Name: Imitando la funzione di proteine di segnalazione: Verso artificiale trasduzione del segnale Therapy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Scopri come sviluppare trasduttori chimici sintetici per la comunicazione proteica innaturale. Questo metodo biochimico utilizza aptameri PDGF e spettrofotometria per attivare enzimi detossificanti e avanzare verso terapie innovative di trasduzione del segnale artificiale.

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Minerva, l&#39;Organizzazione HFSP, e un Consiglio di Grant europeo della ricerca (Starting Grant 338.265).

1. Sintesi della &#39;chimica trasduttore&#39; <ol><li> I preparativi preliminari <ol><li> Preparare 2 M trietilammonio acetato (TEAA) tampone mescolando 278 ml di trietilammina con 114 ml di acido acetico e 400 ml di acqua ultrapura. Regolare il pH a 7 e aggiungere acqua ad un volume finale di 1 L. Conservare in una bottiglia scura. Nota: Questa soluzione è stabile per anni. </li><li> Preparare una soluzione di acido ascorbico 5 mM sciogliendo 18 mg di acido ascorbico in 20 ml di acqua ultrapura. Utilizzare una soluzione fresca; la soluzione è stabile per un giorno. </li><li> Preparare una (II) soluzione 10 mM Cu / Tris (benzyltriazolylmethyl) ammina (TBTA) sciogliendo 25 mg di rame (II) pentaidrato solfato in 10 ml di acqua ultrapura e 58 mg di TBTA in 11 ml dimetilsolfossido (DMSO). Mescolare le due soluzioni. Mantenere a temperatura ambiente e proteggerla dalla luce. </li></ol></li><li> procedura Coniugazione <ol><li> Sciogliere 100 nmol del oligonucleotide modificato (ODN-1) in 80 microlitridi acqua ultrapura fresca. Aggiungere 20 ml di 2 M TEAA, pH = 7. Aggiungere 80 ml di una soluzione preparata di acido ascorbico (5 mM in acqua). </li><li> Sciogliere 1,5 mmol (574,5 mg) di acido etacrinico azido-modificato in 180 ml di DMSO e aggiungerlo alla soluzione. Degassare la soluzione con Argon per 60 sec e rapidamente aggiungere 40 microlitri da (II) soluzione Cu / TBTA (10 mM in 55% (v / v) DMSO / acqua). </li><li> Spurgare di nuovo con Argon e chiudere, e mescolare durante la notte. </li><li> Monitorare l&#39;avanzamento della reazione e purificare il coniugato mediante RP-HPLC (fase mobile: A) 5% acetonitrile, 5% TEAA, 90% di acqua ultrapura; B) 65% acetonitrile, 5% TEAA, il 30% di acqua ultrapura). 24 </li></ol></li></ol> 2. Controllo GST attività da PDGF <ol><li> I preparativi preliminari <ol><li> Preparare 50 ml del tampone Assay mescolando 33,9 ml di tampone fosfato (PBSx1) con 16,1 ml di acqua ultrapura per ottenere una concentrazione finale di fosfato 8 mM e annuncid 23,8 mg di MgCl 2 per ottenere un 5 mm di concentrazione finale. </li><li> Preparare una soluzione stock di GST M1-1 sciogliendo la proteina in un tampone contenente 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolo (DTT), e 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) ad una concentrazione finale di 30 pM. Dividere questa soluzione in piccole aliquote e conservare a -80 ° C. Diluire fresco, secondo la sezione 2.1.5.1, nel tampone e tenere in ghiaccio. Nota: la soluzione sarà stabile per circa 5 ore, o fino a quando vi è una riduzione dell&#39;attività enzimatica. </li><li> Preparare il supporto secondo le seguenti istruzioni: <ol><li> Disciogliere 10 mg di glutatione ridotto (GSH) in 325 ml di acqua ultrapura per una concentrazione finale di 100 mM soluzione madre. Diluire 21 ml di questa soluzione madre in 979 ml di tampone per una concentrazione finale di 2,1 soluzione di lavoro mm. </li><li> Sciogliere 10 mg di 2,4-dinitroclorobenzene (CDNB) in 492 ml di postathanol ad una concentrazione finale di 100 soluzione madre mm. Diluire 43,2 ml di soluzione madre in 956,8 ml di un tampone per una concentrazione finale di 4.32 soluzione di lavoro mm. </li></ol></li><li> In una piastra da 96 pozzetti, mettere ogni substrato in una riga separata (12 pozzetti). Inserire almeno 60 microlitri in ciascun pozzetto per permettere semplice e veloce prelievo della soluzione. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per la protezione dalla luce. </li><li> Preparare le seguenti soluzioni madre nel buffer Assay: <ol><li> Diluire GST M1-1 da 50 ad una concentrazione finale di 0,6 mM del dimero. </li><li> Diluire il &#39;trasduttore chimica&#39; per un 30 micron soluzione madre. </li><li> Diluire PDGF ad una concentrazione finale di 40 pM. </li><li> Diluire PDGF aptamero ad una concentrazione finale di 250 mM. </li></ol></li></ol></li><li> Misurare la GST attività nel presenza della &#39;trasduttore chimica&#39; e PDGF. <ol><li> Impostare una procedura sperimentale in per il lettore di piastre per la misurazione cinetica. <ol><li> Creare un nuovo esperimento come un &#39;protocollo standard&#39;. </li><li> Premere &#39;procedura&#39; per aprire la finestra delle impostazioni della procedura. </li><li> Nell&#39;elenco comparsa sul lato superiore della finestra, scegliere il tipo &#39;384 piastra&#39; secondo il produttore piatto. </li><li> Premere &#39;Leggi&#39; nel menu a sinistra. </li><li> Per quanto riguarda il metodo di rilevamento scegliere &#39;assorbanza&#39;. </li><li> Per quanto riguarda il tipo di lettura scegliere &#39;Punto finale&#39;. </li><li> Valuta 340 nm sulla finestra di lunghezza d&#39;onda. </li><li> Premete sul fondo &#39;Piatto pieno&#39; sul lato superiore destro e scegliere il bene da misurare. </li><li> Premere &#39;OK&#39; per chiudere la finestra &#39;Leggi&#39;. </li><li> Scegliere &#39;iniziare cinetica&#39; nel menu a sinistra. </li><li> Effettuare il tempo di esecuzione 10 min. </li><li> Selezionare l&#39;opzione intervalli minimi. </li><li> Premere &#39;OK&#39; per chiudere la finestra cinetica. </li><li> Trascinare il &#39;Leggi&#39; i lineanto la misurazione cinetica. </li><li> Premere il pulsante &#39;convalidare&#39; e poi il pulsante &#39;OK&#39;. </li><li> Salvare l&#39;esperimento. </li><li> Premere il tasto &#39;play&#39;. Apparirà una finestra di dialogo - solo premere il pulsante &#39;OK&#39; quando deve essere avviato la misurazione. </li></ol></li><li> Per eseguire l&#39;esperimento triplicato, preparare quattro campioni contenenti ciascuna 3,25 microlitri del &#39;trasduttore chimica&#39; e 3.25 ml di GST M1-1. Aggiungere ad ogni campione 0, 1.2, 2.4 o 4.9 ml di PDGF e 123.5, 122.3, 121.1, o 118,6 ml di tampone di dosaggio, rispettivamente. </li><li> Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> In un piatto ben 384-trasparente, inserire 40 ml di campione a ciascun pozzetto. Inserire i campioni soltanto nei pozzetti dispari o solo nei pozzetti anche nella stessa linea per consentire l&#39;uso di un multi-pipetta per l&#39;aggiunta del substrato. </li><li> Utilizzando un 12-channel multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 ml di ciascuno dei tegli substrati che sono stati pre-preparati nella piastra a 96 pozzetti (sezione 2.1.4). Mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica. Poiché la cinetica GST è abbastanza veloce, cercare di minimizzare il tempo tra substrato aggiunta e l&#39;inizio della misurazione cinetica. </li></ol></li><li> GST attivazione / inibizione Cicli mediato dal &#39;trasduttore chimica&#39;. <ol><li> Per eseguire l&#39;esperimento triplicato, preparare 5 campioni contenenti ciascuno 84,5 ml di tampone, 3,25 ml di &#39;trasduttore chimico&#39;, e 3,25 ml di GST M1-1. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Aggiungere 3,65 ml di tampone per il campione 1 e 3,65 ml di PDGF ai campioni 2-5. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Aggiungere 3.12 ml di tampone per campioni 1-2 e 3.12 ml di PDGF aptameri ai campioni 3-5. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Aggiungere 24,4 ml di tampone per campioni1-3 e 24,4 ml di PDGF ai campioni 4-5. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Aggiungere 7,8 microlitri di tampone del saggio di campioni 1-4 e 7,8 ml di PDGF aptameri a campione 5. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> In un piatto ben 384-trasparente, inserire 40 ml di campione in ciascun pozzetto. campioni Inserire solo nel dispari o solo nelle addirittura pozzi nella stessa linea. </li><li> Utilizzando un 12-channel multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 microlitri di ciascun substrato (pre-preparata nella piastra a 96 pozzetti). Mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica. </li><li> Calcolare il V 0 [Mod / min] in ciascuna condizione sottraendo il OD misurata a 340 nm at = 0.5 min dalla OD misurata a 340 nm at = 1.5 min per valutare l&#39;attivazione / inibizione della riciclabilità. 25 </li></ol></li><li> Valutare la risposta in tempo reale del &#39;trasduttore chimica&#39; per cambiamenti nell&#39;ambiente. <ol> &lt;li&gt; effetto in tempo reale di PDGF aggiunta <ol><li> Impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica. </li><li> Ripetere i passaggi 2.2.1.1-2.2.1.10. </li><li> Effettuare il tempo di funzionamento 3.5 min. </li><li> Selezionare l&#39;opzione intervalli minimi. </li><li> Premere &#39;OK&#39; per chiudere la finestra cinetica. </li><li> Trascinare la linea di &#39;Leggere&#39; nella misurazione cinetica. </li><li> Scegli Piastra Out / In nel menu a sinistra. </li><li> Scegliere l&#39;opzione &#39;piatto fuori (senza finestra)&#39;. </li><li> Scegliere l&#39;opzione &#39;Gara&#39; nel menu a sinistra ed entrate 30 sec. </li><li> Scegli Piastra Out / In nel menu a sinistra. </li><li> Scegliere il &#39;piatto in (senza finestra)&#39; opzione. </li><li> Creare una seconda misura cinetica ripetendo i passi 2.2.1.4 - 2.2.1.14 ma nella sezione 2.2.1.11 impostare la cinetica di essere 25 min invece di 10 min. </li><li> Premere il pulsante &#39;convalidare&#39; e poi il pulsante &#39;OK&#39;. </li><li> Salvare l&#39;esperimento. </li><li> Premere il tasto &#39;PLApulsante Y &#39;. Apparirà una finestra di dialogo - solo premere il pulsante &#39;OK&#39; quando deve essere avviato la misurazione. </li><li> Preparare due campioni mescolando 1 ml di GST M1-1 e 1 ml di &#39;trasduttore chimica&#39; in 38 ml di tampone. Inserire i campioni in due pozzetti di una piastra ben 384-trasparente, lasciando un pozzo vuoto tra questi due pozzetti. </li><li> Utilizzando un 12 canali multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 ml di ogni substrato, mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle, inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica. </li><li> Quando la piastra si apre (dopo 3,5 min), aggiungere rapidamente 1.125 ml di PDGF ad uno dei pozzi, mescolare delicatamente, e lasciare che la piastra di chiusura per le misurazioni cinetiche rimanenti. </li></ol></li><li> effetto reale tempo di aggiunta del aptamer PDGF <ol><li> Ripetere i passaggi 2.4.1.1-2.4.1.15. </li><li> Preparare due campioni mescolando 1 ml di GST M1-1, 1 ml di &#39;trasduttore chimica &#39;, e 1.125 ml di PDGF a 36,9 ml di tampone. Inserire i campioni in due pozzetti di una piastra ben 384-trasparente, lasciando un pozzo vuoto tra questi due pozzetti. </li><li> Utilizzando un 12 canali multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 ml di ogni substrato, mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle, inserire la piastra nel lettore, e avviare la misurazione cinetica. </li><li> Quando la piastra si apre (dopo 1,5 min), aggiungere rapidamente 1,2 ml di PDGF aptameri ad uno dei pozzi, mescolare delicatamente e lasciare che la piastra di chiusura per le misurazioni cinetiche rimanenti. </li></ol></li></ol></li><li> Misurare JS-K Prodrug attivazione da GST in presenza della &#39;trasduttore chimica&#39; e PDGF. <ol><li> Impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica. <ol><li> Creare un nuovo esperimento come un &#39;protocollo standard&#39;. </li><li> Premere &#39;procedura&#39; per aprire la finestra delle impostazioni della procedura.</li><li> Nella lista pop-up sulla parte superiore della finestra di scegliere il tipo &#39;384 piastra&#39; secondo il produttore piatto. </li><li> Premere &#39;Leggi&#39; nel menu a sinistra. </li><li> Per quanto riguarda il metodo di rilevazione scelto &#39;assorbanza&#39;. </li><li> Per quanto riguarda il tipo di lettura scegliere &#39;Punto finale&#39;. </li><li> Valuta 305 nm sulla finestra di lunghezza d&#39;onda. </li><li> Premere il pulsante &#39;Piatto pieno&#39; sul lato superiore destro e scegliere il bene da misurare. </li><li> Premere &#39;OK&#39; per chiudere la finestra &#39;Leggi&#39;. </li><li> Scegliere &#39;iniziare cinetica&#39; nel menu a sinistra. </li><li> Effettuare il tempo di esecuzione 10 min. </li><li> Selezionare l&#39;opzione intervalli minimi. </li><li> Premere &#39;OK&#39; per chiudere la finestra cinetica. </li><li> Trascinare la linea di &#39;Leggere&#39; nella misurazione cinetica. </li><li> Premere il pulsante &#39;convalidare&#39; e poi il pulsante &#39;OK&#39;. </li><li> Salvare l&#39;esperimento. </li><li> Premere il tasto &#39;play&#39;. Una finestra di dialogo box apparirà - solo premere il pulsante &#39;OK&#39; quando deve essere avviato la misurazione. </li></ol></li><li> Per la produzione di NO misurazioni utilizzare un kit calorimetrica nitriti / nitrati. In una piastra da 96 pozzetti inserire 50 ml di tampone in una riga, 70 ml di Griess I reattivo nella seconda fila, e 70 ml di Griess II reattivo nella terza fila. </li><li> Per eseguire l&#39;esperimento triplicato, preparare quattro campioni contenenti ciascuna 4,8 microlitri del &#39;trasduttore chimica&#39;. Per campionare 1, aggiungere 155,2 ml di tampone; per assaggiare 2, aggiungere 3,2 ml di GST-M1-1 e 152 ml di tampone; per assaggiare 3, aggiungere 9,6 ml di PDGF e 145,6 ml di tampone; e per assaggiare 4, aggiungere 3,2 ml di GST-M1-1, 9,6 ml di PDGF, e 142,4 ml di tampone. </li><li> Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> In una piastra ben 384-trasparente, inserire 50 ml di campione in ciascun pozzetto. campioni Inserire solo nel dispari o solo nelanche pozzetti di una stessa linea per consentire l&#39;uso di un multi-pipetta per l&#39;aggiunta del substrato. </li><li> Aggiungere 0,54 ml di JS-K (5 mm in DMSO) in ciascun pozzetto. </li><li> Utilizzando un 12 canali multi-pipetta, aggiungere rapidamente 10 ml di soluzione di GSH (pre-preparati nella piastra a 96 pozzetti), mescolare delicatamente e rapidamente per evitare le bolle. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica. </li><li> Immediatamente dopo la misurazione cinetica, con un 12 canali multi-pipetta, prendere 50 ml di ogni campione nella fila tampone nella piastra a 96 pozzetti pre-preparati e aggiungere rapidamente ad esso 50 ml di Griess I reagenti e 50 ml di Griess II reagente. Incubare proteggendo dalla luce per 10 minuti a RT e misurare l&#39;assorbanza a 550 nm. Nota: Il tampone e volumi reagenti dipendono protocollo dei kit. </li></ol></li></ol>

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<li>Unger-Angel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+recognition+by+bivalent%2C+%27turn-on%27+fluorescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes.</a> Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).</li>
<li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li>
<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo presentato un metodo per la progettazione e il test di un "trasduttore chimico" in grado di indurre una comunicazione artificiale tra due proteine naturalmente non correlate, GST e PDGF, senza modificare le proteine native. Le comunicazioni innaturali GST-PDGF potrebbero essere rilevate in tempo reale utilizzando saggi enzimatici che seguono i cambiamenti nell'attività del GST in presenza del "trasduttore chimico" e aumentando le concentrazioni di PDGF. Oltre a rilevare l'attivazione della GST da parte del PDGF, ...

Vie di trasduzione del segnale giocano un ruolo significativo praticamente in ogni processo cellulare e permettono alla cellula di rispondere rapidamente a segnali ambientali. 1 Questi percorsi sono spesso innescati dal legame di una molecola di segnalazione ad un recettore extracellulare, che si traduce in attivazione di enzimi intracellulari. Amplificazione e propagazione di questo segnale all&#39;interno della cellula è mediata dalla funzione di segnalazione proteine ​​che formano una rete di interazioni proteina-proteina in cui gli enzimi sono reversibilmente attivati ​​con elevata specificità. A causa disregolazione di queste reti porta spesso allo sviluppo del cancro, c&#39;è stato molto interesse a stabilire &#39;trasduzione del segnale terapia del cancro&#39;, 2 in cui i farmaci sono progettati per distruggere vie di segnalazione maligni. Abbiamo recentemente proposto un approccio alternativo per segnalare terapia trasduzione che si basa sulla capacità dei farmaci di generare trasduzione del segnale innaturali. <sup&gt; 3 In particolare, riteniamo che progettando agenti sintetici che mimano la funzione di proteine di segnalazione, sarebbe possibile modulare la funzione della cellula indirettamente. Ad esempio, queste reti artificiali possono consentire proteine ​​biomarcatori per attivare gli enzimi che solcano profarmaci. In alternativa, questi mimetici proteina di segnalazione potrebbero essere in grado di attivare vie di segnalazione cellulare innaturali, con conseguente effetti terapeutici. Per dimostrare la fattibilità di questo approccio, abbiamo recentemente creato una sintetica &#39;trasduttore chimico&#39; 4, che consente il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) per attivare la scissione di un profarmaco antitumorale attivando glutatione-s-transferasi (GST), che è non il suo partner naturale vincolante. La struttura di questo &#39;trasduttore&#39; costituito da un anti-PDGF aptamer DNA che viene modificato con un inibitore bivalente per GST. Quindi, questo agente sintetico appartiene ad una famiglia di molecole con i siti di legame perdiverse proteine, 5-7 come induttori chimici di dimerizzazione (CID) 8-10 e anche al gruppo di proteine-leganti basato su coniugati molecola oligonucleotidi sintetici. 11-21 I principi generali alla base della progettazione di tali sistemi sono descritti nel presente documento e protocolli dettagliati per sintetizzare e testare la funzione di questo &#39;trasduttore&#39; con saggi enzimatici convenzionali sono forniti. Questo lavoro è destinato a facilitare lo sviluppo di &quot;trasduttori&quot; aggiuntivi di questa classe, che può essere usato per mediare comunicazione proteina-proteina intracellulare e conseguentemente, per indurre vie di segnalazione delle cellule artificiali. La figura 1 descrive schematicamente i principi di funzionamento di sintesi &#39;trasduttori chimici&#39; che possono mediare la comunicazione proteina-proteina innaturali. In questa illustrazione, un &#39;trasduttore chimica&#39;, che integra leganti sintetici per proteins I e II (leganti I e II), consente proteina II per innescare l&#39;attività catalitica della proteina I, che non è il suo partner naturale vincolante. In assenza di proteine II, il trasduttore lega il sito catalitico dell&#39;enzima (proteina I) e inibisce la sua attività (Figura 1, stato ii). Il legame del &#39;trasduttore&#39; alle proteine II, tuttavia, promuove interazioni tra legante I e la superficie della proteina II (Figura 1, stato iii), che riduce l&#39;affinità verso proteine I. Di conseguenza, la concentrazione efficace del &#39; libera trasduttore &#39;nella soluzione viene ridotta, il che porta alla dissociazione del trasduttore-proteina complesso I e riattivazione della proteina I (Figura 1, stato iv). Nel loro insieme, questi passi in evidenza tre principi fondamentali alla base della progettazione di &quot;trasduttori &#39;efficienti: (1) un&#39; sensore &#39;dovrebbe avere un legante specifico per ciascuno dei bersagli proteici, (2) l&#39;interazione between legante II e proteine ​​II dovrebbe essere più forte l&#39;interazione tra binder I e proteine ​​I, e (3) binder devo essere in grado di interagire con la superficie della proteina II. Quest&#39;ultimo principio non richiede necessariamente che legante io solo avrebbe un alta affinità e selettività verso proteine ​​II. Invece, si basa su nostri recenti studi che hanno dimostrato che portare una molecola sintetica in prossimità di una proteina è in grado di favorire interazioni tra questa molecola e la superficie della proteina. 19,22,23 <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Figura 1:. Funzionamento principi di &#39;trasduttori chimici &quot;Quando si aggiunge il&#39; trasduttore chimica &#39;per una proteina attiva I (stato i), che si lega al suo sito attivo attraverso legante I e inibisce la sua attività (stato ii). In presenza di proteine ​​II, tuttavia, la non legato &#39;t chimicaransducer &#39;interagisce con proteine ​​II tramite legante II, che promuove le interazioni tra legante I e la superficie della proteina II. Questo legante indotta I-II proteina interazione riduce la concentrazione effettiva di legante io, che porta alla dissociazione del &#39;transducer&#39;-proteina complesso I e alle proteine I riattivazione (stato iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a>

<table><tbody><tr><td>1-cloro-2,4-dinitrobenzene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acetnitrile</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame (II) pentaidrato</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Acido etacrinico</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutatione-s-transferasi M1-1</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israele)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatione ridotto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di magnesio</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>kit di analisi colorimetrica di nitrati/nitriti</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>oligonucleotidi</td><td>W. M. Keck Foundation Biotechnology presso l'Università</td><td></td> di Yale <td>ordine personalizzato</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israele)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di desalinizzazione</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Colonne</td> HPLC Waters<td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td>Modulo <td></td><td>di separazione 2695</td></tr><tr><td>Colonna HPLC</td><td>Colonna Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 (2,5 &mu; M, 4,6 mm & tempi; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HPLC</td><td>Colonna Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 (2,5&nbsp; &mu; M, 10 mm & tempi; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 ibrido</td><td></td></tr></tbody></table>

imitando la funzione di proteine ​​di segnalazione: verso artificiale trasduzione del segnale therapy

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Le vie di trasduzione del segnale, che controllano la risposta delle cellule a vari segnali ambientali, sono mediate dalla funzione delle proteine di segnalazione che interagiscono tra loro e si attivano a vicenda con elevata specificità. Gli agenti sintetici che imitano la funzione di queste proteine potrebbero quindi essere utilizzati per generare passaggi di trasduzione del segnale innaturali e, di conseguenza, alterare la funzione della cellula. Presentiamo le linee guida per la progettazione di "trasduttori chimici" in grado di indurre una comunicazione artificiale tra proteine native. Inoltre, presentiamo protocolli dettagliati per la sintesi e il test di uno specifico "trasduttore", in grado di indurre la comunicazione tra due proteine non correlate: il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e la glutatione-S-transferasi (GST). Viene anche presentato il modo in cui questa comunicazione innaturale PDGF-GST potrebbe essere utilizzata per controllare la scissione di un profarmaco antitumorale, indicando il potenziale per l'utilizzo di tali sistemi nella "terapia di trasduzione del segnale artificiale". Questo lavoro ha lo scopo di facilitare lo sviluppo di ulteriori "trasduttori" di questa classe, che possono essere utilizzati per mediare la comunicazione intracellulare proteina-proteina e, di conseguenza, per indurre vie di segnalazione cellulare artificiali.

La progettazione, la sintesi, e il meccanismo di azione di un &#39;trasduttore chimica&#39; che può indurre comunicazione artificiale tra PDGF e GST sono rappresentati in Figura 2. La struttura del &#39;trasduttore&#39; integra un aptamero PDGF DNA ed un ammide bis-ethacrynic (BEA ), che è, rispettivamente, un inibitore noto GST (Figura 2a). 19 Questi leganti consentono &#39;trasduttore&#39; di impegnare sia PDGF e GST con differenti affinità,...

Presentiamo le linee guida per lo sviluppo di 'trasduttori chimici' sintetici in grado di indurre la comunicazione tra proteine naturalmente non correlate. Inoltre, vengono presentati protocolli dettagliati per la sintesi e il test di uno specifico "trasduttore" che consente a un fattore di crescita di attivare un enzima detossificante e, di conseguenza, di regolare la scissione di un farmaco antitumorale.

Imitando la funzione di proteine ​​di segnalazione: Verso artificiale trasduzione del segnale Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è seguire spettroscopicamente la comunicazione non naturale tra due proteine indotta da un trasduttore chimico sintetico. Ciò dimostrerà la possibilità di sviluppare analoghi sintetici di proteine di segnalazione in grado di eseguire percorsi di trasduzione del segnale non presenti in natura. La capacità di seguire la comunicazione non naturale tra proteine mediante uno spettrofotometro comune potrebbe contribuire a sviluppare e migliorare la funzione di trasduttori chimici artificiali, avvicinandoci all'obiettivo di una terapia basata sulla trasduzione del segnale artificiale.Il trasduttore chimico è composto da un aptamer del fattore di crescita derivato dalle piastrine, o aptamer PDGF, da un inibitore bivalente della GST etacrinamide, da un fluorocromo e da un quencher. La sintesi del trasduttore chimico non verrà dimostrata in questo video.Tuttavia, è descritto nel protocollo del testo. I principi di funzionamento del trasduttore chimico sono illustrati qui. Il trasduttore chimico inibisce l'attività enzimatica della GST quando i due gruppi EA si legano ai siti attivi dell'enzima.L'aggiunta di PDGF porta alla formazione del complesso chimico-trasduttore di PDGF, che interrompe l'interazione tra il trasduttore e GST, ripristinando così l'attività enzimatica di GST. La successiva aggiunta di un aptamero PDGF non modificato rilascia il trasduttore chimico, consentendogli di inibire nuovamente l'enzima.Prima di iniziare gli esperimenti per esaminare il controllo dell'attività della GST da parte del PDGF, impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica. Creare un nuovo esperimento come protocollo standard. Selezionare Procedura per aprire la finestra delle Impostazioni della procedura.Nell'elenco a discesa nella parte superiore della finestra, selezionare il tipo di piastra 384 in base al produttore della piastra. Selezionare Lettura nel menu a sinistra. Scegliere Assorbanza come metodo di rilevamento.E un endpoint per il tipo di lettura. Nella finestra Lunghezza d'onda, inserire 340 nanometri. Selezionare Piastra completa e scegliere le pozzette da misurare.Quindi fare clic su OK per chiudere la finestra di lettura. Nel menu di sinistra, selezionare Avvia cinetica. Impostare il tempo di esecuzione a 10 minuti.Selezionare l'opzione Intervallo minimo. Quindi fare clic su OK per chiudere la finestra Cinetica. Trascinare la linea di lettura nella misurazione cinetica.Selezionare il pulsante Convalida, seguito dal pulsante OK. Salvare l'esperimento. Selezionare il pulsante Riproduci.Apparirà una finestra di dialogo, ma non selezionare il pulsante OK fino a quando non si è pronti per iniziare la misurazione cinetica. Una volta configurato il lettore di piastre, il passaggio successivo consiste nel preparare i campioni per misurare l'attività della GST in presenza del trasduttore chimico e del PDGF. Per testare quattro concentrazioni di PDGF in triplicato, preparare quattro campioni in cui ciascuno contiene 3,25 microlitri del trasduttore chimico e 3,25 microlitri di GST M-1.Aggiungere a ciascun campione rispettivamente zero, 1,2, 2,4 o 4,9 microlitri di PDGF. Quindi aggiungere a ciascun campione il volume appropriato del buffer per il saggio in modo da portare il volume totale a 130 microlitri. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti.Dopo 10 minuti, trasferire 40 microlitri di ciascun campione nei pozzetti di una piastra trasparente da 384 pozzetti. Trasferire ciascuno dei quattro campioni solo nei pozzetti pari o solo nei pozzetti dispari della stessa riga, per consentire l'uso di una pipetta multicanale per l'aggiunta del substrato.Successivamente, utilizzare un multicanale a 12 canali per aggiungere rapidamente a ciascun campione 10 microlitri di ogni substrato precedentemente preparato in una piastra a 96 pozzetti. Mescolare rapidamente, ma delicatamente, per evitare la formazione di bolle. Inserire immediatamente la piastra nel lettore, quindi avviare la misurazione cinetica selezionando il pulsante OK nella finestra di dialogo.Per esaminare i cicli di inibizione dell'attivazione della GST mediati dal trasduttore chimico, preparare cinque campioni, ciascuno contenente 84,5 microlitri di tampone per saggio, 3,25 microlitri di trasduttore chimico e 3,25 microlitri di GST M1-1. Incubare a temperatura ambiente per tre minuti.Aggiungere 3,65 microlitri di tampone per saggio al campione uno e 3,65 microlitri di PDGF ai campioni due, tre, quattro e cinque. Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Aggiungere 3,12 microlitri di tampone per saggio ai campioni uno e due e 3,12 microlitri di aptamero per PDGF ai campioni tre, quattro e cinque.Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Aggiungere 24,4 microlitri di tampone per saggio ai campioni uno, due e tre. E 24,4 microlitri di PDGF ai campioni quattro e cinque.Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Aggiungere 7,8 microlitri di tampone per saggio ai campioni da uno a quattro e 7,8 microlitri di aptamer PDGF al campione cinque. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Trasferire i campioni in una piastra trasparente da 384 pozzetti. Per eseguire l'esperimento in triplicato e aggiungere rapidamente il substrato ai campioni. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica.Per iniziare questo saggio, impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica come descritto nel testo del protocollo. Preparare due campioni in due pozzetti di una piastra trasparente da 384 pozzetti. Per ogni pozzetto, mescolare un microlitro di GST M1-1 e un microlitro del trasduttore chimico in 38 microlitri di tampone per saggio.Lasciare un pozzetto vuoto tra i due pozzetti. Utilizzando una pipetta multicanale a 12 canali, aggiungere rapidamente 10 microlitri di substrato in ciascun pozzetto. Quindi mescolare delicatamente e rapidamente per evitare la formazione di bolle.Inserire immediatamente la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica. Quando il lettore di piastre si apre dopo 3,5 minuti, aggiungere rapidamente 1,125 microlitri di PDGF in uno dei pozzetti, mescolare delicatamente e permettere alla piastra di rientrare nel lettore per le successive misurazioni cinetiche. Prima di preparare i campioni per questo esperimento, impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica come descritto nel testo del protocollo.Per misurare la produzione di ossido nitrico verrà utilizzato un kit colorimetrico per nitriti/nitrati. In una piastra a 96 pozzetti, distribuire 50 microlitri di tampone per il saggio per ogni pozzetto nella prima riga. 70 microlitri di Reagente Griess One per ogni pozzetto nella seconda riga.Aggiungere 70 microlitri del Reagente Due di Griess per pozzetto nella terza riga. Preparare quattro campioni, ciascuno contenente 4,8 microlitri del trasduttore chimico. Al campione uno, aggiungere 155,2 microlitri di tampone per saggio.Per il campione due, aggiungere 3,2 microlitri di GST M1-1 e 152 microlitri di tampone per saggio. Per il campione tre, aggiungere 9,6 microlitri di PDGF e 145,6 microlitri di tampone per saggio. E per il campione quattro, aggiungere 3,2 microlitri di GST M1-1, 9,6 microlitri di PDGF e 142,4 microlitri di tampone per saggio.Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Distribuire 50 microlitri di campione per pozzetto in una piastra trasparente da 384 pozzetti per eseguire l'esperimento in triplicato. Distribuire i campioni solo nei pozzetti pari o dispari della stessa riga per consentire l'uso di una pipetta multipla per l'aggiunta del substrato.Aggiungere 0,54 microlitri di profarmaco JS-K a ciascun campione. Aggiungere rapidamente a ciascun campione 10 microlitri di soluzione di glutathione e mescolare delicatamente e rapidamente per evitare la formazione di bolle. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica.Immediatamente dopo la misurazione cinetica, trasferire 50 microlitri di ogni campione in ciascuna pozzetta della prima riga della piastra a 96 pozzette con tampone per il saggio. Successivamente, trasferire 50 microlitri da ciascuna pozzetta della seconda riga della piastra nelle pozzette della prima riga della piastra. E 50 microlitri per pozzetta dalla terza riga della piastra nelle pozzette della prima riga della piastra.Incubare proteggendo dalla luce per 10 minuti a temperatura ambiente. Prima di misurare l'assorbanza a 550 nanometri. La misurazione dell'attività della GST senza il trasduttore chimico e con il trasduttore chimico ha mostrato che il trasduttore chimico inibisce l'attività della GST.Il GST viene riattivato mediante l'aggiunta di concentrazioni crescenti di PDGF al complesso GST-trasduttore chimico. Aggiunte sequenziali di PDGF e di un aptamero PDGF non modificato al complesso GST-trasduttore chimico hanno rivelato che la comunicazione tra PDGF e GST era reversibile. L'aggiunta di PDGF al complesso GST-trasduttore ha determinato un rapido aumento dell'attività del GST, 3,5 minuti dopo l'aggiunta dei substrati.Sebbene l'aggiunta di un aptamero PDGF a una miscela di GST, PDGF e il trasduttore chimico abbia determinato una diminuzione dell'attività della GST, questi risultati indicano che il sistema risponde in tempo reale ai cambiamenti del proprio ambiente. Successivamente, è stata esaminata la capacità di questo sistema di controllare l'attivazione di un profarmaco utilizzando JS-K, un profarmaco antitumorale che viene attivato dalla GST per rilasciare ossido nitrico tossico.Le misurazioni delle quantità di ossido nitrico rilasciate in seguito all'aggiunta di JS-K al trasduttore chimico e a diverse combinazioni di GST e PDGF hanno confermato che soltanto la presenza simultanea di GST e PDGF attiva JS-K. Il tutto dimostra come un agente sintetico possa consentire a un fattore di crescita di innescare l'attività catalitica della Glutatione S-Transferasi, che non è il suo enzima partner naturale. Biomimetici futuri di questa classe potrebbero quindi essere utilizzati per modificare la risposta delle cellule ai segnali ambientali o per fornire loro nuove proprietà.

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