Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di migliorare l'efficienza della generazione di virus vaccinici mutanti utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Questo metodo può aiutare a creare nuovi vettori di virus vaccinici per la ricerca biologica e la ricerca medica, in particolare per la terapia genica e la vaccinazione. La dimostrazione virale con questo metodo è fondamentale, perché identificare e raccogliere le placche positive è difficile da eseguire.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che migliora notevolmente l'efficienza nel rendere il nostro mutante il virus vaccinia. Iniziando con le cellule CV-1 raccolte, regolare la loro concentrazione a 100.000 cellule per millilitro. Quindi seminare due millilitri di sospensione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti per la trasfezione.

Il giorno seguente, trasfettare le cellule con 0,5 nanogrammi di plasmide gRNA-N2 e 0,5 nanogrammi di plasmide pSTCas9. Quindi incubarli per 24 ore. 24 ore dopo, sostituire il fluido.

Quindi, prepara il virus VVL15. Diluire il virus VVL15 della spina dorsale con DMEM a 200.000 PFU per millilitro. Quindi aggiungere 100 microlitri del virus diluito in ciascun pozzetto delle cellule CV-1 trasfettate.

Due ore dopo, trasfettare le cellule con un microgrammo del vettore del donatore navetta per l'espressione di HR e incubare le cellule per 24 ore. Il giorno seguente, staccare le cellule CV-1 trasfettate utilizzando un raschietto cellulare. Quindi raccogliere la sospensione cellulare in un crioviale e conservarla a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un uso futuro.

Per iniziare il primo ciclo di purificazione del VV modificato, seminare 15 piastre a sei pozzetti con 300.000 cellule CV-1 non modificate per pozzetto. Il giorno successivo, scongelare la sospensione congelata di cellule CV-1 trasfettate a 37 gradi Celsius per tre minuti, quindi agitare vigorosamente la sospensione per 30 secondi per lisare le cellule. Quindi diluire un microlitro di lisato con tre millilitri di DMEM.

Aggiungere mezzo millilitro di questa diluizione a ciascun pozzetto della piastra di cellule CV-1 non modificate. Quindi rimetti le piastre nell'incubatrice per due giorni. Due giorni dopo, identificare le placche RFP-positive utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Possono essere individuati con un obiettivo 10X. Man mano che vengono identificati, etichettare accuratamente le placche sotto la targa utilizzando un pennarello. Ora prepara un crioviale contenente 200 microlitri di DMEM senza siero per ogni placca positiva da raccogliere.

Successivamente, è importante aspirare tutto il terreno dai pozzetti con placche etichettate. Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri impostata per aspirare 30 microlitri, caricare parzialmente la pipetta con 10 microlitri di terreno dal crioviale, quindi raschiare la placca e aspirare le cellule con l'aspirazione rimanente. Espellere questo nella crioviale e ripetere questa procedura altre due volte, mirando alla stessa placca RFP-positiva per raccogliere il maggior numero possibile di cellule.

Conservare le collezioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius o, se si vuole eseguire immediatamente il secondo ciclo di purificazione, congelare i crioviali su ghiaccio secco per 10 minuti. Il secondo ciclo di purificazione del VV modificato viene eseguito proprio come il primo utilizzando le cellule congelate del primo ciclo. Tuttavia, è possibile selezionare più di sei placche RFP-positive per ogni linea RFP-positiva.

Ripetere il processo di selezione fino a quando tutte le placche formate da una placca positiva sono RFP-positive, indicando che la placca è pura, il che può richiedere da tre a cinque cicli aggiuntivi. Con un giorno di anticipo, preparare una piastra a sei pareti con mezzo milione di cellule CV-1 per pozzetto. Il giorno seguente, scongelare la placca purificata congelata a 37 gradi Celsius per tre minuti.

Quindi agitare energicamente la placca per 30 secondi per ottenere un lisato. Aggiungere tutto il lisato, compresi i detriti cellulari, in un pozzetto di cellule CV-1 e incubare la piastra per tre giorni. Non utilizzare gli altri cinque pozzetti.

Ispezionare le cellule ogni giorno al microscopio. Quando più della metà delle cellule appare citopatica, raccogliere le cellule infette. Idealmente tutte le cellule dovrebbero essere citopatiche.

Utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule in una provetta da 15 millilitri con terreno di coltura. Quindi pellettare le celle a 300 g per tre minuti. Scartare il surnatante e procedere con l'uso della PCR per verificare la modifica del VV mutante, oppure congelare il pellet cellulare a meno 80 gradi Celsius per farlo in seguito.

Il metodo descritto migliora l'efficienza di ricombinazione di oltre 100 volte rispetto ai protocolli convenzionali. Ad esempio, il VV N1LG è stato preso di mira per la modifica. Come descritto, i plasmi che esprimono Cas9 e un gRNA specifico per N1L sono stati co-trasfettati nelle cellule CV-1 per migliorarne l'efficienza per la ricombinazione omologa.

Un giorno dopo la trasfezione, RFP è stato espresso nelle cellule CV-1. Successivamente, le cellule CV-1 sono state infettate con l'intero lisato dalla ricombinazione omologa. Placche RFP-positive e negative sono state entrambe osservate nelle cellule CV-1.

A seguito del protocollo di purificazione, è stato ottenuto un ricombinante puro. Tutte le placche dopo l'infezione con il lisato cellulare derivato da una placca pura con il virus vaccinico mutante presentavano un segnale RFP. La PCR è stata utilizzata per verificare la delezione del gene bersaglio.

Il virus modificato ha mostrato un segnale positivo per RFP e nessun segnale per N1L, a differenza del controllo N1L intatto. Tutti erano positivi per il gene non bersaglio A52R. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare rapidamente un nuovo vettore di virus vaccinico.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 giorni se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle scienze biomediche per esplorare nuovi vettori virali nello sviluppo di agenti biologici per il trattamento e la prevenzione del cancro e delle malattie infettive.