Name: Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Scopri un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziate (DFAT) con un nuovo mezzo di coltura. Questo protocollo migliora la qualità cellulare per applicazioni in medicina rigenerativa e ingegneria tissutale.

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Questa ricerca è stata supportata in parte dal Programma per la creazione di start-up da ricerca e tecnologia avanzate (Programma START) della Società giapponese per la promozione della scienza (ST261006IP, TM) e dal Programma per la Fondazione di ricerca strategica presso università private (2014-2019) (S1411018, TM) del Ministero dell'istruzione, dello sport, della scienza e della tecnologia.

I campioni di grasso sottocutaneo umano sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia nei dipartimenti di Chirurgia Plastica, Urologia, Chirurgia Pediatrica e Chirurgia Ortopedica dell&#39;Ospedale Nihon dell&#39;Università Itabashi (Tokyo, Giappone). I pazienti hanno dato consenso informato scritto, e il Comitato Etico della Nihon University School of Medicine ha approvato lo studio. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Portare il campione di tessuto dalla sala operatoria al laboratorio. </li><li> Lavare 1-2 g di tessuto adiposo con 5 ml di PBS (-) a temperatura ambiente (RT), una volta, in un tubo da 50 ml e quindi posizionare il campione in un piatto di plastica 10 cm. </li></ol> 2. Collagenasi Digestione <ol><li> Rimuovere il campione dalla PBS (-), poi aggiungere 10 ml di soluzione sterile 0,1% (w / v) soluzione di collagenasi (collagenasi di tipo II) del recipiente contenente il campione di tessuto. </li><li> Macinare il tessuto con le forbici chirurgiche per circa 15 min, fino a raggiungere un composto frullatarenza. </li><li> Successivamente, digerire il tessuto tritato nel 0,1% (w / v) di collagenasi a 37 ° C per 30 min (60 rpm) in un tubo da 50 ml con leggera agitazione su un agitatore. </li><li> Filtrare il campione digerito attraverso un filtro 100 micron in un tubo da 50 ml. Avanti, passare 10 ml di DCM (vedi Tabella dei Materiali) integrato con il 2% FBS attraverso il filtro. </li></ol> Isolamento 3. cellulare <ol><li> Centrifugare le cellule filtrate a 100 xg per 1 min a RT. </li><li> A questo punto, preparare 5 ml di DCM integrato con il 2% FBS in un tubo da 50 ml. </li><li> Successivamente, elaborare le cellule di grasso galleggianti utilizzando una pipetta ml 1.000 e aggiungere le cellule di un terreno contenente 50 ml di tubo. </li><li> Successivamente, scuotere il tubo da 50 ml delicatamente per miscelare il medium DCM con le cellule. </li><li> Poi, centrifugare la provetta a 100 xg per 1 min a RT. </li><li> Eliminare il mezzo sul fondo del tubo con un ago 18 G e una siringa da 20 ml. </li><li> Successivamente, aggiungere 10 ml di DCM supplemented con 2% FBS alle cellule raccolte. </li><li> Mescolare il DCM con le cellule agitando il tubo da 50 ml con delicatezza. </li><li> Centrifugare la provetta a 100 xg per 1 min a RT. </li></ol> 4. Cellule placcatura <ol><li> Aggiungere 41 ml di DCM o DMEM supplementato con 20% FBS in un pallone 12,5 centimetri. </li><li> Successivamente, utilizzando una pipetta 200 ml aggiungere 40 ml di cellule di grasso al pallone. </li><li> Poi, riempire il pallone con DCM o DMEM supplementato con il 20% FBS. PUNTO CRITICO: A questo punto, in modo che le cellule sono diffuse in tutto il mezzo. Controllare visivamente le cellule staccate e poi tenere il pallone sul coperchio di una capsula di Petri giro per mantenerla piatta. </li><li> Infine, il recipiente all&#39;interno dell&#39;incubatrice e lasciato indisturbato in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C per 7 giorni. </li><li> Dopo una settimana di incubazione, invertire il pallone e verificare la presenza di cellule DFAT. Successivamente, valutare DFAT generazione delle cellule di competenza, come descritto da 10 a questo punto fibroblcellule AST-simile (cellule DFAT) si trovano in regioni distinte dalle cellule grasse. </li><li> Aggiungere 5 ml di DCM o DMEM supplementato con il 20% FBS al pallone dopo la rimozione del precedente mezzo di coltura cellulare. Permettono alle cellule di crescere DFAT per un&#39;altra settimana dopo aver cambiato il mezzo. </li><li> Utilizzando un contatore di cellule, contare il numero di cellule DFAT ottenuti in diverse condizioni di coltura cellulare (DCM vs. DMEM). </li></ol>

<ol><li>Lanzoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+clinical+programs+of+stem+cell+therapies+for+liver+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas.</a> Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).</li>
<li>de Girolamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%3A+a+new+%22cells+as+drugs%22+paradigm.+Efficacy+and+critical+aspects+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy.</a> Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The potential of adipose stem cells in regenerative medicine.</a> Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).</li>
<li>Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+a+treatment+for+peripheral+arterial+disease%3A+current+status+and+potential+impact+of+type+II+diabetes+on+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy.</a> Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).</li>
<li>Ringden, O., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+as+treatment+for+chronic+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD.</a> Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+adipose+stem+cells+through+dedifferentiation+of+mature+adipocytes+in+ceiling+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures.</a> J. Vis. Exp. (97), (2015).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).</li>
<li>Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeng%2C+X+%22Biomed.+Res.+Int%22">Biomed. Res. Int</a>. 2015, 673651(2015).</li>
<li>Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+properties+of+feline+dedifferentiated+fat+cells+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells.</a> Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Adipociti maturi che subiscono in vitro de-differenziazione, un processo noto come la cultura del soffitto, può tornare ad un fenotipo più primitivo e acquisire capacità proliferative. Queste cellule sono indicati come le cellule di grasso dedifferenziato (DFAT). Il potenziale di differenziazione multilineare delle cellule DFAT è stata valutata. Citometria a flusso di analisi e analisi di espressione genica hanno rivelato che le cellule DFAT erano altamente omogenea rispetto ai ASC 6. Infatti il prof...

Terapia cellulare e ingegneria dei tessuti sono temi caldi nel campo della medicina rigenerativa 1-5. Mentre queste modalità terapeutiche molto promettenti, diversi problemi tecnici attualmente ostacolano il loro uso clinico. A questo proposito, come nella generazione di cellule iPS, tutte le terapie ingegneria tissutale devono produrre celle libere di trasduzione del gene esterni al fine di mantenere la sicurezza del paziente. Di conseguenza, siamo stati il primo gruppo a produrre con successo cellule umane DFAT 6. Molti altri gruppi di ricerca hanno poi adottato il nostro metodo per generare cellule DFAT di origine mammiferi 7-9, evidenziando ulteriormente l&#39;utilità del nostro modello. Nel corso di diversi studi, abbiamo trovato che la qualità dell&#39;ambiente coltura cellulare può essere modificato regolando il contenuto del mezzo cellulare. Questa scoperta ha portato ad un aumento del tasso di successo della produzione di celle DFAT e migliore qualità delle cellule; entrambi i fattori criticigenerando in modo efficiente le cellule per i futuri studi clinici. A questo proposito, una migliore mezzo di coltura DFAT (DCM, un fluido simile al mesenchimali staminali medio cellule, che contiene insulina umana ricombinante, albumina sierica, acido L-glutammico, diversi acidi grassi e colesterolo) e un metodo per la generazione di cellule DFAT e la proliferazione è stato sviluppato (ulteriori informazioni sul contenuto di DCM è disponibile su richiesta). Utilizzando cellule di alta qualità DFAT questo metodo sono stati generati con la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui adipogenico, osteogenico, e le cellule condrogeniche. Complessivamente, questo convalidata protocollo coltura cellulare migliora la qualità delle cellule DFAT e può essere molto utile per migliorare applicazioni cliniche di terapia cellulare e ingegneria tessutale.

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC medio&nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>Questo mezzo è definito come DCM nel testo</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>Non contiene Mg2+ e Ca2+</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Takasago Medical Industry Co., Ltd</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare Falcon 100 &mu; m Giallo</td><td>CORNING SCIENZE DELLA VITA&nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>Falco 12,5 cm&sup2; Pallone rettangolare per colture cellulari con collo inclinato con tappo a vite ventilato blu</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td></td><td></td>353107</tr><tr><td>ago da 18 G</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 20 ml&nbsp;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Contatore coltro serie Z</td><td>COLTRO BECKMAN</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

L&#39;ingegneria dei tessuti e terapia cellulare molto promettenti clinicamente. A questo proposito, cellule multipotenti, come le cellule staminali mesenchimali (MSC), possono essere utilizzati terapeuticamente, nel prossimo futuro, per ripristinare la funzione di organi danneggiati. Tuttavia, diversi problemi tecnici, compresa la procedura altamente invasiva di isolare cellule staminali mesenchimali e l&#39;inefficienza che circonda il loro amplificazione, attualmente ostacolano il potenziale utilizzo clinico di queste modalità terapeutiche. Qui, si introduce un metodo molto efficiente per la generazione di cellule adipose dedifferenziate (DFAT), cellule MSC simili. È interessante notare che le cellule DFAT possono essere differenziate in diversi tipi di cellule, tra cui adipogenico, osteogenico, e le cellule condrogeniche. Anche se altri gruppi hanno precedentemente presentato vari metodi per la generazione di cellule DFAT dal tessuto adiposo maturo, il nostro metodo ci permette di produrre cellule DFAT in modo più efficiente. A questo proposito, abbiamo dimostrato che terreno di coltura DFAT (DCM), integrato con il 20% FBS,è più efficace nel generare cellule DFAT di DMEM, integrati con il 20% FBS. Inoltre, le cellule DFAT prodotte dal nostro metodo di coltura cellulare può essere redifferentiated in diversi tipi di tessuto. Come tale, un modello molto interessante e utile per lo studio di dedifferentiation tessuto è presentato.

<html> In questo studio, il metodo e il kit di strumenti per la generazione di cellule DFAT stata migliorata (Figura 1). Il nostro metodo permette di generare cellule DFAT utilizzando sia DCM e medie DMEM contenente 20% FBS (Figura 2A). Come tale, abbiamo confrontato l&#39;efficienza di DCM e DMEM nella generazione di cellule DFAT. A questo proposito, DCM migliorata proliferazione cellulare DFAT di tre volte rispetto ai DMEM, indipendentemente dal numero ...

Abbiamo modificato le condizioni per la generazione di cellule DFAT e forniamo qui informazioni riguardanti l'uso di un mezzo di crescita migliorato per la produzione di queste cellule.

Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

L'obiettivo generale di questo nuovo metodo di coltura cellulare è generare cellule adipose dedifferenziate con maggiore efficienza. Il nostro metodo potrebbe aiutare i ricercatori che operano nel campo della medicina rigenerativa a rispondere a domande fondamentali sui diversi processi coinvolti nella produzione di cellule adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Poiché il vantaggio principale del nostro protocollo di coltura cellulare consiste nel migliorare la qualità delle cellule DEFAT, potrebbe essere applicato in un futuro prossimo per ottimizzare le attuali applicazioni nella terapia cellulare e nell'ingegneria tissutale.Dopo aver portato il campione di tessuto adiposo sottocutaneo del paziente dalla sala operatoria al laboratorio, pesare il tessuto e inserire da uno a due grammi di tessuto adiposo in un tubo da 15 millilitri. Lavare quindi il campione con cinque millilitri di PBS e trasferire il campione in una piastra di plastica da 10 centimetri. Rimuovere il PBS.Quindi aggiungere 10 millilitri di collagenasi sterile al 0,1% peso/volume alla piastra contenente il campione. Successivamente, utilizzare forbici chirurgiche per tritare il tessuto fino a raggiungere una co

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Gli adipociti maturi possono rappresentare un'abbondante fonte di cellule staminali attraverso la dedifferenziazione, che porta a una popolazione omogenea di cellule simili a fibroblasti. La digestione della collagenasi viene utilizzata per isolare gli adipociti maturi dal grasso umano. L'obiettivo del nostro protocollo è quello di ottenere cellule adipose multipotenti e dedifferenziate da adipociti maturi umani.

Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.

Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.

Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo

Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.

Robusta differenziazione delle iPSC umane in una popolazione pura di adipociti per studiare i disturbi associati agli adipociti

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Questo protocollo delinea l'isolamento di progenitori fibro-adipogenici (FAP) scheletrici e cardiaci da topi spinosi (Acomys) tramite dissociazione enzimatica e smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. I FAP ottenuti da questo protocollo possono essere efficacemente espansi e differenziati a miofibroblasti e adipociti.

Isolamento, espansione e differenziazione dei progenitori fibro-adipogenici dal modello murino spinoso

Qui, presentiamo un protocollo in grado di trasformare il tessuto adiposo autologo in varie sostanze componenti adipose con diverse proprietà e funzioni fisico-chimiche.

Innovativo frazionamento del tessuto adiposo per trasformare il grasso in componenti specializzati

Qui presentiamo un metodo standard per isolare in modo efficiente cellule staminali e adipociti derivati dalle adipoci, caratterizzato da una riduzione del &gt;90% dei tempi di lavorazione, un'elevata vitalità cellulare e una compatibilità ampia.

Isolamento efficiente di cellule staminali e adipociti derivati dall'adiposo dal tessuto adiposo suino

Scopri un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziate (DFAT) con un nuovo mezzo di coltura. Questo protocollo migliora la qualità cellulare per applicazioni in medicina rigenerativa e ingegneria tissutale.

Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

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