Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus
30 ottobre 2016
virus vaccinico (VV) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e il miglioramento della salute umana. Questo articolo descrive un metodo semplice e altamente efficiente per modificare il genoma VV utilizzando un sistema CRISPR-Cas9.
L'obiettivo generale di questo esperimento è migliorare l'efficienza della generazione di virus vaccinia mutanti mediante l'uso della tecnologia CRISPR-Cas9. Questo metodo può contribuire a creare nuovi vettori virali del virus vaccinia per la ricerca biologica e la ricerca medica, in particolare per la terapia genica e la vaccinazione. La dimostrazione virale con questo metodo è fondamentale, poiché l'identificazione e la selezione delle placche positive risultano difficili da eseguire.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che migliora notevolmente l'efficienza nella produzione del nostro vaccinia virus mutante. A partire da cellule CV-1 raccolte, regolare la loro concentrazione a 100.000 cellule per millilitro. Successivamente, seminare due millilitri della sospensione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti per la trasfezione.
Il giorno seguente, trasfettare le cellule con 0,5 nanogrammi di plasmide gRNA-N2 e 0,5 nanogrammi di plasmide pSTCas9. Quindi incubare per 24 ore. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo.
Successivamente, preparare il virus VVL15. Diluire il virus VVL15 con DMEM fino a ottenere una concentrazione di 200.000 PFU per millilitro. Quindi aggiungere 100 microlitri del virus diluito in ogni pozzetto delle cellule CV-1 transfezionate.
Dopo due ore, trasfettare le cellule con un microgrammo del vettore donatore shuttle per l'espressione di HR e incubare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, staccare le cellule CV-1 trasfettate utilizzando una spatola per cellule. Successivamente, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta criogenica e conservarla a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.
Per iniziare il primo ciclo di purificazione del VV modificato, seminare 15 piastre da sei pozzetti con 300.000 cellule CV-1 non modificate per pozzetto. Il giorno successivo, scongelare la sospensione congelata di cellule CV-1 transfezionate a 37 gradi Celsius per tre minuti, quindi vortexare vigorosamente la sospensione per 30 secondi per lisare le cellule. Successivamente, diluire un microlitro del lisato con tre millilitri di DMEM.
Aggiungere mezzo millilitro di questa diluizione in ogni pozzetto della piastra contenente cellule CV-1 non modificate. Successivamente, reinserire le piastre nell'incubatore per due giorni. Due giorni dopo, identificare le placche positive per RFP utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Possono essere individuati con un obiettivo 10X. Mentre vengono identificati, etichettare con precisione le placche sul retro della piastra utilizzando un pennarello. Preparare ora una cryovial contenente 200 microlitri di DMEM privo di siero per ciascuna placca positiva da raccogliere.
Successivamente, è importante aspirare tutto il mezzo dalle pozzette con le placche marcate. Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri impostata per aspirare 30 microlitri, caricare parzialmente la pipetta con 10 microlitri di mezzo proveniente dalla cryovial ed estrarre quindi la placca aspirando le cellule con il volume rimanente. Espellere il contenuto nella cryovial e ripetere questa procedura altre due volte, mirando alla stessa placca positiva per RFP per raccogliere il maggior numero possibile di cellule.
Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius oppure, se si intende eseguire immediatamente il secondo ciclo di purificazione, congelare le provette criogeniche su ghiaccio secco per 10 minuti. Il secondo ciclo di purificazione del VV modificato viene eseguito esattamente come il primo, utilizzando le cellule congelate del primo ciclo. Tuttavia, per ciascuna linea positiva per RFP si possono selezionare più di sei placche positive per RFP.
Ripetere il processo di selezione fino a quando tutte le placche formate da una singola placca positiva risultano positive per RFP, indicando che la placca è pura; questo può richiedere da tre a cinque ulteriori cicli. Un giorno prima, preparare una piastra a sei pozzetti con mezzo milione di cellule CV-1 per pozzetto. Il giorno seguente, scongelare la placca purificata congelata a 37 gradi Celsius per tre minuti.
Quindi vortexare vigorosamente la placca per 30 secondi per ottenere un lisato. Aggiungere tutto il lisato, compresi i detriti cellulari, in una pozzetta di cellule CV-1 e incubare la piastra per tre giorni. Non utilizzare le altre cinque pozzette.
Ispezionare le cellule quotidianamente al microscopio. Quando più della metà delle cellule appare citopatica, raccogliere le cellule infette. Idealmente, tutte le cellule dovrebbero risultare citopatiche.
Utilizzare un raschietto per cellule per raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri con mezzo di coltura. Successivamente, centrifugare le cellule a 300g per tre minuti. Rimuovere il soprannatante e procedere con la PCR per verificare la modifica del VV mutante, oppure congelare il pellet cellulare a -80 gradi Celsius per eseguire l'analisi in un secondo momento.
Il metodo descritto migliora l'efficienza di ricombinazione di oltre 100 volte rispetto ai protocolli convenzionali. Ad esempio, il gene VV N1LG è stato preso di mira per la modifica. Come descritto, plasmidi esprimenti Cas9 e un gRNA specifico per N1L sono stati co-trasfettati nelle cellule CV-1 per aumentare la loro efficienza di ricombinazione omologa.
Un giorno dopo la trasfezione, la RFP è stata espressa nelle cellule CV-1. Successivamente, le cellule CV-1 sono state infettate con il lisato totale derivato dalla ricombinazione omologa. Sono state osservate sia placche positive che negative per RFP nelle cellule CV-1.
Al termine del protocollo di purificazione, è stato ottenuto un ricombinante puro. Tutte le placche ottenute dopo l'infezione con il lisato cellulare derivato da una placca pura contenente il virus vaccinia mutante hanno mostrato un segnale RFP. La PCR è stata utilizzata per verificare l'eliminazione del gene bersaglio.
Il virus modificato ha mostrato un segnale positivo per RFP e nessun segnale per N1L, a differenza del controllo N1L integro. Tutti sono risultati positivi per il gene non bersaglio A52R. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare rapidamente un nuovo vettore virale vaccinico.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 giorni se effettuata correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle scienze biomediche per esplorare nuovi vettori virali nello sviluppo di agenti biologici per il trattamento e la prevenzione del cancro e delle malattie infettive.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo altamente efficiente per modificare il genoma del virus vaccinia (VV) mediante la tecnologia CRISPR-Cas9. La tecnica migliora in modo significativo la generazione di VV mutanti, facilitando progressi nella ricerca biologica e medica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Ingegneria genetica
- Ricerca biomedica
Sfondo
- Il virus vaccinia è uno strumento prezioso nella ricerca biomedica.
- La tecnologia CRISPR-Cas9 consente una modifica precisa del genoma.
- La generazione efficiente di mutanti virali è fondamentale per le applicazioni di ricerca.
- I metodi tradizionali di generazione di mutanti possono essere inefficienti.
Scopo dello studio
- Migliorare l'efficienza nella generazione di virus vaccinia mutanti.
- Sviluppare nuovi vettori virali per la terapia genica e la vaccinazione.
- Ottimizzare l'identificazione delle placche positive nei saggi virali.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione di cellule CV-1 con plasmidi gRNA e Cas9.
- Infettare le cellule trasfettate con il virus VVL15.
- Identificazione di placche positive per RFP mediante microscopia a fluorescenza.
- Purificazione del VV modificato attraverso ripetuti cicli di selezione.
Risultati principali
- Il metodo migliora l'efficienza di ricombinazione di oltre 100 volte.
- La generazione con successo di placche positive per RFP indica una modifica efficace.
- La PCR ha confermato l'eliminazione dei geni bersaglio nel virus modificato.
- La tecnica può essere completata in circa 10 giorni.
Conclusioni
- Questo metodo CRISPR-Cas9 rappresenta un notevole progresso per la ricerca sul VV.
- Permette uno sviluppo rapido di nuovi vettori virali per applicazioni terapeutiche.
- L'approccio può facilitare ulteriori studi nel trattamento del cancro e delle malattie infettive.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo approccio CRISPR-Cas9 affronta un collo di bottiglia fondamentale nello sviluppo di vettori virali, migliorando in modo significativo l'efficienza nella generazione di ceppi mutanti del virus vaccinia. Un'efficienza di ricombinazione maggiore consente un'iterazione più rapida nella validazione preclinica dei bersagli e nei processi di ottimizzazione dei vettori. Il metodo permette la generazione rapida di virus ricombinanti per la ricerca su terapia genica e vaccini, riducendo i tempi nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente un'analisi precisa della funzione genica virale mediante knockout mirati, come l'eliminazione di N1L, per chiarire i meccanismi patogenetici.
- Valore operativo: Migliora l'efficienza di generazione di virus ricombinanti di oltre 100 volte rispetto alla ricombinazione omologa tradizionale, accelerando i tempi di ingegnerizzazione dei ceppi.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione dei rischi meccanicistici facilitando modifiche genetiche pulite che permettono un'attribuzione inequivocabile del fenotipo nei saggi successivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera virus reporter marcati con RFP che consentono saggi di placche quantitativi basati sulla fluorescenza per lo screening ad alto rendimento di composti antivirali o risposte immunitarie.
- Valore operativo: Produce stock virali stabili e puri dopo diversi cicli di purificazione, garantendo la riproducibilità del saggio e riducendo la variabilità dei risultati.
- Scalabilità: Il protocollo utilizza attrezzature standard per colture cellulari e trasfezione, permettendone l'adattamento a diverse scale di laboratorio senza strumentazione specializzata.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Fornisce una piattaforma per la costruzione di vettori virali vaccinici esprimenti antigeni terapeutici o immunomodulatori, da valutare in modelli preclinici di cancro e malattie infettive.
- Rilevanza del modello preclinico: Permette la rapida generazione di ceppi virali isogenici (ad esempio, selvatici rispetto a deleti per N1L) per analizzare i meccanismi di virulenza e supportare la caratterizzazione della sicurezza.
- Avanzamento basato sul rischio: Le delezioni geniche verificate mediante PCR e l'espressione di RFP consentono decisioni sicure di prosecuzione o interruzione dello studio sulla base della fedeltà genetica, prima degli studi in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel continuum dalla scoperta precoce all'identificazione del capostazione, in cui l'ingegnerizzazione rapida di vettori virali supporta il test delle ipotesi sui bersagli e la validazione meccanicistica.
- Biologia della scoperta: Facilita la modifica guidata da ipotesi dei genomi virali per indagare la funzione genica nelle vie di evasioni immunitarie o di replicazione.
- Screening: Genera stock virali standardizzati esprimenti RFP, adatti per saggi di screening basati sulla fluorescenza nell'ambito della valutazione dell'efficacia antivirale o vaccinale.
- Analisi: Permette letture basate su PCR e fluorescenza per valutare quantitativamente l'efficienza di modifica e la purezza clonale durante lo sviluppo del vettore.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità dalla costruzione del vettore ai test preclinici fornendo virus geneticamente definiti con integrazione confermata del transgene e delezione genica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'ingegnerizzazione del virus vaccinia, applicabile a diversi bersagli e carichi di transgeni nei programmi di vettori virali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Modifica del genoma ad alta fedeltà con un miglioramento misurabile dell'efficienza di ricombinazione, riducendo i falsi negativi nel screening dei mutanti.
- Valore operativo: Flusso di lavoro semplificato che utilizza reagenti accessibili (plasmidi, cellule CV-1, microscopia a fluorescenza) riduce le barriere tecniche all'adozione.
- Valore strategico: Accelera i cicli di progettazione, costruzione e verifica dei vettori virali, migliorando l'efficienza del capitale nei programmi precoci di biologici.
- Impatto sul portafoglio: Consente la prototipazione rapida di vettori virali, supportando l'esplorazione parallela di più candidati e una prioritizzazione informata basata sulla validazione genetica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di biologia molecolare nella trasfezione di plasmidi e nel manipolamento virale in condizioni BSL-2.
- Dipende dalla microscopia a fluorescenza per la selezione delle placche e da un normale apparato PCR per la verifica genotipica.
- Necessita di un'ottimizzazione della progettazione della gRNA e del vettore donatore per ciascun locus bersaglio al fine di mantenere la specificità dell'editing.
- Applicabile a linee cellulari mammifere aderenti come CV-1; l'adattamento ad altri sistemi potrebbe richiedere test sperimentali.
- Sono necessari più cicli di purificazione delle placche per ottenere una purezza clonale, il che incide sul tempo di lavoro diretto nonostante la tempistica complessiva di 10 giorni.
