Imitando la funzione di proteine ​​di segnalazione: Verso artificiale trasduzione del segnale Therapy

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di seguire spettroscopicamente la comunicazione innaturale tra due proteine indotta da un trasduttore chimico sintetico. Verranno dimostrate le possibilità di sviluppare analoghi sintetici di proteine di segnalazione che saranno in grado di effettuare vie di trasduzione del segnale non presenti in natura. La capacità di seguire la comunicazione innaturale da proteina a proteina mediante spettrofotometro comune potrebbe aiutare a sviluppare e migliorare la funzione dei trasduttori chimici artificiali e avvicinarci al raggiungimento della terapia di trasduzione del segnale artificiale.

Il trasduttore chimico è composto da un fattore di crescita derivato dalle piastrine, o aptamero PDGF. Un inibitore bivalente della GST dell'ammide etacrinica, un fluoroforo e un quencher. La sintesi del trasduttore chimico non sarà dimostrata in questo video.

Ma è descritto nel testo protocollo. Qui vengono illustrati i principi di funzionamento del trasduttore chimico. Il trasduttore chimico inibisce l'attività enzimatica della GST, quando i due gruppi EA legano i siti attivi degli enzimi.

L'aggiunta di PDGF porta alla formazione del complesso del trasduttore chimico PDGF. Che interrompe l'interazione trasduttore-GST, ripristinando quindi l'attività enzimatica GST. La successiva aggiunta di un aptamero PDGF non modificato rilascia il trasduttore chimico e gli consente di inibire nuovamente l'enzima.

Prima di iniziare gli esperimenti per esaminare il controllo dell'attività GST da parte del PDGF, impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica. Creare un nuovo esperimento come protocollo standard. Selezionare Procedura per aprire la finestra Impostazioni procedura.

Nell'elenco a comparsa nella parte superiore della finestra, scegli il tipo di targa 384 in base al produttore della targa. Seleziona Leggi nel menu a sinistra. Scegliere Assorbanza per il metodo di rilevamento.

e endpoint per il tipo di lettura. Nella finestra Lunghezza d'onda, digitare 340 nanometri. Selezionare Piastra piena e scegliere i pozzetti da misurare.

Quindi fare clic su OK per chiudere la finestra Lettura. Nel menu a sinistra, scegli Avvia Kinetic. Impostare il tempo di esecuzione su 10 minuti.

Selezionare l'opzione Intervalli minimi. Quindi fare clic su OK per chiudere la finestra Kinetic. Trascinare la linea di lettura nella misurazione cinetica.

Selezionare il pulsante Convalida, seguito dal pulsante OK. Salva l'esperimento. Seleziona il pulsante Riproduci.

Apparirà una finestra di dialogo, ma non selezionare il pulsante OK fino a quando non si è pronti per avviare la misurazione cinetica. Una volta impostato il lettore di piastre, il passaggio successivo consiste nel preparare i campioni per misurare l'attività GST in presenza del trasduttore chimico e del PDGF. Per testare quattro concentrazioni di PDGF in triplicato, preparare quattro campioni in cui ciascuno contiene 3,25 microlitri del trasduttore chimico e 3,25 microlitri di GST M-1.

Aggiungere a ciascun campione rispettivamente zero, 1,2, 2,4 o 4,9 microlitri di PDGF. Quindi aggiungere il volume appropriato del tampone del saggio a ciascun campione per portare il volume totale a 130 microlitri. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, trasferire 40 microlitri di ciascun campione nei pozzetti di una piastra trasparente da 384 pozzetti. Trasferire ciascuno dei quattro campioni nei pozzetti pari o dispari solo nella stessa riga. Per consentire l'uso di un multi-pipetter per l'aggiunta del substrato.

Successivamente, utilizzare un pipettatore multiplo a 12 canali per aggiungere rapidamente a ciascun campione 10 microlitri di ciascun substrato precedentemente preparato in una piastra a 96 pozzetti. Mescolate velocemente, ma delicatamente, per evitare bolle. Inserire immediatamente la piastra nel lettore di piastre e avviare la misurazione cinetica selezionando il pulsante OK nella finestra di dialogo.

Per esaminare i cicli di inibizione dell'attivazione GST mediati dal trasduttore chimico, preparare cinque campioni, ciascuno contenente 84,5 microlitri di tampone di saggio, 3,25 microlitri di trasduttore chimico e 3,25 microlitri di GST M1-1. Incubare a temperatura ambiente per tre minuti.

Aggiungere 3,65 microlitri di tampone per il test al campione uno e 3,65 microlitri di PDGF ai campioni due, tre, quattro e cinque. Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Aggiungere 3,12 microlitri di tampone per il test ai campioni uno e due e 3,12 microlitri di aptamero PDGF ai campioni tre, quattro e cinque.

Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Aggiungere 24,4 microlitri di tampone per test ai campioni uno, due e tre. E 24,4 microlitri di PDGF ai campioni quattro e cinque.

Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Aggiungere 7,8 microlitri di tampone per il test ai campioni da uno a quattro e 7,8 microlitri di aptamero PDGF per il campione cinque. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Trasferire i campioni in una piastra a 384 pozzetti trasparente. Per eseguire l'esperimento in triplice copia, e aggiungere rapidamente il substrato ai campioni. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica.

Per iniziare questo saggio, impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica come descritto nel testo del protocollo. Preparare due campioni in due pozzetti di una piastra trasparente a 384 pozzetti. Per ogni pozzetto, miscelare un microlitro di GST M1-1 e un microlitro del trasduttore chimico in 38 microlitri di tampone per saggi.

Lascia un pozzo vuoto tra i due pozzi. Utilizzando un pipettatore multiplo a 12 canali, aggiungere rapidamente 10 microlitri di substrato a ciascun pozzetto. E mescolate delicatamente e velocemente per evitare bolle.

Inserire immediatamente la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica. Quando il lettore di piastre si apre dopo 3,5 minuti, aggiungere rapidamente 1,125 microlitri di PDGF a uno dei pozzetti, mescolare delicatamente e lasciare che la piastra rientri nel lettore per le restanti misurazioni cinetiche. Prima di preparare i campioni per questo esperimento, impostare una procedura sperimentale nel lettore di piastre per la misurazione cinetica come descritto nel testo del protocollo.

Per misurare la produzione di ossido nitrico verrà utilizzato un kit colorimetrico di nitriti/nitrati. In una piastra da 96 pozzetti, erogare 50 microlitri di tampone per pozzetto nella prima fila. 70 microlitri di reagente Griess One per pozzetto fino alla seconda fila.

E 70 microlitri di reagente Griess Two per pozzetto nella terza fila. Preparare quattro campioni, ciascuno contenente 4,8 microlitri del trasduttore chimico. Per campionarne uno, aggiungere 155,2 microlitri di tampone per il test.

Per il secondo campione, aggiungere 3,2 microlitri di GST M1-1 e 152 microlitri di tampone per il test. Per il terzo campione, aggiungere 9,6 microlitri di PDGF e 145,6 microlitri di tampone per il test. E per campionarne quattro, aggiungere 3,2 microlitri di GST M1-1, 9,6 microlitri di PDGF e 142,4 microlitri di tampone per saggi.

Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Erogare 50 microlitri di campione per pozzetto in una piastra da 384 pozzetti trasparenti per eseguire l'esperimento in triplice copia. Erogare i campioni solo nei pozzetti pari o dispari della stessa linea per consentire l'uso di un pipettatore multiplo per l'aggiunta del substrato.

Aggiungere 0,54 microlitri di profarmaco JS-K a ciascun campione. Aggiungere rapidamente a ogni campione 10 microlitri di soluzione di glutatione e mescolare delicatamente e rapidamente per evitare bolle. Inserire la piastra nel lettore e avviare la misurazione cinetica.

Immediatamente dopo la misurazione cinetica, trasferire 50 microlitri di ciascun campione in ciascun pozzetto della prima fila della piastra a 96 pozzetti con tampone di saggio. Quindi trasferire 50 microlitri da ciascun pozzetto della seconda fila della piastra nei pozzetti della prima fila della piastra. E 50 microlitri per pozzetto dalla terza fila della piastra nei pozzetti della prima fila della piastra.

Incubare proteggendo dalla luce per 10 minuti a temperatura ambiente. Prima di misurare l'assorbanza a 550 nanometri. La misurazione dell'attività GST senza il trasduttore chimico e con il trasduttore chimico ha dimostrato che il trasduttore chimico inibisce l'attività GST.

La GST viene riattivata dall'aggiunta di concentrazioni crescenti di PDGF al complesso GST-trasduttore chimico. L'aggiunta sequenziale di PDGF e di un aptamero PDGF non modificato al complesso GST-trasduttore chimico ha rivelato che la comunicazione tra PDGF e GST era reversibile. L'aggiunta di PDGF al complesso GST-trasduttore ha determinato un rapido aumento dell'attività GST, 3,5 minuti dopo l'aggiunta dei substrati.

Mentre l'aggiunta di un aptamero PDGF a una miscela di GST, PDGF e il trasduttore chimico ha comportato una diminuzione dell'attività GST. Questi risultati indicano che il sistema risponde in tempo reale ai cambiamenti nel suo ambiente. Successivamente, la capacità di questo sistema di controllare l'attivazione dei profarmaci è stata studiata utilizzando JS-K, un profarmaco antitumorale che viene attivato dalla GST per rilasciare ossido nitrico tossico.

Le misurazioni delle quantità di ossido nitrico rilasciate dopo l'aggiunta di JS-K al trasduttore chimico e diverse combinazioni di GST e PDGF hanno confermato che solo la presenza di GST e PDGF attiva JS-K. Tutto ciò dimostra come un agente sintetico possa consentire a un fattore di crescita di innescare l'attività catalitica della glutatione S-transferasi, che non è il suo partner enzimatico naturale. I futuri biomimetici di questa classe potrebbero quindi essere utilizzati per alterare la risposta delle cellule ai segnali ambientali o fornire loro nuove proprietà.