Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare piccoli RNA non codificanti su lipoproteine purificate. Questo protocollo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle lipoproteine, come la definizione delle firme dei piccoli RNA delle lipoproteine in salute e malattia, nonché l'avanzamento dei piccoli RNA delle lipoproteine come biomarcatori di malattia o messaggi da cellula a cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si possono analizzare lipoproteine altamente pure per piccoli cambiamenti di RNA in malattie o condizioni sperimentali.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono per la terapia delle malattie cardiometaboliche, perché gli RNA extracellulari sono una nuova classe di biomarcatori di malattie e i piccoli RNA delle lipoproteine hanno un potenziale entusiasmante come bersagli farmacologici in studi futuri. Sebbene questo metodo sia progettato per i piccoli RNA HDL, può anche essere adattato per piccoli RNA a bassissima densità e lipoproteine a bassa densità. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà, a causa della mancanza di attrezzature adeguate e di competenze nella preparazione dei campioni per l'ultracentrifugazione a gradiente di densità.

Questo protocollo è composto da metodi consolidati collegati tra loro per la quantificazione di piccoli RNA su HDL altamente puro, utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento o la PCR in tempo reale. Questo video tratta della purificazione dell'HDL. Questo protocollo sarà dimostrato dal mio assistente, Evan Shadari.

Per iniziare, aggiungi 90 microlitri di antiossidanti 100x a nove millilitri di plasma. Quindi, regolare la densità del plasma a 1,025 grammi per millilitro, aggiungendo 0,251 grammi di bromuro di potassio ogni nove millilitri di plasma. Scuotere il plasma a temperatura ambiente, fino a quando tutto il sale si è sciolto.

Quindi, trasferisci il plasma in provette da ultra-centrifuga e assicurati di avere uno strato di bolle nella parte superiore. Non dovrebbe esserci aria intrappolata sotto il plasma. Quindi, prepara un ago calibro 18 aggiungendo una curva di 90 gradi a un centimetro dalla punta, con il lato smussato rivolto verso l'alto.

Quindi, utilizzando una siringa e l'ago piegato, posizionare con cura tre millilitri di soluzione di sovrapposizione numero uno sul plasma. Rimuovere la maggior parte delle bolle sulla superficie e lasciare due o tre millimetri tra il menisco e il bordo del tubo. Quindi, posizionare con cura i tubi nei secchi SW 40 Ti.

Pesare ogni secchio con i tappi e bilanciare esattamente i secchi che occuperanno posizioni opposte nella centrifuga. Quindi, posizionare il rotore nell'ultracentrifuga e farlo funzionare a 274, 400 volte G per 24 ore a quattro gradi Celsius, con la rottura impostata intermediamente a un valore di quattro. Il giorno successivo, rimuovere con cautela i secchi dal rotore e sollevare i tubi dai secchi.

Quindi, rimuovere lentamente due millilitri dallo strato superiore del rivestimento, utilizzando una siringa e un ago piegato. Questa è la frazione IDL VLDL. Quindi, raccogli i restanti sette millilitri di plasma e trasferiscili in una provetta conica da 15 millilitri.

Portare il volume del plasma fino a nove millilitri aggiungendo la soluzione di sovrapposizione numero due. Quindi, regolare la densità a 1,080 grammi per millilitro aggiungendo 0,746 grammi di bromuro di potassio. Quindi, scuoti delicatamente il campione per sciogliere il sale, operazione che richiederà circa 20 minuti.

Quindi, trasferire il campione in una provetta da ultra-centrifuga senza intrappolare l'aria. Assicurati che nella parte superiore sia formato uno strato di bolle. Usando l'ago piegato, sovrapporre con cura tre millilitri di soluzione di rivestimento numero tre.

Quindi, rimuovere la maggior parte delle bolle e caricare con cura i tubi nel secchio SW 40 Ti. Bilanciateli e fateli girare, come descritto in precedenza, per 24 ore. Il giorno successivo, rimuovere con cura due millilitri dallo strato superiore del rivestimento utilizzando l'ago piegato.

Questa è la frazione LDL. Quindi, trasferire il campione rimanente in una nuova provetta conica da 15 millilitri e portare il volume fino a nove millilitri con la soluzione numero quattro. Ora regola la densità a 1,30 grammi per millilitro aggiungendo circa 3,33 grammi di bromuro di potassio e facendo oscillare il campione fino a quando il sale non si scioglie.

Quindi, trasferire il campione in una provetta da ultra-centrifuga e versare con cautela tre millilitri di soluzione numero cinque. A questo punto, centrifugare il campione con l'ultracentrifuga come prima, ma per 48 ore. Due giorni dopo, raccogliere i due millilitri superiori del rivestimento usando una siringa e un ago piegato.

Questo costituisce la frazione HDL. Per rimuovere le soluzioni ad alto contenuto di sale, trasferire la frazione HDL in un manicotto di dialisi umido con un cutoff di peso molecolare di 10.000. Quindi, dializzarlo per 24 ore in un litro di un XPBS mescolando delicatamente a quattro gradi Celsius.

Sostituire la soluzione PBS tre volte nell'arco di 24 ore. Successivamente, determinare la concentrazione proteica della frazione HDL utilizzando un metodo BCA. Le vescicole extracellulari, o esosomi, hanno una densità simile alle piccole HDL e quindi potrebbero essere presenti nella stessa frazione di densità delle HDL.

Pertanto, la frazione HDL richiede un'ulteriore purificazione da parte di FPLC. Immediatamente prima di utilizzare l'FPLC, eseguire 1,2 milligrammi della frazione DGUC HDL in 500 microlitri di soluzione attraverso un filtro centrifugo da 0,22 micron. Raccogliere il campione filtrato in una siringa per iniezione FDLC, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria.

Quindi, impostare la portata FPLC su 0,3 millilitri al minuto con un limite di pressione a 2,6 megapascal. Quindi, equilibrare le colonne con 0,2 volumi di colonna di buffer. Ora iniettare il campione con tre millilitri di tampone nello strumento FPLC e iniziare la corsa.

Raccogli frazioni da 1,5 millilitri per un totale di 72 frazioni. Identificare le frazioni FPLC corrispondenti a DGUC HDL determinando i livelli di colesterolo totale utilizzando un kit colorimetrico secondo le istruzioni del produttore. Aspettatevi di trovare da sei a sette frazioni di FPLC contenenti DGUC HDL.

Raggruppare tutte le frazioni contenenti HDL e concentrarle utilizzando un filtro centrifugo cutoff da 10 kilodalton a 4.000 volte G per un'ora a quattro gradi Celsius, o fino a quando il concentrato di HDL è di circa 100 microlitri. Quindi, raccogli il concentrato di HDL e quantifica la proteina utilizzando il metodo BCA. Successivamente, utilizzare la stessa quantità di proteina totale HDL per isolare l'RNA.

Il plasma umano è stato frazionato mediante FPLC senza l'uso della separazione densità-gradiente. Sei frazioni corrispondevano all'HDL e sei alle lipoproteine a bassissima densità. I lipidi in nero, il colesterolo in rosso e le proteine in blu sono stati tutti misurati da kit colorimetrici.

In confronto, l'uso dell'ultra-centrifugazione a gradiente di densità prima dell'FPLC ha portato a trovare proteine lipidiche e colesterolo quasi esclusivamente nelle frazioni HDL. Da HDL prelevato da quattro donatori di plasma sani, l'RNA totale è stato isolato e sequenziato utilizzando un protocollo a lettura singola di 50 coppie di basi. La distribuzione delle reads normalizzate illustra l'arricchimento di piccoli RNA intorno a 21 e 34 nucleotidi.

L'analisi della libreria ha mostrato che il 38% delle letture erano micro RNA e il 37% derivava da TRNA. Erano presenti anche RNA vari, RNA ribosomiali, piccoli RNA, piccoli RNA nucleolari e lunghi RNA non codificanti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro dieci giorni, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di convalidare le piccole variazioni dell'RNA HDL osservate con il sequenziamento ad alto rendimento con un altro metodo, come la PCR o il northern blotting. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la capacità di accettazione del flusso elettronico del colesterolo HDL e le SA antinfiammatorie HDL, possono essere eseguiti durante le fasi di isolamento dell'RNA e le fasi di preparazione al sequenziamento per rispondere a ulteriori domande, come determinare la correlazione tra piccole variazioni dell'RNA HDL e funzione HDL. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei lipidi e delle lipoproteine, per studiare il carico non colesterolo, in particolare gli acidi nucleici e le malattie metaboliche, ad esempio l'ipercolesterolemia o il diabete.

E non dimenticare, lavorare con il plasma umano può essere estremamente pericoloso e si dovrebbe avere una formazione adeguata sugli agenti patogeni trasmessi per via ematica e indossare dispositivi di protezione individuale appropriati quando si esegue questa tecnica.