Name: Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Scopri come generare virus vaccinia mutanti con CRISPR-Cas9 per ricerca biomedica e terapia genica. Questo metodo aumenta l'efficienza di ricombinazione oltre 100 volte rispetto ai protocolli convenzionali.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione MRC DPFS (MR/M015696/1) e dal Ministero delle Scienze e della Tecnologia della Cina (2013DFG32080).

1. Preparazione di Target RNA e Cas9 costrutti e riparazione donatore vettore <ol><li> Clonazione di gRNAs <ol><li> Progettare una guida-RNA sequenza bersaglio mira il gene N1L di virus del vaccino seguendo il principio affermato in precedenza 25. Allineare la sequenza bersaglio guida-RNA contro il genoma del virus del vaccino (in questo caso, Lister ceppo di virus del vaccino) per escludere eventuali sequenze bersaglio gRNA centra la porta. </li><li> Sintetizzare e clonare oligos gRNA in un vettore di clonaggio gRNA come descritto in precedenza 25. Confermare la sequenza di ogni singolo gRNA nel vettore risultante dal sequenziamento Sanger 33. Nome risultante gRNA costruire come gRNA N2 33. NOTA: Il sito target gRNA è all&#39;interno del gene N1L, ed è nella regione tra il braccio sinistro e il braccio destro che le coperture vettore riparazione donatori (vedi Figura 1). </li></ol></li><li> Clonare il gene Cas9 manca il segnale di localizzazione nucleare (NLS) nelpST1374 vettoriale e designare il costrutto come PST-Cas9 33. NOTA: Qualsiasi mammiferi espressione vettore di clonaggio può essere utilizzato per la costruzione del vettore di espressione Cas9. </li><li> Costruzione di vettore di riparazione dei donatori per HR <ol><li> Utilizzare il gene N1L di VV come la regione di destinazione per la modifica 33. Assicurarsi che le lunghezze dei bracci destro e sinistro sono circa 500-600 bp ciascuno, e che fiancheggia la regione di destinazione. NOTA: Il braccio / braccio destro sinistro può avere fino a 50 bp sovrapposizione con la regione di destinazione (vedi figura 1). </li><li> Clonare la regione di riparazione vettore donatore N1L come descritto in precedenza 33, 34 e designare il vettore donatore di riparazione come PT-N1L. NOTA: Vedere la Figura 1 per il vettore di riparazione donatore e la sua regione di destinazione. Altre regioni del VV possono essere mirati utilizzando regione (gene) SPECIFICI gRNA (s) e vettoriale riparazione donatore specifici per regione. Qualsiasi vettore di clonaggio può essere utilizzato per la costruzione del vettore riparazione donatore. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> L&#39;espansione del plasmide <ol><li> Trasformare il plasmide in E. chimicamente competente coli secondo le istruzioni del produttore. Purificare il plasmide usando un kit di estrazione plasmide riferimento al protocollo fornito dal produttore. </li></ol></li></ol> 2. Le cellule Semina (Giorno 1) <ol><li> Mantenere CV-1 cellule (fibroblasti di rene di scimmia) in Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con siero 5% bovino fetale (FBS), 100 U / mL di penicillina, e 100 mg / streptomicina mL, a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Trypsinize CV-1 le cellule che sono 80-90% confluenti <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura cellulare dal pallone T-175 contenenti cellule CV-1. Risciacquare il monostrato con 5 ml di PBS sterile per rimuovere il siero residuo e aspirare il PBS. Aggiungere 2,5 mL di soluzione 1 × tripsina-EDTA per coprire le cellule e mettere il pallone in 37 ° C incubatore per circa 5 minuti per aiutare il distacco delle cellule. </li><li> Aggiungere10 ml di terreno di coltura cellulare (vedi punto 2.1) di sospendere le cellule delicata azione pipetta. Contare le numero di cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Semina cellule in 6 pozzetti <ol><li> Seed 2 × 10 5 CV-1 cellule in 2 ml di mezzo di coltura cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti il giorno prima della transfezione. NOTA: Un passo ulteriore centrifugazione per rimuovere tripsina non è richiesta. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Trasfezione di Cas9 plasmidi e gRNA plasmidi (2 ° giorno) <ol><li> Trasfezione CV-1 le cellule (previste al punto 2.2.3.1) con 0,5 mcg PST-Cas9 plasmide e 0,5 mg gRNA N2 plasmide usando un reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Incubare le cellule per 24 h in un incubatore (37 ° C con 5% CO 2), e quindi sostituire il mezzo con 2 ml di terreno di coltura cellulare fresca (descritto nel passaggio 2.1). </li></ol> 4. L&#39;infezione di CV-1 le cellule e navetta donatore Vettore Transfection per HR (3 ° giorno) <ol><li> Diluire il virus VVL15 backbone con terreno di coltura cellulare DMEM ad una concentrazione di 2 x 10 5 pfu / ml. 24 ore dopo la trasfezione di Cas9 e gRNA plasmidi, aggiungere 100 ml di virus diluito in ciascun pozzetto del CV-1 cellule transfettate. </li><li> infezioni post-virus di 2 h, trasfezione 1,0 mcg navetta vettore nelle cellule del donatore VVL15 infette per HR utilizzando un reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore. Collocare le cellule trasfettate in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 per 24 h. </li></ol> 5. raccogliere il virus ricombinante (4 ° giorno) <ol><li> Dopo 24 ore di trasfezione con il vettore shuttle donatori per HR nella fase 4.2, staccare le cellule trasfettate CV-1 con un raschietto cellulare. Raccogliere la sospensione cellulare in un esageratamente e conservare a -80 ° C per un uso futuro. NOTA: Rimuovere eventuali fuoriuscite di coltura cellulare di media con un disinfettante immediatamente e quindi pulire di nuovo con il 70% Ethanolo. </li></ol> 6. Purificazione della VV Modified (primo turno) <ol><li> Il giorno 1, seminare 15 6 pozzetti con 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto. <ol><li> Il giorno 2, scongelare la sospensione di cellule congelate dal punto 5.1 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 3 min e agitare le cryovials vigorosamente per 30 s per ottenere lisato cellulare senza rimuovere detriti cellulari. </li></ol></li><li> Per l&#39;infezione di una piastra da 6 pozzetti di CV-1 cellule, diluire 1 ml di lisato cellulare con 3 ml di DMEM e aggiungere 0,5 ml di lisato cellulare diluita in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti, sulla parte superiore del supporto già presente. Infettare tutti i 6 pozzetti previste al punto 6.1. NOTA: La rimozione di detriti cellulari non è necessaria. </li><li> Dopo due giorni di infezione (vale a dire, il giorno 4), identificare le placche RFP-positivi sotto un microscopio a fluorescenza utilizzando 10X lente obiettiva ed etichettare le placche sotto la piastra utilizzando un pennarello cerchiando la posizione della placca. NOTA: Vedere <strong&gt; Figura 3 per rappresentante placca RFP-positivo. <ol><li> Preparare sei cryovials etichettati contenenti 200 microlitri DMEM mezzo di coltura cellulare senza siero per raccogliere sei diverse placche RFP-positivo. Aspirare il terreno di coltura cellulare dal pozzo con targa marcato (s) (passo 6.3). Fissare una punta di 200 microlitri di una pipetta P200, impostare il volume a 30 ml e prendere ~ 10 microlitri terreno di coltura cellulare da un esageratamente. </li><li> Tenere premuto il pulsante pipetta spinta senza rilasciare il medio e utilizzare la punta di graffiare la superficie di una placca etichettati. Rilasciare il tasto pipetta spinta per sollevare le cellule staccate e trasferirlo nel esageratamente contenente 190 ml di DMEM senza siero. </li><li> Prendere un altro 10 microlitri di media dalla fiala con le cellule graffiati (da ultimo passo) e ripetere la procedura di prendere in mano la stessa RFP-positivo targa tre volte quello di raccogliere il maggior numero di cellule graffiati possibile. Trasferire tutte le celle nella stessa fiala e conservare il flacone a -80 ° C. </ol></li></ol> 7. Purificazione della VV Modified (secondo turno) <ol><li> Seed 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto di sei 6 pozzetti e la cultura le cellule per 24 h. </li><li> Scongelare i cryovials congelati (dal punto 6.3.3) a 37 ° C bagnomaria per 3 minuti, poi vortice i cryovials vigorosamente per 30 secondi per ottenere lisato cellulare. <ol><li> Aggiungere 0,5 ml di lisato cellulare mista ad un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Infettare un 6-pozzetti per ogni placca. Incubare le piastre 6 pozzetti VV-infettati a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 giorni (Seconda purificazione placca turno). Quindi ripetere paragrafo 6.3. NOTA: Più di sei placche RFP-positivi possono essere ritirati; due o più piastre da 6 pozzetti possono essere utilizzati per la purificazione di ogni placca. </li></ol></li></ol> 8. cicli di placca Purizione <ol><li> Continuare altri tre a cinque cicli di purificazione seguendo lo stesso protocollo descritto nel passaggio 7 finché tutte le placche formate da una placca positiva sembrano essere RFP-positive al microscopio. NOTA: Questa targa, allora è considerato puro. </li><li> Una volta che la placca è pura (figura 4, tutte le cellule infette che esprimono RFP), raccogliere una targa positivo in un esageratamente e conservare a -80 ° C, come descritto nel paragrafo 6.3. Verificare la placca secondo il protocollo descritto nella fase 9 e 10. </li></ol> 9. Espandere la placca purificata (s) <ol><li> Seed 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto di un 6-pozzetti un giorno prima infezione da virus. </li><li> Scongelare il esageratamente congelata da 8,2 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 3 minuti per ottenere lisato cellulare. Aggiungere tutto il lisato (senza rimuovere i detriti cellulari) in un pozzetto di un 6-pozzetti di CV-1 le cellule (testa di serie nella fase 9.1). Incubare il CV-1 le cellule infette a 37 ° C con 5% CO 2 per 3 giorni. <ol><li> Espandere tutte le targhe pulite (almeno tre placche). NOTA: Il tempo di infezione varia da 1-3 giorni a seconda della quantità di virus nel lisato. </li></ol></li><li> Raccogliere le cellule VV-infettate con un raschietto cellulare quando più di 50 cellule% mostrano effetto citopatico osservato al microscopio (le cellule sono arrotondati, facilmente distaccato e RFP positivo). Raccogliere le cellule staccate insieme con mezzo di coltura cellulare in una provetta da 15 ml. <ol><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 g per 3 min. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet cellulare a -80 ° C fino all&#39;utilizzo o utilizzare il pellet cellulare immediatamente passaggio 10. </li></ol></li></ol> 10. Verifica della modifica di Mutant VV Usando PCR <ol><li> Estratto VV DNA dal pellet cellulare preparato al punto 9.3.1 utilizzando un kit di estrazione del DNA seguendo il protocollo del produttore. Eluire il DNA con 200 ml di acqua bidistillata. NOTA: utilizzare metà del volume del pellet per estrarre DNA e tenere il resto per la produzione virale se il clone è verificato come contenente la corretta modifica / inserimento. </li><li> Verifica della delezione del gene N1L e l&#39;inserimento di geni RFP nella regione N1L. <ol><li> Amplificare un frammento di DNA che attraversa il gene N1L (L025) e la L026 gene utilizzando primer disegnati contro il gene N1L. Amplificare il gene RFP utilizzando primer specifico d&#39;RFP. Amplificare un frammento di DNA di controllo si estende A52R mediante PCR utilizzando primer specifici A52R. NOTA: vedere elenco dei materiali per primer specifici. <ol><li> Eseguire la PCR utilizzando un kit master mix PCR. Impostare 25 microlitri di reazione PCR utilizzando 2 ml di DNA stampo, denaturare la reazione di PCR a 94 ° C per 2 minuti, e quindi eseguire 30 cicli di PCR seguendo questi passaggi: denaturare il DNA a 94 ° C per 15 s, poi ricottura i primer ai modelli di DNA a 52 ° C per 15 s estendono la reazione PCR a 72 ° C per 30 s. </li></ol></li></ol></li><li> Risolvere i prodotti di PCR utilizzando un gel 1% 33. Acquisire l&#39;immagine del gel utilizzando un documento di gel UV. Se il N1L PCR è negativo e A52R e RFP PCR sono positivi, allora la placca viene correttamente modificata nella regione N1L. </li></ol>

<ol><li>Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompletely+base-paired+flip-flop+terminal+loops+link+the+two+DNA+strands+of+the+vaccinia+virus+genome+into+one+uninterrupted+polynucleotide+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain.</a> Cell. 28, 315-324 (1982).</li>
<li>Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+MT+%22Brock+biology+of+microorganisms%2C+9th+edn%22">Brock biology of microorganisms, 9th edn</a>. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).</li>
<li>Cooney, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+and+immunological+response+to+a+recombinant+vaccinia+virus+vaccine+expressing+HIV+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein.</a> Lancet. 337, 567-572 (1991).</li>
<li>Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+recombinants%3A+expression+of+VSV+genes+and+protective+immunization+of+mice+and+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle.</a> Science. 227, 433-435 (1985).</li>
<li>Legrand, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+potent+humoral+and+cell-mediated+immune+responses+by+attenuated+vaccinia+virus+vectors+with+deleted+serpin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes.</a> J Virol. 78, 2770-2779 (2004).</li>
<li>Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+live+vaccines+by+using+genetically+engineered+poxviruses%3A+biological+activity+of+recombinant+vaccinia+virus+expressing+influenza+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin.</a> Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).</li>
<li>Wiktor, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+from+rabies+by+a+vaccinia+virus+recombinant+containing+the+rabies+virus+glycoprotein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene.</a> Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).</li>
<li>Gallucci, S., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danger+signals%3A+SOS+to+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Danger signals: SOS to the immune system.</a> Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).</li>
<li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+model%3A+a+renewed+sense+of+self%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The danger model: a renewed sense of self.</a> Science. 296, 301-305 (2002).</li>
<li>Guo, Z. S., Bartlett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+as+a+vector+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vaccinia as a vector for gene delivery.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).</li>
<li>Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxviruses+as+vectors+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Drug+Discov+Devel%22%5BJournal%5D)">Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy.</a> Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).</li>
<li>Tysome, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lister+strain+of+vaccinia+virus+armed+with+endostatin-angiostatin+fusion+gene+as+a+novel+therapeutic+agent+for+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer.</a> Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).</li>
<li>Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+poxvirus+oncolytic+effects+through+increased+spread+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion.</a> Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).</li>
<li>Park, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus%2C+JX-594%2C+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer%3A+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li>
<li>Panicali, D., Paoletti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+poxviruses+as+cloning+vectors%3A+insertion+of+the+thymidine+kinase+gene+from+herpes+simplex+virus+into+the+DNA+of+infectious+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus.</a> Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).</li>
<li>Ball, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+homologous+recombination+in+vaccinia+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.</a> J Virol. 61, 1788-1795 (1987).</li>
<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).</li>
<li>Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+that+are+associated+with+DNA+repeats+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.</a> Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).</li>
<li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li>
<li>van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+Cas9+endonucleases+reveal+RNA-mediated+conformational+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation.</a> Science. 343, 1247997(2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+targeted+editing+of+large+viral+genomes+by+RNA-guided+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases.</a> PLoS Pathog. 10, 1004090(2014).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+scarless+human+stem+cell+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of scarless human stem cell genome editing.</a> Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via+Cas9%2FRNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156, 836-843 (2014).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Res. 24, 122-125 (2014).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> J Virol. 89, 5176-5179 (2015).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+marker-free+system+for+highly+efficient+construction+of+vaccinia+virus+vectors+using+CRISPR+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035(2015).</li>
<li>Merchlinsky, M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+foreign+DNA+into+the+vaccinia+virus+genome+by+in+vitro+ligation%3A+recombination-independent+selectable+cloning+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors.</a> Virology. 190, 522-526 (1992).</li>
<li>Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+recombinant+vaccinia+viruses+using+PUV-inactivated+virus+as+a+helper%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper.</a> Biotechniques. 31, 534-540 (2001).</li>
<li>Johnson, R. D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand-break-induced+homologous+recombination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells.</a> Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ci sono due obiettivi principali di modifica della VV a fini terapeutici. Uno è quello di eliminare un particolare gene, come il gene della timidina chinasi (TK) per attenuare virus per antitumorale uso terapeutico. L&#39;altro è di armare VV con un gene desiderato terapeutico (come GM-CSF) o un gene marcatore (ad esempio gene luciferasi). Il raggiungimento di uno di questi comporta la soppressione di una regione bersaglio / gene. Un metodo di legatura del DNA diretto 35 e un metodo in vitro confezione 36 sono state usate in precedenza per generare virus vaccinia mutanti con modifiche gene TK. Tuttavia, questi metodi hanno limitato l&#39;applicazione relativa mutazione altre regioni del genoma a causa della mancanza di siti di enzimi di restrizione unici in tutto il genoma. L&#39;attuale approccio per la creazione di VV mutante comporta trasfezione di un vettore shuttle (donatore) con un indicatore di selezione (RFP o GFP) in CV-1 le cellule due ore dopo l&#39;infezione con VV per indurre una incorporati ricombinazione omologang il marcatore di selezione nella regione di destinazione. Selezione di placche marcatori positivi è seguito da loro purificazione 24 h post-trasfezione. Il processo di purificazione placca può durare fino a 10 giri, ultime 3-4 settimane e spesso porta a virus ricombinanti indesiderate con marcatori di selezione inseriti nelle regioni fuori bersaglio. DNA rotture del doppio filamento possono indurre efficacemente ricombinazione omologa in cellule di mammifero 37, e sfruttando questo meccanismo, l&#39;efficienza di generazione VV mutante possono essere notevolmente migliorate. Il sistema Cas9 gRNA-guidato è stato impiegato con successo in editing genoma e migliora l&#39;efficienza di ricombinazione omologa in organismi eucarioti 22, 25. Recentemente, in cellule ospiti il genoma di adenovirus e tipo I virus dell&#39;herpes simplex è stato curato dal Cas9 gRNA-guidata sistema 24. E &#39;stato recentemente dimostrato che il sistema CRISPR Cas9 è un potente strumento per la modifica in modo efficiente il genoma VV e la costruzione di un vettore VV per esprimere unparticolare gene. Sia il metodo tradizionale ricombinazione omologa (HR) Cas9 N1L gRNA-guidato e portato a eventi HR di successo nello stesso sito di destinazione di N1L. È interessante notare, tuttavia gRNA guidato Cas9 HR indotta a livelli molto più elevati di efficienza rispetto al metodo tradizionale HR. Pertanto, l&#39;uso di Cas9 gRNA guidata elimina la necessità di purificare altrettanti placche avere VVs mutanti. In questo lavoro, abbiamo migliorato significativamente l&#39;efficienza e la lasso di tempo per la generazione di VV mutante utilizzando il sistema gRNA guidato Cas9 33. Da segnalare, un passo fondamentale per l&#39;ottenimento di una elevata efficienza della ricombinazione omologa è trasfezione le cellule CV-1 con i plasmidi che esprimono Cas9 e la gRNA per 24 ore prima di eseguire la ricombinazione omologa convenzionale. L&#39;intervallo di 24 ore permette Cas9 e gRNA ad essere espressi ad un livello ragionevole. Inoltre, potrebbe essere necessario ottimizzare la sequenza gRNA mira un particolare gene, come abbiamo scoperto che il diverso gRNA sequenze targeting N1L gene variato nella loro efficienza 33, 34. La limitazione per il CRISPR / Cas9 in editing VV è il basso tasso di placche RFP-positivo nel primo turno di ricombinazione. Per ottenere un numero sufficiente di placche RFP-positivi contenenti virus ricombinante, di solito almeno una decina sono necessari 6 pozzetti, che rende al primo round di screening noioso. Quindi, vi è ancora la necessità di ottimizzare il protocollo per superare questa limitazione. La piccola dimensione delle placche RFP-positivo è un altro problema potenziale, che è causa di un elevato volume di lisato utilizzato per infettare una piastra da 6 pozzetti. Per ovviare a questo, un minor volume di lisato deve essere usato per infettare una piastra da 6 pozzetti per ottenere dimensioni più grandi placche RFP-positive. Utilizzando un minor volume di lisato consentirà anche una migliore separazione delle placche RFP-positivi da quelli RFP-negativo. Di conseguenza, un minor numero di giri di purificazione placca devono ottenere placche puri RFP-positivo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Off-bersaglio effetti sono sempre un problema indesiderato in editing gene. CRISPR-Cas9 ha mostrato effetti off-target. Tuttavia, con un&#39;attenta progettazione di gRNA, fuori bersaglio effetti possono essere evitati quando si modifica la VV genomi 33, 34. Questo è il particolare vantaggio di utilizzare il sistema di Cas9 gRNA-guida per modificare il genoma di VV. Date le promesse di VV, utilizzando il sistema CRISPR / Cas9 accelererà lo sviluppo di VVs mutanti per la ricerca biomedica e nella medicina traslazionale. Inoltre, un simile sistema è inoltre accelerare scoperte in biologia cellulare, come dissezione delle vie di segnalazione utilizzati da VV per la sua motilità actina-based.

virus vaccinico (VV) è un virus a DNA con involucro appartenente alla famiglia poxvirus e ha svolto un ruolo cruciale in uno dei più grandi successi nel campo della medicina della eradicazione del vaiolo. Nell&#39;era post-eradicazione del vaiolo, VV è stato sviluppato come un vettore per la consegna di geni per i vaccini contro l&#39;HIV e altre malattie infettive 1-7 con l&#39;inserimento di geni provenienti da vari agenti patogeni in vettori VV. VV è anche stato ampiamente utilizzato come vettore per l&#39;immunoterapia del cancro 8-14 particolare per lo sviluppo del virus vaccinia oncolytic tumore targeting replica. Al fine di creare un vettore di vaccino efficace con migliorata selettività per le cellule tumorali, sono necessarie modifiche all&#39;interno del genoma virale, compresa gene delezioni o introduzione di geni terapeutici. Con lo sviluppo della tecnologia del DNA e una migliore comprensione della biologia molecolare e virologia, inserimento di DNA estraneo in VV originariamente conseguired utilizzando la ricombinazione omologa (HR) nel 1980 15. Questo metodo è ancora ampiamente utilizzato per la costruzione di vettori VV. Introduzione della modificazione genetica si ottiene utilizzando un vettore shuttle HR, che ricombina con il genoma VV di cellule pre-infettate. Tuttavia, questo metodo ha dimostrato di essere altamente inefficiente (meno dell&#39;1% dell&#39;efficienza ricombinazione omologa 16) e si traduce spesso in inserzione casuale del marcatore di selezione in regioni e / o perdita del marcatore all&#39;espansione virus non mirati. L&#39;efficienza del DNA ricombinazione omologa per l&#39;inserimento del DNA esogeno in loci genomici può essere notevolmente migliorata in presenza di rotture del doppio filamento (DSB) 17. Pertanto, la tecnologia che può indurre a DSB loci bersaglio ha un grande potenziale per l&#39;ingegneria del genoma di VV. Il sistema CRISPR-Cas9 recentemente sviluppato mostra la promessa per l&#39;attivazione DSB in qualsiasi regione del gene VV. CRISPR-Cas9 è un RNAnucleasi guidata coinvolti nella immunità adattativa contro fagi invasori e altri materiali genetici estranei 18-20. Ci sono tre sistemi CRISPR-Cas in una vasta gamma di specie microbiche 21. Il sistema CRISPR-Cas tipo II è ampiamente usato per modificare il genoma delle cellule eucariotiche e grandi virus. Si tratta del Cas9 endonucleasi RNA-guida (da Streptococcus pyogenes), una sola guida di RNA (sgRNA) e la trans-attivazione crRNA (tracrRNA) 22-24. Il complesso Cas9 / sgRNA riconosce l&#39;complementare 20-nucleotide sequenza genomica che precede una sequenza 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer motivo adiacente (PAM) in cellule di mammifero 22, 23. E&#39; stato usato con successo per un efficace generazione di cellule geneticamente modificate, virus e modelli animali 22-32. Il sistema CRISPR-Cas9 ha dimostrato di essere uno strumento efficace per il targeting genoma in combinazione con ricombinazione omologa nel citoplasma della cellula infettata VV CV-1s per generare virus vaccinia mutanti 33, 34. Al fine di estendere il potenziale applicazione di questo metodo, vi presentiamo informazioni dettagliate sulla metodologia di questo sistema. Il protocollo descritto può essere usato per creare un VV mutante con un particolare gene delezione e / o un braccio il virus mutante con un transgene terapeutico.

<table><tbody><tr><td>Plasmide #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>vettore di clonazione gRNA</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 vettore di clonaggio</td></tr><tr><td>pGEMT facile</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>riparazione donatore vettore clonaggio</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chimicamente Competente E. coli</td><td>C4040-10</td><td>Trasformazione Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>27106</td><td>Estrazione del plasmide</td><td>Qiagen</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila' s Medium (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td> siero fetale <td>bovino medio per colture cellulari</td></tr><tr><td>(FBS)&nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td><td>Coltura cellulare</td><td>di Hyclone</td></tr><tr><td>siero penicillina, streptomicina</td><td>15070-063</td><td>Thermo Scientific</td><td>antibiotici</td></tr><tr><td>Effectene</td><td>301425</td><td>trasfezione</td><td>Qiagen</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene fiala criogenica; 2.0&nbsp; mL</td><td>W-06754-96</td><td>Thermo Scientific</td><td>raccoglie il microscopio</td></tr> a <tr><td>fluorescenza del virus&nbsp;</td><td>Fluorescenza Olympus BX51</td><td>Olympus</td><td>trova il plque RFP-positivo</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit di tessuti</td><td>69506</td><td>Estensore di estrazione del DNA</td><td>Qiagen</td></tr><tr><td>PCR lunga ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Reagente Thermo Scientific</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 10 cm</td><td>Z688819-6EA</td><td>coltura cellulare sigma</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Z707759</td><td>Sigma</td><td>Cell Culture&nbsp;</td></tr><tr><td>raschietto cellulare</td><td>C5981</td><td>celle di scarto</td><td>sigma</td></tr><tr><td>1x soluzione di tripsina-EDTA</td><td>T4299</td><td>cellule sigma</td><td>tripsinizzate</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td><td>disinfettante</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>CLS430791-500EA</td><td>Sigma</td><td>hold cell suspension</td></tr><tr><td>N1L forward 5'-TATCTAGCAATGGACCGT-3'</td><td></td><td>Primer Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>N1L reverse&nbsp; 5'-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3'Primer</td><td></td> <td>Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>A52R avanti 5'-ATAGGATTGTGTGCATGC-3'</td><td></td><td>Primer Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>A52R inverso 5'-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3'</td><td></td><td>Primer Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>RFP avanti 5'- GCTACCGGACTCAGATCCA-3' &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>Primer Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>RFP inverso 5'-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3'</td><td></td><td>Primer Sigma</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Argarose</td><td>A7431</td><td>Sigma</td><td>resolve PCR prodotto</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>UV gel doc</td></tr></tbody></table>

un approccio semplice ed efficiente per costruire mutant vaccinia vettori di virus

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

L'endonucleasi Cas9 associata a CRISPR può modificare particolari loci genomici diretti da un singolo RNA guida (gRNA). Il sistema CRISPR/Cas9 è stato impiegato con successo per l'editing dei genomi di vari organismi. Qui descriviamo un protocollo per l'editing del genoma del virus vaccinico (VV) nel citoplasma di cellule CV-1 infettate da VV utilizzando l'RNA-guidato Cas9. Cas9 guidato dall'RNA induce rotture del DNA a doppio filamento, facilitando la ricombinazione omologa in modo efficiente e specifico nel sito bersaglio di VV e un transgene può essere incorporato in questi siti mediante ricombinazione omologa. Utilizzando un vettore omologo sito-specifico con transgeni, è stato generato un VV deleto dal gene N1L con il gene della proteina di fluorescenza rossa (RFP) incorporato in questa regione con un'efficienza di ricombinazione di successo 10 volte maggiore di quella ottenuta dal metodo convenzionale di ricombinazione omologa. Questo protocollo dimostra l'uso efficace del sistema Cas9 guidato da RNA per generare VV mutanti con maggiore efficienza.

Per la costruzione di un nuovo vettore VV, il punto di partenza fondamentale è quello di progettare e costruire un vettore shuttle donatore che può avere come bersaglio una particolare regione del genoma. In questo studio, il gene VV N1L stato usato come bersaglio esempio. La cassetta del vettore shuttle donatori per la ricombinazione e la regione mirato nel VV sono mostrati in Figura 1. Al fine di migliorare l&#39;efficienza della ricombinazione omologa, plasmidi esprimenti Cas9 e N1L specifico gRNA state co-trasfettate in CV -1 celle 48 ore prima di eseguire la ricombinazione omologa 33. Un giorno (24 ore) post-trasfezione, RFP è stata espressa in cellule CV-1 (Figura 2). Dopo infezione di CV-1 cellule con l&#39;intero lisato dalla ricombinazione omologa (fase 5), RFP-positivi e placche negativi sono stati osservati sia nelle cellule CV-1 (Figura 3). A seguito del protocollo di purificazione descritto, una targa co puro<html> ULD essere ottenuto dopo 3-5 giri di purificazione. Come mostrato in figura 4, tutti placche dopo l&#39;infezione con lisato cellulare derivata da una placca puro con il virus vaccinia mutante presentato un segnale RFP. Per verificare se il mutante puro VV aveva modificazione genetica corretta, la PCR è stata utilizzata per confermare l&#39;assenza del gene N1L bersaglio, come mostrato in Figura 5. PCR del virus modificato ha mostrato un segnale positivo per RFP e un segnale assente per N1L ( Figura 5 corsia AG), mentre i risultati di PCR della N1L del virus di controllo (Ctr) con una regione N1L intatto è positivo. I frammenti di DNA di controllo di A52R sono stati positivi per tutti i virus ricombinanti e il virus Ctr. L&#39;efficienza delle risorse umane nelle placche RFP-positivi è del 100% (6/6) in questo esperimento (era fino al 94% nel lavoro precedente 34). Il metodo qui descritto è migliorata l&#39;efficienza di ricombinazione di più di 100 volte rispetto ai protocolli convenzionali 33, 34. contenuti &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Figura 1:. La cassetta del vettore shuttle donatori per la ricombinazione omologa, e la regione di destinazione nel genoma VV La purificazione gene marcatore RFP è guidata dal promotore H5. Il vettore di riparazione donatore mira i risultati regione N1L nel gene RFP viene incorporato nella regione N1L dopo ricombinazione omologa. &#39;X&#39; indica la sequenza omologa nel vettore donatore di riparazione che andrà a sostituire la stessa sequenza sul genoma del virus vaccino. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Figura 2:. Imaging del CV-1 le cellule un giorno dopo la ricombinazione omologa Un giorno afteR ricombinazione omologa, le cellule infettate con VV e trasfettate mediante riparazione vettore donatore sono RFP-positivi. A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X). B: immagini di microscopia a fluorescenza (originale ingrandimento 100X). Barra di scala = 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Figura 3:. Una targa RFP-positivo nel primo depurazione turno di virus mutante nella purificazione primo turno del virus mutante, la placca RFP-positivi (cerchiato con linea rossa) con la regione di destinazione eliminazione sono circondati da placche formate da virus selvaggio di tipo (cerchiato con linea gialla). A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X) B:. fluorescenza MICRimmagine oscopy (originale ingrandimento 100X). Barra di scala = 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Figura 4:. Il mutante pura VV Dopo 3-5 giri di purificazione, placche puri sono stati ottenuti come tutte le targhe erano RFP-positivi. A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X). B: immagini di microscopia a fluorescenza (originale ingrandimento 100X) . Barra di scala = 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Figura 5: Verification della pura mutante VV. DNA è stato estratto da VV infettato CV-1 cellule. La delezione della regione bersaglio N1L è stata verificata mediante PCR utilizzando primer N1L, l&#39;inserimento di RFP in regione N1L stata confermata mediante PCR utilizzando primer RFP. Lanes AF corrisponde a sei placche purificati, corsia G è una placca di controllo con l&#39;eliminazione N1L verificato nel precedente lavoro 33, corsia Ctr (controllo) è il virus di tipo selvaggio vaccino (con la regione N1L intatto). A52R gene è stato amplificato come il gene di controllo per tutti i campioni. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

virus vaccinico (VV) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e il miglioramento della salute umana. Questo articolo descrive un metodo semplice e altamente efficiente per modificare il genoma VV utilizzando un sistema CRISPR-Cas9.

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è migliorare l'efficienza della generazione di virus vaccinia mutanti mediante l'uso della tecnologia CRISPR-Cas9. Questo metodo può contribuire a creare nuovi vettori virali del virus vaccinia per la ricerca biologica e la ricerca medica, in particolare per la terapia genica e la vaccinazione. La dimostrazione virale con questo metodo è fondamentale, poiché l'identificazione e la selezione delle placche positive risultano difficili da eseguire.Il principale vantaggio di questa tecnica è che migliora notevolmente l'efficienza nella produzione del nostro vaccinia virus mutante. A partire da cellule CV-1 raccolte, regolare la loro concentrazione a 100.000 cellule per millilitro. Successivamente, seminare due millilitri della sospensione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti per la trasfezione.Il giorno seguente, trasfettare le cellule con 0,5 nanogrammi di plasmide gRNA-N2 e 0,5 nanogrammi di plasmide pSTCas9. Quindi incubare per 24 ore. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo.Successivamente, preparare il virus VVL15. Diluire il virus VVL15 con DMEM fino a ottenere una concentrazione di 200.000 PFU per millilitro. Quindi aggiungere 100 microlitri del virus diluito in ogni pozzetto delle cellule CV-1 transfezionate.Dopo due ore, trasfettare le cellule con un microgrammo del vettore donatore shuttle per l'espressione di HR e incubare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, staccare le cellule CV-1 trasfettate utilizzando una spatola per cellule. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta criogenica e conservarla a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.Per iniziare il primo ciclo di purificazione del VV modificato, seminare 15 piastre da sei pozzetti con 300.000 cellule CV-1 non modificate per pozzetto. Il giorno successivo, scongelare la sospensione congelata di cellule CV-1 transfezionate a 37 gradi Celsius per tre minuti, quindi vortexare vigorosamente la sospensione per 30 secondi per lisare le cellule. Successivamente, diluire un microlitro del lisato con tre millilitri di DMEM.Aggiungere mezzo millilitro di questa diluizione in ogni pozzetto della piastra contenente cellule CV-1 non modificate. Successivamente, reinserire le piastre nell'incubatore per due giorni. Due giorni dopo, identificare le placche positive per RFP utilizzando un microscopio a fluorescenza.Possono essere individuati con un obiettivo 10X. Mentre vengono identificati, etichettare con precisione le placche sul retro della piastra utilizzando un pennarello. Preparare ora una cryovial contenente 200 microlitri di DMEM privo di siero per ciascuna placca positiva da raccogliere.Successivamente, è importante aspirare tutto il mezzo dalle pozzette con le placche marcate. Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri impostata per aspirare 30 microlitri, caricare parzialmente la pipetta con 10 microlitri di mezzo proveniente dalla cryovial ed estrarre quindi la placca aspirando le cellule con il volume rimanente. Espellere il contenuto nella cryovial e ripetere questa procedura altre due volte, mirando alla stessa placca positiva per RFP per raccogliere il maggior numero possibile di cellule.Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius oppure, se si intende eseguire immediatamente il secondo ciclo di purificazione, congelare le provette criogeniche su ghiaccio secco per 10 minuti. Il secondo ciclo di purificazione del VV modificato viene eseguito esattamente come il primo, utilizzando le cellule congelate del primo ciclo. Tuttavia, per ciascuna linea positiva per RFP si possono selezionare più di sei placche positive per RFP.Ripetere il processo di selezione fino a quando tutte le placche formate da una singola placca positiva risultano positive per RFP, indicando che la placca è pura; questo può richiedere da tre a cinque ulteriori cicli. Un giorno prima, preparare una piastra a sei pozzetti con mezzo milione di cellule CV-1 per pozzetto. Il giorno seguente, scongelare la placca purificata congelata a 37 gradi Celsius per tre minuti.Quindi vortexare vigorosamente la placca per 30 secondi per ottenere un lisato. Aggiungere tutto il lisato, compresi i detriti cellulari, in una pozzetta di cellule CV-1 e incubare la piastra per tre giorni. Non utilizzare le altre cinque pozzette.Ispezionare le cellule quotidianamente al microscopio. Quando più della metà delle cellule appare citopatica, raccogliere le cellule infette. Idealmente, tutte le cellule dovrebbero risultare citopatiche.Utilizzare un raschietto per cellule per raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri con mezzo di coltura. Successivamente, centrifugare le cellule a 300g per tre minuti. Rimuovere il soprannatante e procedere con la PCR per verificare la modifica del VV mutante, oppure congelare il pellet cellulare a -80 gradi Celsius per eseguire l'analisi in un secondo momento.Il metodo descritto migliora l'efficienza di ricombinazione di oltre 100 volte rispetto ai protocolli convenzionali. Ad esempio, il gene VV N1LG è stato preso di mira per la modifica. Come descritto, plasmidi esprimenti Cas9 e un gRNA specifico per N1L sono stati co-trasfettati nelle cellule CV-1 per aumentare la loro efficienza di ricombinazione omologa.Un giorno dopo la trasfezione, la RFP è stata espressa nelle cellule CV-1. Successivamente, le cellule CV-1 sono state infettate con il lisato totale derivato dalla ricombinazione omologa. Sono state osservate sia placche positive che negative per RFP nelle cellule CV-1.Al termine del protocollo di purificazione, è stato ottenuto un ricombinante puro. Tutte le placche ottenute dopo l'infezione con il lisato cellulare derivato da una placca pura contenente il virus vaccinia mutante hanno mostrato un segnale RFP. La PCR è stata utilizzata per verificare l'eliminazione del gene bersaglio.Il virus modificato ha mostrato un segnale positivo per RFP e nessun segnale per N1L, a differenza del controllo N1L integro. Tutti sono risultati positivi per il gene non bersaglio A52R. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare rapidamente un nuovo vettore virale vaccinico.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 giorni se effettuata correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle scienze biomediche per esplorare nuovi vettori virali nello sviluppo di agenti biologici per il trattamento e la prevenzione del cancro e delle malattie infettive.

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Immunologia e Infezioni

Dimostriamo la tecnica di base per progettare molecolare ed evolvere sintetici virale adeno-associati (AAV) vettori di terapia genica attraverso la famiglia shuffling DNA. Inoltre, fornire linee guida generali ed esempi rappresentativi per la selezione e l'analisi delle singole capsidi chimerici con proprietà migliorate sulle cellule bersaglio in coltura o nei topi.

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Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Questo è un metodo per generare virus vaccinia ricombinanti "senza cicatrici" utilizzando la selezione host-range e l'identificazione visiva dei virus ricombinanti.

Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere il vettore di espressione di pVAX1-PRRSV introducendo opportuni siti di restrizione all'estremità 3' degli inserti. Possiamo linearizzare il vettore e unire i frammenti di DNA al vettore uno per uno attraverso la tecnologia di ricombinazione omologa.

Un approccio di clonazione senza soluzione di continuità per la costruzione di vettori di espressione del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini

Fattori dell'ospite romanzo coinvolti nella infezione virale può essere identificato tramite cell-based genome-wide perdita della funzione di screening RNAi.

Lo screening RNAi per fattori di accoglienza che partecipano Vaccinia Infezione da virus utilizzando Drosophila Celle

Scopri come generare virus vaccinia mutanti con CRISPR-Cas9 per ricerca biomedica e terapia genica. Questo metodo aumenta l'efficienza di ricombinazione oltre 100 volte rispetto ai protocolli convenzionali.

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

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