specifico (riga centrale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> Figura 4: HIgM12 Obiettivi cellulari di superficie PSA-NCAM su Rat OPC OPC Rat e microglia erano cultu.rosso per 4 giorni in media proliferazione su vetrini rivestiti di poli-D-lisina e tripla etichettati in diretta su ghiaccio con HIgM12 o A2B5 (verde), indicatore interno macrofagi / monociti CD68 (clone ED-1) (rosso) e DAPI (blu) . Le immagini mostrano le popolazioni di cellule majorly positivo per l&#39;indicatore OPC A2B5 (riga superiore) e HIgM12 (fila inferiore) con poche microglia CD68-positivo (~ 5%). Contrasto di fase e le immagini DAPI sono stati aggiunti per rivelare l&#39;integrità delle cellule e il numero di cellule per ogni popolazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> Figura 5: HIgM12 e anti-PSA mAb co-label una sottopopolazione di astrociti in mouse misto Glia. A. mouse misti cellule gliali da WT e NCAM totali animali KO contenenti astrociti, cellule oligodendrociti-lignaggio e microglia sono state coltivate per 3 giorni ed etichettato in diretta su ghiaccio con HIgM12 (verde), anti-PSA monoclonale (clone 2-2B) (rosso) e, successivamente, per il marcatore astrociti GFAP (viola) e DAPI (blu). HIgM12 e anti-PSA rivelano un pattern di colorazione identica virtuale su astrociti GFAP WT-positivi, ma la mancanza di legame di astrociti in coltura provenienti da topi KO NCAM. Questo dato è stato modificato da J. Neurochem. 15. B. glia misti sono stati coltivati ​​in modo identico come descritto al punto A. e trattati durante la notte con endoneuraminidase-NF (gentilmente fornito dal Dr. Martina Muehlenhoff) o il controllo PBS. Le cellule sono state etichettate in diretta su ghiaccio con HIgM12 (verde) e successivamente colorate per i marcatori GFAP interna (rosso) e DAPI (blu). HIgM12 obiettivi antigeni di superficie delle cellule in PBS-controllo trattati culture gliali miste, ma non endoneuraminidase-NF trattati glia misto. Questa cifra è stata modificata da JNSCI 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Pl</a>facilità clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Tutte le immagini sono state prese a 60X di ingrandimento utilizzando le stesse impostazioni dello strumento e trattati in modo identico. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> Tabella 1:. Tampone e soluzione Ricette <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">Cliccate qui per scaricare questa tabella.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> il tessuto del sistema nervoso centrale </td><td> ENDO-NF / PBS </td><td> tampone di lisi </td><td> Volume totale </td></tr><tr><td> 1. topo WT </td><td> 67 mg (0,45 ml) </td><td> 2 ml (12 mg) ENDO-NF </td><td> 7.55 ml </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 2. topo WT </td><td> 67 mg (0,45 ml) </td><td> 2 l di PBS </td><td> 7.55 ml </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 3. topo WT </td><td> 67 mg (0,45 ml) </td><td> nessun PBS o ENDO-NF </td><td> 9.55 ml </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 4. NCAM KO topo </td><td> 67 mg (0,45 ml) </td><td> 2 ml (12 mg) ENDO-NF </td><td> 7.55 ml </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 5. NCAM KO topo </td><td> 67 mg (0,45 ml) </td><td> 2 l di PBS </td><td> 7.55 ml </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 6. NCAM KO topo </td><td> 67 mg (0,45 ml) </td><td> nessun PBS o ENDO-NF </td><td> 9.55 ml </td><td> 10 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 2: ENDO-NF digestione del tessuto del sistema nervoso centrale da topi WT e P7 NCAM KO.

Presentiamo un protocollo per identificare frazioni proteiche contenenti antigeni per anticorpi IgM umani e murini con catene leggere kappa (Vκ) specifiche. Questo protocollo non si limita agli anticorpi della classe IgM, ma si applica a tutti gli isotipi di immunoglobuline che prendono di mira il loro antigene con un'affinità sufficientemente elevata durante le immunoprecipitazioni.

Legame dell&#39;anticorpo Specificità per Kappa (Vκ) umani (IgM) Anticorpi catena contenenti chiari: Polysialic Acid (PSA) Allegato alla NCAM come caso di studio

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare antigeni per anticorpi con potenziale terapeutico, concentrandosi sull'isotipo IgM. Questo metodo colma un'importante lacuna nel campo biomedico e potrebbe contribuire a identificare nuovi biomarcatori e agenti immunoterapici per la ricerca sul cancro e sulle malattie del sistema nervoso centrale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che apre la strada a una classe di anticorpi finora trascurata, ma con notevole potenziale terapeutico.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle diagnosi e al trattamento di tutte le malattie che possono essere bersagliate da terapie a base di anticorpi. Questo metodo può fornire informazioni sugli antigeni degli anticorpi IgM e sui tessuti in crescita e sulle sottocolture. Può inoltre essere applicato ad altri isotipi di anticorpi provenienti da tutte le specie.L'idea per questo metodo mi è venuta quando ho notato un legame specifico e marcato dell'anticorpo IgM in diverse applicazioni biochimiche. A dimostrare la procedura saranno Robert Kahoud e Jens Watzlawik. Per iniziare questa procedura, effettuare un taglio sul cranio in direzione anteriore a livello delle orecchie e sollevare il cranio.Quindi, posizionare delicatamente il cervello in un tubo da 15 millilitri e conservarlo immediatamente su ghiaccio secco. Dopo cinque minuti, trasferire il cervello su un foglio pulito per pesate e rimuovere rapidamente il cervelletto e il tronco encefalico utilizzando una lama di rasoio pulita. Successivamente, pesare il cervello congelato prima di trasferirlo nuovamente nel tubo da 15 millilitri posto sul ghiaccio.Aggiungere il buffer di lisi freddo di ghiaccio fino a raggiungere una concentrazione finale di 150 microgrammi di tessuto cerebrale per microlitro di buffer di lisi. Successivamente, omogeneizzare il cervello nel buffer di lisi mediante trituration attraverso una punta da pipetta da un millilitro, seguita da trituration attraverso una siringa da cinque millilitri dotata di un ago da 27 gauge. Dopo di ciò, incubare il lisato cerebrale per ulteriori 30 minuti sul ghiaccio per consentire una completa lisi del tessuto.Dopo 30 minuti, rimuovere il detergente, il materiale insolubile e i lipidi cerebrali mediante centrifugazione in serie. Scartare il pellet contenente la mielina e i detriti cellulari, ma conservare il soprannatante dopo ogni passaggio di centrifugazione. Aliquotare il lisato cerebrale e conservare a 80 gradi Celsius.In questo passaggio, preparare 200 millilitri di IP Buffer con BSA e altri 200 millilitri di IP Buffer senza BSA. Per la reazione di immunoprecipitazione, trasferire 100 microlitri di sospensione di agarosio Protein L in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di IP Buffer con BSA alla provetta.Quindi, mescolare manualmente per inversione. Successivamente, lavare le perle di agarosio Protein L quattro volte mediante centrifugazione. Dopodiché, rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet di agarosio e ripetere la procedura di lavaggio altre tre volte.Quindi, aggiungere IP buffer fresco contenente BSA all'agarosio Protein L e incubare durante la notte su un rullo a quattro gradi Celsius. In 800 microlitri di IP buffer contenente BSA e 30 milligrammi di tessuto cerebrale lisato, aggiungere 20 microgrammi di anticorpo sperimentale, anticorpo di controllo o PBS. Incubare 30 milligrammi di tessuto cerebrale lisato in IP buffer ghiacciato con anticorpo IgM in un tubo microcentrifugo da 1,5 millimetri durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, centrifugare le perle di agarosio con Proteina L in una centrifuga da banco. Scartare il soprannatante senza disturbare il pellet di agarosio. Successivamente, aggiungere la soluzione di lisato cerebrale con anticorpo raffreddata all'agarosio con Proteina L.Incubare la sospensione di anticorpo-antigene con agarosio Proteina L per due ore su un rullo a quattro gradi Celsius. Dopo due ore, lavare il complesso anticorpo-antigene legato all'agarosio L mediante centrifugazione. Scartare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet e aggiungere un millilitro di buffer IP freddo di ghiaccio contenente 0,2% di BSA.Ripetere il passaggio di lavaggio un’altra volta utilizzando il buffer IP freddo di ghiaccio contenente lo 0,2% di BSA e altre due volte utilizzando il buffer IP freddo di ghiaccio senza BSA. Successivamente, centrifugare il complesso anticorpo-antigene legato all’agarosio L. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per eliminare il soprannatante fino a quando rimangono circa 50 microlitri di soluzione sopra il pellet di agarosio Protein L. Quindi, utilizzare una pipetta da 10 microlitri per rimuoverlo completamente.Mantenere tutti i campioni sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di buffer di eluizione per immunoprecipitazione a ciascun tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Agitare leggermente il tubo con le dita per sei volte e riscaldarlo per cinque minuti a 95 gradi Celsius.Successivamente, posizionare il campione sul ghiaccio per due minuti e centrifugarlo per 30 secondi. Poi, trasferire 35 microlitri del soprannatante in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 millimetri senza disturbare il pellet. Successivamente, verificare l'assenza di perle di agarosio Protein L risciacquando una piccola quantità di campione diluito lungo la parete interna della provetta.Se sono presenti perle di agarosio con proteina L, centrifugare il campione per altri 30 secondi a 13.000 ×g e trasferire il soprannatante in una provetta pulita. Ripetere questo passaggio fino a quando non si rilevano più perle di agarosio. Successivamente, caricare 10-20 microlitri di campioni diluiti per pozzetto su un gel di poliacrilamide SDS utilizzando un sistema tampone tris-glicina SDS ed eseguire l'elettroforesi per circa un'ora a 100 volt su un apparato in condizioni di laboratorio senza raffreddamento aggiuntivo.Successivamente, trasferire le proteine su una membrana in PVDF. Il trasferimento delle proteine avviene per due ore e mezza in stanza fredda a 100 volt utilizzando un buffer di trasferimento freddo. Bloccare la membrana con polvere di latte in polvere al 10% (peso/volume) in PBS-T per un'ora a 25 gradi Celsius su un agitatore orbitale da banco.Lavare due volte per 10 minuti ciascuna con PBS-T. Incubare la membrana con l'anticorpo primario in PBS-T contenente BSA al 5%. Incubare su un agitatore orbitale in frigorifero durante la notte.Il mattino seguente, lavare la membrana una volta con PBS-T in eccesso a 25 gradi Celsius, seguito da tre lavaggi con PBS-T per 10 minuti ciascuno su un agitatore orbitale. Successivamente, aggiungere l'anticorpo secondario e il 5% di latte in polvere disidratato in PBS-T alla membrana e incubare per un'ora a 25 gradi Celsius su un agitatore orbitale. Dopo di ciò, lavare la membrana una volta con PBS-T in eccesso a 25 gradi Celsius, seguito da tre lavaggi con PBS-T per 10 minuti ciascuno su un agitatore orbitale.Mescolare un millilitro del componente A del substrato HRP per chemiluminescenza potenziata refrigerato con un millilitro del componente B a 25 gradi Celsius. Trasferire la membrana su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi, asciugare il contenitore con tovaglioli di carta prima di riposizionare la membrana al suo interno.Aggiungere immediatamente due millilitri del substrato HRP per chemiluminescenza potenziata già miscelato alla membrana e incubare per due minuti a 25 gradi Celsius. Inclinare manualmente il contenitore ogni 20 secondi per inumidire uniformemente la membrana. Successivamente, trasferire la membrana in una busta di plastica trasparente ed eliminare il liquido in eccesso e le bolle d'aria con carta da filtro.Fissare con del nastro adesivo la guaina di plastica nella cassetta e chiuderla. Questa figura mostra che HigM12 immunoprecipita il suo antigene dai lisati cerebrali e agisce come agente di rilevamento nei blot di Western. Nessuno dei controlli con anticorpi di isotipo né le perle di agarosio L immunoprecipitano un antigene simile, dimostrando così la specificità dell'immunoprecipitazione.Qui, i blotting occidentali eseguiti con lisati del SNC di topi di tipo selvaggio e di topi knock-out per NCAM dimostrano la specificità del legame di HIgM con NCAM contenente PSA. La digestione enzimatica del tessuto del SNC di topi di tipo selvaggio mediante ENDO-NF identifica PSA legato a NCAM come l'epitopo specifico per il legame di HIgM12. Utilizzando il metodo descritto in questo articolo, si ottengono colture di microglia di ratto positive per IBA-1 con elevata purezza. In contrasto con la microglia, gli antigeni di superficie cellulare riconosciuti da HIgM12 e A2B5 risultano fortemente arricchiti nelle colture di OPC di ratto in condizioni di cellule vive.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro 13 ore lavorative. Seguendo questa procedura, altri metodi come Biacore o la tecnologia di risonanza plasmonica di superficie possono essere impiegati per identificare le affinità di legame degli anticorpi e le costanti di associazione e dissociazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro, delle immunoterapie e degli autoanticorpi naturali, permettendo di identificare epitopi carboidratici su proteine come antigeni per anticorpi IgM terapeutici nell'uomo.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare antigeni glicoproteici per lavori di ricerca contenenti anticorpi IgM umani. I dati forniscono un nuovo bersaglio per la terapia della sclerosi multipla. PSA ENCAP, il trattamento con anticorpi da noi sviluppato, è uno dei primi a mostrare un miglioramento funzionale in una scatola di attività utilizzando il modello rigoroso presente nella malattia e in condizioni simili alla sclerosi multipla.

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Legame dell'anticorpo Specificità per Kappa (Vκ) umani (IgM) Anticorpi catena contenenti chiari: Polysialic Acid (PSA) Allegato alla NCAM come caso di studio

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