Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

L'obiettivo generale di questo nuovo metodo di coltura cellulare è quello di generare cellule adipose dedifferenziate con maggiore efficienza. Il nostro metodo può aiutare i ricercatori che lavorano nel campo della medicina rigenerativa a rispondere a domande chiave sui diversi processi coinvolti nella produzione di cellule adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Poiché il vantaggio principale del nostro protocollo di coltura cellulare è che migliora la qualità delle cellule DEFAT, potrebbe essere applicato nel prossimo futuro per migliorare le attuali applicazioni nella terapia cellulare e nell'ingegneria tissutale.

Dopo aver portato il campione di grasso sottocutaneo del paziente in laboratorio dalla sala operatoria, pesare il tessuto e posizionare un campione di uno o due grammi di tessuto adiposo in una provetta da 15 millilitri. Quindi lavare il campione con cinque millilitri di PBS e quindi trasferire il campione in un piatto di plastica da 10 centimetri. Rimuovere il PBS.

Quindi aggiungere 10 millilitri di collagenasi sterile allo 0,1% in peso per volume alla piastra contenente il campione. Quindi, usa le forbici chirurgiche per tritare il tessuto fino a raggiungere una consistenza frullata. Trasferire il tessuto tritato e la soluzione di collagenasi in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e digerire a 37 gradi Celsius per 30 minuti, agitando a 60 giri/min.

Dopo la digestione, filtrare il campione digerito attraverso un filtro da 100 micron in una provetta fresca da 15 millilitri. Quindi, passare 10 millilitri di terreno di coltura DEFAT integrato con il 2% di FBS attraverso il filtro. Per isolare le cellule adipose dalla sospensione cellulare, centrifugare prima le cellule filtrate a 100 volte g per un minuto a temperatura ambiente.

Durante la centrifugazione, preparare cinque millilitri di DCM integrati con il 2% di FBS in una provetta da 15 millilitri. Quindi, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per prelevare le cellule adipose galleggianti dalla provetta centrifugata e aggiungere le cellule in una provetta da 15 millilitri contenente terreno. Agitare delicatamente la provetta per mescolare il terreno DCM con le cellule.

Quindi, centrifugare la provetta a 100 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, utilizzare un ago calibro 18 e una siringa da 20 millilitri per rimuovere il mezzo sul fondo della provetta. Quindi aggiungere 10 millilitri di DCM integrato con il 2% di FBS alle cellule e mescolare agitando delicatamente la provetta.

Centrifugare nuovamente le celle a 100 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Per iniziare la placcatura, aggiungere 41 millilitri di DCM o DMEM integrati con il 20% di FBS a un pallone da 12,5 centimetri. Quindi utilizzare una pipetta da 200 microlitri per prelevare 40 microlitri di cellule adipose e aggiungerle al pallone.

Quindi riempire il pallone con DCM o DMEM integrato con il 20% di FBS. È fondamentale che le cellule siano distribuite in tutto il terreno. Posizionare il pallone sul coperchio di una capsula di Petri rotonda per mantenerla piatta.

Infine, posizionare il pallone all'interno di un'incubatrice impostata al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius e lasciarlo indisturbato per sette giorni. Dopo una settimana di incubazione, capovolgere il pallone e verificare la presenza di cellule adipose dedifferenziate. Successivamente, aspirare il terreno e quindi aggiungere cinque millilitri di DCM o DMEM integrati con il 20% di FBS al pallone.

Lasciare che le cellule DEFAT crescano per un'altra settimana dopo aver cambiato il terreno. Dopo una settimana, utilizzare un contatore di cellule per contare il numero di cellule DEFAT generate in varie condizioni di coltura cellulare. Questa immagine mostra le colonie di cellule DEFAT dopo 14 giorni di coltura in DMEM.

Qui le cellule DEFAT sono mostrate dopo 14 giorni di coltura in DCM. In ogni caso, la barra della scala rappresenta 200 micron. La proliferazione cellulare DEFAT è stata quantificata utilizzando un contatore cellulare ed è stata confrontata l'efficienza di DCM e DMEM nella generazione di cellule DEFAT.

Come si vede qui, si osserva una maggiore proliferazione cellulare con l'uso del DCM. Qui, le cellule DEFAT umane, generate utilizzando DCM, sono state coltivate per tre settimane nei terreni di induzione appropriati per valutare la ridifferenziazione e le capacità di differenziazione delle cellule DEFAT. Le cellule erano positive per la capacità osteogenica mediante colorazione con fosfatasi alcalina e colorazione con Alizarin Red S. Infine, la capacità adipogenica è stata dimostrata con una colorazione Oil Red O.

È molto importante assicurarsi che la collagenasi con rudimento e l'isolamento delle cellule adipose siano eseguite con la massima cura al fine di generare con successo cellule DEFAT di alta qualità. Attraverso questi sforzi, il nostro metodo di coltura cellulare convalidato mira a facilitare gli sforzi di ricerca attuali e futuri nei campi della biologia dello sviluppo e della medicina rigenerativa.