Name: Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Scopri un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziate (DFAT) con un nuovo mezzo di coltura. Questo protocollo migliora la qualità cellulare per applicazioni in medicina rigenerativa e ingegneria tissutale.

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Questa ricerca è stata supportata in parte dal Programma per la creazione di start-up da ricerca e tecnologia avanzate (Programma START) della Società giapponese per la promozione della scienza (ST261006IP, TM) e dal Programma per la Fondazione di ricerca strategica presso università private (2014-2019) (S1411018, TM) del Ministero dell'istruzione, dello sport, della scienza e della tecnologia.

I campioni di grasso sottocutaneo umano sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia nei dipartimenti di Chirurgia Plastica, Urologia, Chirurgia Pediatrica e Chirurgia Ortopedica dell&#39;Ospedale Nihon dell&#39;Università Itabashi (Tokyo, Giappone). I pazienti hanno dato consenso informato scritto, e il Comitato Etico della Nihon University School of Medicine ha approvato lo studio. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Portare il campione di tessuto dalla sala operatoria al laboratorio. </li><li> Lavare 1-2 g di tessuto adiposo con 5 ml di PBS (-) a temperatura ambiente (RT), una volta, in un tubo da 50 ml e quindi posizionare il campione in un piatto di plastica 10 cm. </li></ol> 2. Collagenasi Digestione <ol><li> Rimuovere il campione dalla PBS (-), poi aggiungere 10 ml di soluzione sterile 0,1% (w / v) soluzione di collagenasi (collagenasi di tipo II) del recipiente contenente il campione di tessuto. </li><li> Macinare il tessuto con le forbici chirurgiche per circa 15 min, fino a raggiungere un composto frullatarenza. </li><li> Successivamente, digerire il tessuto tritato nel 0,1% (w / v) di collagenasi a 37 ° C per 30 min (60 rpm) in un tubo da 50 ml con leggera agitazione su un agitatore. </li><li> Filtrare il campione digerito attraverso un filtro 100 micron in un tubo da 50 ml. Avanti, passare 10 ml di DCM (vedi Tabella dei Materiali) integrato con il 2% FBS attraverso il filtro. </li></ol> Isolamento 3. cellulare <ol><li> Centrifugare le cellule filtrate a 100 xg per 1 min a RT. </li><li> A questo punto, preparare 5 ml di DCM integrato con il 2% FBS in un tubo da 50 ml. </li><li> Successivamente, elaborare le cellule di grasso galleggianti utilizzando una pipetta ml 1.000 e aggiungere le cellule di un terreno contenente 50 ml di tubo. </li><li> Successivamente, scuotere il tubo da 50 ml delicatamente per miscelare il medium DCM con le cellule. </li><li> Poi, centrifugare la provetta a 100 xg per 1 min a RT. </li><li> Eliminare il mezzo sul fondo del tubo con un ago 18 G e una siringa da 20 ml. </li><li> Successivamente, aggiungere 10 ml di DCM supplemented con 2% FBS alle cellule raccolte. </li><li> Mescolare il DCM con le cellule agitando il tubo da 50 ml con delicatezza. </li><li> Centrifugare la provetta a 100 xg per 1 min a RT. </li></ol> 4. Cellule placcatura <ol><li> Aggiungere 41 ml di DCM o DMEM supplementato con 20% FBS in un pallone 12,5 centimetri. </li><li> Successivamente, utilizzando una pipetta 200 ml aggiungere 40 ml di cellule di grasso al pallone. </li><li> Poi, riempire il pallone con DCM o DMEM supplementato con il 20% FBS. PUNTO CRITICO: A questo punto, in modo che le cellule sono diffuse in tutto il mezzo. Controllare visivamente le cellule staccate e poi tenere il pallone sul coperchio di una capsula di Petri giro per mantenerla piatta. </li><li> Infine, il recipiente all&#39;interno dell&#39;incubatrice e lasciato indisturbato in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C per 7 giorni. </li><li> Dopo una settimana di incubazione, invertire il pallone e verificare la presenza di cellule DFAT. Successivamente, valutare DFAT generazione delle cellule di competenza, come descritto da 10 a questo punto fibroblcellule AST-simile (cellule DFAT) si trovano in regioni distinte dalle cellule grasse. </li><li> Aggiungere 5 ml di DCM o DMEM supplementato con il 20% FBS al pallone dopo la rimozione del precedente mezzo di coltura cellulare. Permettono alle cellule di crescere DFAT per un&#39;altra settimana dopo aver cambiato il mezzo. </li><li> Utilizzando un contatore di cellule, contare il numero di cellule DFAT ottenuti in diverse condizioni di coltura cellulare (DCM vs. DMEM). </li></ol>

<ol><li>Lanzoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+clinical+programs+of+stem+cell+therapies+for+liver+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas.</a> Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).</li>
<li>de Girolamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%3A+a+new+%22cells+as+drugs%22+paradigm.+Efficacy+and+critical+aspects+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy.</a> Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The potential of adipose stem cells in regenerative medicine.</a> Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).</li>
<li>Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+a+treatment+for+peripheral+arterial+disease%3A+current+status+and+potential+impact+of+type+II+diabetes+on+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy.</a> Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).</li>
<li>Ringden, O., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+as+treatment+for+chronic+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD.</a> Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+adipose+stem+cells+through+dedifferentiation+of+mature+adipocytes+in+ceiling+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures.</a> J. Vis. Exp. (97), (2015).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).</li>
<li>Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeng%2C+X+%22Biomed.+Res.+Int%22">Biomed. Res. Int</a>. 2015, 673651(2015).</li>
<li>Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+properties+of+feline+dedifferentiated+fat+cells+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells.</a> Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Adipociti maturi che subiscono in vitro de-differenziazione, un processo noto come la cultura del soffitto, può tornare ad un fenotipo più primitivo e acquisire capacità proliferative. Queste cellule sono indicati come le cellule di grasso dedifferenziato (DFAT). Il potenziale di differenziazione multilineare delle cellule DFAT è stata valutata. Citometria a flusso di analisi e analisi di espressione genica hanno rivelato che le cellule DFAT erano altamente omogenea rispetto ai ASC 6. Infatti il prof...

Terapia cellulare e ingegneria dei tessuti sono temi caldi nel campo della medicina rigenerativa 1-5. Mentre queste modalità terapeutiche molto promettenti, diversi problemi tecnici attualmente ostacolano il loro uso clinico. A questo proposito, come nella generazione di cellule iPS, tutte le terapie ingegneria tissutale devono produrre celle libere di trasduzione del gene esterni al fine di mantenere la sicurezza del paziente. Di conseguenza, siamo stati il primo gruppo a produrre con successo cellule umane DFAT 6. Molti altri gruppi di ricerca hanno poi adottato il nostro metodo per generare cellule DFAT di origine mammiferi 7-9, evidenziando ulteriormente l&#39;utilità del nostro modello. Nel corso di diversi studi, abbiamo trovato che la qualità dell&#39;ambiente coltura cellulare può essere modificato regolando il contenuto del mezzo cellulare. Questa scoperta ha portato ad un aumento del tasso di successo della produzione di celle DFAT e migliore qualità delle cellule; entrambi i fattori criticigenerando in modo efficiente le cellule per i futuri studi clinici. A questo proposito, una migliore mezzo di coltura DFAT (DCM, un fluido simile al mesenchimali staminali medio cellule, che contiene insulina umana ricombinante, albumina sierica, acido L-glutammico, diversi acidi grassi e colesterolo) e un metodo per la generazione di cellule DFAT e la proliferazione è stato sviluppato (ulteriori informazioni sul contenuto di DCM è disponibile su richiesta). Utilizzando cellule di alta qualità DFAT questo metodo sono stati generati con la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui adipogenico, osteogenico, e le cellule condrogeniche. Complessivamente, questo convalidata protocollo coltura cellulare migliora la qualità delle cellule DFAT e può essere molto utile per migliorare applicazioni cliniche di terapia cellulare e ingegneria tessutale.

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC medio&nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>Questo mezzo è definito come DCM nel testo</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>Non contiene Mg2+ e Ca2+</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Takasago Medical Industry Co., Ltd</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare Falcon 100 &mu; m Giallo</td><td>CORNING SCIENZE DELLA VITA&nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>Falco 12,5 cm&sup2; Pallone rettangolare per colture cellulari con collo inclinato con tappo a vite ventilato blu</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td></td><td></td>353107</tr><tr><td>ago da 18 G</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 20 ml&nbsp;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Contatore coltro serie Z</td><td>COLTRO BECKMAN</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

L&#39;ingegneria dei tessuti e terapia cellulare molto promettenti clinicamente. A questo proposito, cellule multipotenti, come le cellule staminali mesenchimali (MSC), possono essere utilizzati terapeuticamente, nel prossimo futuro, per ripristinare la funzione di organi danneggiati. Tuttavia, diversi problemi tecnici, compresa la procedura altamente invasiva di isolare cellule staminali mesenchimali e l&#39;inefficienza che circonda il loro amplificazione, attualmente ostacolano il potenziale utilizzo clinico di queste modalità terapeutiche. Qui, si introduce un metodo molto efficiente per la generazione di cellule adipose dedifferenziate (DFAT), cellule MSC simili. È interessante notare che le cellule DFAT possono essere differenziate in diversi tipi di cellule, tra cui adipogenico, osteogenico, e le cellule condrogeniche. Anche se altri gruppi hanno precedentemente presentato vari metodi per la generazione di cellule DFAT dal tessuto adiposo maturo, il nostro metodo ci permette di produrre cellule DFAT in modo più efficiente. A questo proposito, abbiamo dimostrato che terreno di coltura DFAT (DCM), integrato con il 20% FBS,è più efficace nel generare cellule DFAT di DMEM, integrati con il 20% FBS. Inoltre, le cellule DFAT prodotte dal nostro metodo di coltura cellulare può essere redifferentiated in diversi tipi di tessuto. Come tale, un modello molto interessante e utile per lo studio di dedifferentiation tessuto è presentato.

<html> In questo studio, il metodo e il kit di strumenti per la generazione di cellule DFAT stata migliorata (Figura 1). Il nostro metodo permette di generare cellule DFAT utilizzando sia DCM e medie DMEM contenente 20% FBS (Figura 2A). Come tale, abbiamo confrontato l&#39;efficienza di DCM e DMEM nella generazione di cellule DFAT. A questo proposito, DCM migliorata proliferazione cellulare DFAT di tre volte rispetto ai DMEM, indipendentemente dal numero ...

Abbiamo modificato le condizioni per la generazione di cellule DFAT e forniamo qui informazioni riguardanti l'uso di un mezzo di crescita migliorato per la produzione di queste cellule.

Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

L'obiettivo generale di questo nuovo metodo di coltura cellulare è generare cellule adipose dedifferenziate con maggiore efficienza. Il nostro metodo potrebbe aiutare i ricercatori che operano nel campo della medicina rigenerativa a rispondere a domande fondamentali sui diversi processi coinvolti nella produzione di cellule adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Poiché il vantaggio principale del nostro protocollo di coltura cellulare consiste nel migliorare la qualità delle cellule DEFAT, potrebbe essere applicato in un futuro prossimo per ottimizzare le attuali applicazioni nella terapia cellulare e nell'ingegneria tissutale.Dopo aver portato il campione di tessuto adiposo sottocutaneo del paziente dalla sala operatoria al laboratorio, pesare il tessuto e inserire da uno a due grammi di tessuto adiposo in un tubo da 15 millilitri. Lavare quindi il campione con cinque millilitri di PBS e trasferire il campione in una piastra di plastica da 10 centimetri. Rimuovere il PBS.Quindi aggiungere 10 millilitri di collagenasi sterile al 0,1% peso/volume alla piastra contenente il campione. Successivamente, utilizzare forbici chirurgiche per tritare il tessuto fino a raggiungere una consistenza omogenea. Trasferire il tessuto tritato e la soluzione di collagenasi in un tubo da centrifuga da 15 millilitri ed eseguire la digestione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, agitando a 60 giri al minuto.Dopo la digestione, filtrare il campione digerito attraverso un filtro da 100 micron in un nuovo tubo da 15 millilitri. Successivamente, far passare 10 millilitri di mezzo di coltura DEFAT integrato con FBS al 2% attraverso il filtro. Per isolare le cellule adipose dalla sospensione cellulare, centrifugare innanzitutto le cellule filtrate a 100 ×g per un minuto a temperatura ambiente.Durante la centrifugazione, preparare cinque millilitri di DCM integrato con FBS al 2% in un tubo da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per aspirare le cellule adipose galleggianti dal tubo centrifugato e aggiungere le cellule in un tubo da 15 millilitri contenente il mezzo. Agitare delicatamente il tubo per mescolare il mezzo DCM con le cellule.Quindi, centrifugare il tubo a 100 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, utilizzare un ago da 18 gauge e una siringa da 20 millilitri per rimuovere il mezzo presente nella parte inferiore del tubo. Aggiungere quindi 10 millilitri di DCM integrato con FBS al 2% alle cellule e mescolare agitando delicatamente il tubo.Centrifugare nuovamente le cellule a 100 ×g per un minuto a temperatura ambiente. Per iniziare la semina, aggiungere 41 millilitri di DCM o DMEM integrati con FBS al 20% in un’aliquota da 12,5 centimetri. Quindi utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aspirare 40 microlitri di adipociti e aggiungerli al flacone.Poi riempire il becher con DCM o DMEM integrato con FBS al 20%. È fondamentale che le cellule siano distribuite uniformemente nel mezzo. Posizionare il becher sul coperchio di una piastra di Petri rotonda per mantenerlo in posizione orizzontale.Infine, posizionare il matraccio all'interno di un'incubatrice regolata al 5% di anidride carbonica e a 37 gradi Celsius e lasciarlo indisturbato per sette giorni. Dopo una settimana di incubazione, capovolgere il matraccio e verificare la presenza di cellule adipose dedifferenziate. Successivamente, aspirare il mezzo e aggiungere cinque millilitri di DCM o DMEM integrato con il 20% di FBS al matraccio.Lasciare crescere le cellule DEFAT per un'altra settimana dopo il cambio del mezzo. Dopo una settimana, utilizzare un contatore cellulare per contare il numero di cellule DEFAT generate in diverse condizioni di coltura cellulare. Questa immagine mostra colonie di cellule DEFAT dopo 14 giorni di coltura in DMEM.Qui le cellule DEFAT sono mostrate dopo 14 giorni di coltura in DCM. In ogni caso, la barra della scala rappresenta 200 micron. La proliferazione delle cellule DEFAT è stata quantificata utilizzando un contatore cellulare, ed è stato confrontato l'efficienza di DCM e DMEM nella generazione di cellule DEFAT.Come mostrato qui, si osserva un aumento della proliferazione cellulare con l'uso del DCM. In questo caso, cellule umane DEFAT generate utilizzando il DCM sono state coltivate per tre settimane in appositi mezzi di induzione per valutare le capacità di ridifferenziamento e differenziamento delle cellule DEFAT. Le cellule hanno mostrato capacità osteogenica mediante colorazione per la fosfatasi alcalina e con la colorazione di Alizarina Rosso S. Infine, la capacità adipogenica è stata dimostrata mediante colorazione con Oil Red O.È molto importante assicurarsi che la digestione con collagenasi e l'isolamento delle cellule adipose vengano entrambi eseguiti con la massima attenzione per generare con successo cellule DEFAT di alta qualità. Attraverso questi sforzi, il nostro metodo di coltura cellulare validato mira a facilitare gli sforzi di ricerca attuali e futuri nei campi della biologia dello sviluppo e della medicina rigenerativa.

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Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

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