Name: Isolamento di lipoproteine ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri l'isolamento delle lipoproteine ad alta densità per la quantificazione di piccoli RNA non codificanti. Questo metodo avanzato consente di analizzare lipoproteine altamente pure e identificare potenziali biomarcatori per malattie cardiometaboliche.

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Questo lavoro è stato supportato da premi dal National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute a K.C.V. HL128996, HL113039 e HL116263. Questo lavoro è stato anche sostenuto da premi dell'American Heart Association a K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 e R.M.A. POST25710170.

1. HDL Purificazione (~ 5,5 giorni) <ol><li> In gradiente di densità Ultracentrifugazione (DGUC, ~ 5 giorni) <ol><li> Aggiungere 90 ml di 100x antiossidanti a 9 ml di plasma isolati dal sangue venoso fresco. </li><li> Regolare la densità del plasma con KBr da 1.006 g / mL a 1.025 g / mL con l&#39;aggiunta di 0,251 g di KBr a 9 ml di plasma dal punto 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plasma). Rock the plasma finché tutto il sale viene disciolto a temperatura ambiente e trasferimento ultracentrifuge tubi e garantire tutte le bolle salire verso l&#39;alto. </li><li> Piegare la punta di un ago 18-G a 90 ° 1 cm dalla punta, lato smusso rivolto verso l&#39;alto. Usando una siringa e l&#39;ago calibro 18, posizionare accuratamente 3 mL di soluzione overlay # 1 nel plasma (Tabella 1). NOTA: L&#39;ago piegato assicura tutte le VLDL / IDL, LDL, HDL e vengono rimossi senza mescolarsi con l&#39;overlay. </li><li> Rimuovere la maggior parte delle bolle nella parte superiore, lasciando 2 - 3 mm di spazio dal menisco all&#39;inizio del tubo e carefully posizionare i tubi in secchi SW-40Ti. </li><li> Pesare ciascun segmento (con i tappi) sulla bilancia, ed esattamente l&#39;equilibrio con il secchio opposta (secchio + cap): # 1 a # 4, # 2 alla # 5 e # 3 a # 6. NOTA: Queste secchi devono essere equilibrati e abbinato a tutti i tempi. </li><li> Posizionare il rotore in ultracentrifuge (elenco dei materiali). Centrifugare a 274.400 xg per 24 ore a 4 ° C con un freno intermedio # 4. </li><li> Rimuovere con cautela secchi dal rotore e dei tubi da secchi. </li><li> Rimuovere con cautela 2 mL dallo strato superiore della sovrapposizione con una siringa e l&#39;ago piegato. Questa sarà la frazione VLDL / IDL che può essere conservato a 4 ° C o -80 ° C. </li><li> Dopo aver rimosso la frazione VLDL / IDL, raccogliere il restante 7 ml di campione (plasma) e posizionarlo in un tubo da 15 ml. Portare il volume del campione fino a 9 mL di soluzione overlay # 2 (Tabella 1). </li><li> Regolare la densità del campione da 1.025 g / mL a 1.080 g / mL con KBr utilizzandocirca 0,746 g KBr nel campione 9 mL o 0,0828 g / mL KBr di campione. Agitare delicatamente il campione fino a quando tutto il KBr è sciolto (circa 20 min) e trasferimento in ultracentrifuge tubo mentre bolle garantendo salgono verso l&#39;alto. </li><li> Con siringa e l&#39;ago, posizionare accuratamente 3 mL di soluzione overlay # 3 sul campione (Tabella 1). Lasciare 2 - 3 mm di spazio dal menisco alla sommità del tubo. </li><li> Rimuovere la maggior parte di altri eventuali bolle nella parte superiore del tubo e posizionare accuratamente i tubi ultracentrifuga riempiti in secchi SW-40Ti. </li><li> Pesare ciascun segmento (con i tappi) sulla bilancia, ed esattamente l&#39;equilibrio con il secchio di fronte a + cap, come in 1.1.5. </li><li> Posizionare il rotore in ultracentrifuge (vedi elenco dei materiali). Centrifugare a 274.400 xg per 24 ore a 4 ° C con un freno intermedio # 4. </li><li> Rimuovere con cautela secchi dal rotore e dei tubi da secchi. </li><li> Rimuovere accuratamente 2 mL dallo strato superiore della sovrapposizione con una siringa ed esserent ago. Questa sarà la frazione LDL che può essere conservato a 4 ° C o -80 ° C. </li><li> Dopo aver rimosso la frazione LDL, raccogliere i restanti approssimative 7 ml di campione (plasma) e inserirlo in un nuovo tubo da 15 ml. Portare il volume del campione (plasma) fino a 9 mL con 1.080 g / mL soluzione # 4 (Tabella 1). </li><li> Regolare la densità del campione da 1.080 g / mL a 1,30 g / mL con KBr usando 3,33 g KBr in 9 mL di campione (plasma) o 0,37 g KBr per ogni ml di campione. Rock o leggermente agitare il campione fino a quando tutto il KBr (sale) viene disciolto e trasferimento a ultracentrifuge tubo. </li><li> Con siringa e l&#39;ago, posizionare accuratamente 3 mL di soluzione overlay # 5 sul campione (Tabella 1). </li><li> Rimuovere la maggior parte di altri eventuali bolle nella parte superiore del tubo, lasciando spazio 2- 3 mm dal menisco alla sommità del tubo e posizionare accuratamente i tubi ultracentrifuga riempiti in secchi SW-40Ti. </li><li> Pesare ciascun segmento (con i tappi) sulla bilancia, e precisamente l&#39;equilibrio con il secchio di fronte a + cap, come in 1.1.5. </li><li> Posizionare il rotore in ultracentrifuge (vedi elenco dei materiali). Centrifugare a 274.400 xg per 48 ore a 4 ° C con un freno # 4. </li><li> Rimuovere con cautela secchi dal rotore e dei tubi da secchi. </li><li> Rimuovere con cautela circa 2 ml dallo strato superiore della sovrapposizione con una siringa e l&#39;ago piegato. Questa è la frazione HDL, che può essere conservato a 4 ° C o -80 ° C. NOTA: A seguito di HDL DGUC può essere dializzato per rimuovere le soluzioni high-sale. </li><li> Per dializzare, posizionare la frazione HDL raccolti in un manicotto di dialisi sigillata (10.000 MW cut-off) e dializzare durante la notte in 1 L 1x PBS. buffer di cambiamento di dialisi (1x PBS) per 3 volte nell&#39;arco di 24 ore. perturbazione delicato della PBS con una magnetica mescolare-bar migliorerà la dialisi. </li><li> Determinare la concentrazione proteica del DGUC-HDL utilizzando un metodo BCA 8. </li></ol></li><li> Fast-proteine liquide Chromatografia (FPLC) o cromatografia di esclusione molecolare (~ 6 h) <ol><li> Filter 1.2 mg di DGUC-HDL (proteine ​​totali) in 500 ml attraverso un filtro micron micro-centrifuga 0,22 (vedi elenco dei materiali), immediatamente prima dell&#39;iniezione. NOTA: Un ulteriore filtraggio del campione DGUC-HDL attraverso un filtro micron micro-centrifuga 0,45 a monte del filtro di 0,22 micron può essere richiesto per alcuni campioni. </li><li> Raccogliere il campione DGUC-HDL filtrato, caricare la siringa di iniezione FPLC (riempimento), e assicurarsi che non vi siano bolle nella siringa prima di iniettare nel FPLC. </li><li> Impostare la portata FPLC a 0,3 mL / min con un limite di pressione a 2,6 MPa. Equilibrare le colonne con 0,2 volumi di colonna (circa 15 ml) di tampone, prima di assaggiare l&#39;iniezione. Iniettare il campione con 3 ml di tampone nel (ansa di iniezione) strumento FPLC e iniziare la corsa. Raccogliere 1,5 frazioni ml per un totale di 72 frazioni. </li></ol></li></ol> 2. high-throughput Piccolo RNASequencing (sRNAseq, ~ 9 giorni) <ol><li> Isolamento RNA (~ 1 giorno) <ol><li> Identificare le frazioni FPLC corrispondenti a DGUC-HDL determinando livelli di colesterolo totale utilizzando un kit colorimetrico secondo le istruzioni del produttore. L&#39;utilizzo di questo FPLC set-up, si aspettano di trovare 6 - 7 frazioni FPLC contenenti DGUC-HDL. </li><li> Raccogliere tutto il volume (circa 8 -1 0 mL piscina di 1,45 ml frazione volumi) da frazioni DGUC-HDL FPLC e concentrarsi utilizzando 10 kDa mw unità filtro centrifugo di cut-off a 4.000 xg per 1 ora a 4 ° C o fino HDL concentrato è di circa 100 ml. </li><li> Raccogliere il concentrato HDL e quantificare la concentrazione di proteine totali di HDL utilizzando il metodo BCA 8. </li><li> Determinare la più alta concentrazione di proteine ​​totali HDL, fino a 1 mg, che può essere aliquotati da ciascun campione nella serie. Ad esempio, isolare l&#39;RNA dalla stessa quantità di proteine ​​totali HDL per ogni campione. </li><li> Eseguire Isolamento RNA utilizzandoun protocollo modificato (vedi elenco dei materiali). <ol><li> Aggiungere 10x volume di fenolo lisi dei reagenti (vedi elenco dei materiali) del campione e vortex per 1 min. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere cloroformio (20% di fenolo lisi volume di reagente utilizzato nella fase 2.1.5.1) e agitare vigorosamente per 15 s. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 2 - 3 min. </li><li> Centrifugare per 15 min a 12.000 xg a 4 ° C in una centrifuga refrigerata. </li><li> Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta, evitando l&#39;interfase. </li><li> Aggiungere il volume 1.5x del 100% di etanolo alla fase acquosa e vortex per 1 min. </li><li> Conservare i campioni per almeno 1 ora o durante la notte a -80 ° C. </li><li> Continuare con il protocollo di isolamento di RNA utilizzando il mini colonne fornite. </li><li> Eluire con 30 ml di RNasi-free H 2 O. Prima aggiungere 15 ml di H 2 O direttamente la fritta, rotazione a bassa velocità (2.000 xg) per 2 minuti, epoi girare ad alta velocità (max) per 1 min. Ripetere questa operazione con altri 15 ml di H 2 O. </li></ol></li><li> procedere immediatamente a sRNA generazione biblioteca o conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Generazione Library (~ 6 h) <ol><li> Preparare le biblioteche sRNA cDNA utilizzando il protocollo kit sRNA biblioteca generazione, secondo le istruzioni del produttore con una modifica per l&#39;amplificazione PCR, come descritto di seguito. <ol><li> Preparare la Mastermix PCR in ghiaccio contenente 0,5 microlitri DNasi / RNasi-free H 2 O, 15 microlitri PCR Mix (PML) e 1 ml di RNA PCR Primer (RP1) per campione (includere un ulteriore 10% per l&#39;errore pipettaggio). </li><li> Aggiungere 16,5 ml di miscela PCR per ciascun campione (cDNA). </li><li> Assegnare un numero di indice / codici a barre per ogni campione per la multiplazione e aggiungere 1 ml PCR Primer Index (al numero corrispondente) per il campione. </li><li> Eseguire un lancio rapido utilizzando il microcentrifuga. NOTA: Volume totale dovrebbeora essere di 30 microlitri per campione. </li><li> Eseguire le condizioni di ciclismo per l&#39;amplificazione PCR si vedano le tabelle 2 e 3. </li></ol></li></ol></li><li> Dimensioni Selezionare sRNA Biblioteca Come estrarre l&#39;adattatore: adattatori (~ 1,5 h) <ol><li> Eseguire biblioteca size-selezione con il selettore automatico del formato del DNA secondo le istruzioni del produttore con i seguenti parametri di dimensione: Obiettivo: 156 bp, inizio: 135 bp, Fine: 177 bp, Campo Bandiera: Broad. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0,5 h) <ol><li> Pulire dimensione selezionata sRNA cDNA secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Eluire pulito e concentrato sRNA cDNA con 2 x 7 microlitri DNasi / RNasi-free H 2 O. </li></ol></li><li> Quantificare e valutare sRNA cDNA Biblioteca resa e la qualità (~ 1 h) <ol><li> Valutare la qualità biblioteca sRNA cDNA e le dimensioni utilizzando un chip di DNA ad alta sensibilità su un Bioanalyzer (elenco dei materiali) secondo manufattole istruzioni del urer. </li><li> Quantificare le singole concentrazioni biblioteca sRNA cDNA usando un test del DNA ad alta sensibilità (Lista dei Materiali), secondo le istruzioni del produttore. NOTA: Si raccomanda di avere tutti i campioni con differenti indici di essere eseguiti sulla stessa corsia della cella di flusso, se possibile. Se è necessaria più di una corsia, mescolare campioni di casi e di controllo in modo appropriato. </li></ol></li><li> High-throughput sRNA Sequencing (~ 7 giorni) <ol><li> Piscina individuale indicizzato librerie Srna sulla base delle concentrazioni equimolari. </li><li> Schermo pool librerie Srna per qualità utilizzando ad alta sensibilità DNA chip sul Bioanalyzer e determinare la concentrazione di DNA biblioteca come in 2.5.1 - 2.5.2. </li><li> Eseguire la PCR quantitativa (qPCR) di contenuti adattatore per garantire profondità sequenziamento appropriato utilizzando la libreria sequenziamento kit di qPCR quantificazione secondo le istruzioni del produttore (elenco dei materiali). </li><li> Eseguire il sequenziamento utilizzando una sola lettura, 50 bprotocollo p per raggiungere una profondità di circa 20 - 25 M legge / campione, secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li></ol> 3. Analisi dei dati (~ 1 giorno) <ol><li> Utilizzare bcl2fastq2, come da istruzioni manuale d&#39;uso, di pre-elaborazione dei file raw FASTQ di campioni demultiplexati (elenco dei materiali). </li><li> Utilizzare Cutadapt per tagliare adattatori 9 e rimuovere legge &lt;16 nucleotidi (NTS) di lunghezza, come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali). </li><li> Rimuovere le sequenze di contaminazione presenti nelle biblioteche Srna, tra cui la sequenza soluzione di arresto (STP: CCACGTTCCCGTGG) e l&#39;adattatore carry-over (CTACAGTCCGACGATC) utilizzando la funzione removeSequenceInFastq nel quadro NGSPERL, come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali). </li><li> Eseguire metriche di controllo di qualità da parte FastQC utilizzando Center for Quantitative Sciences (CQS) strumenti, come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali). </li><li> Genera elenco non ridondante di &quot;identico&quot;, si legge (crollo redundaNT legge) e un numero record di copia utilizzando CQSTools, come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali). </li><li> Allinea legge al genoma umano utilizzando Bowtie1.1.2 permettendo 1 disadattamento (opzioni: -a -m 100 --migliore --strata -v 1), secondo le istruzioni di guida utente (elenco dei materiali). </li><li> Eseguire leggere l&#39;allineamento, il conteggio, e il risultato compiti riepilogo utilizzando NGSPERL, come da istruzioni di guida degli utenti. </li><li> Convertire tavolo conteggio esportati in un foglio di calcolo. </li><li> Normalizzare legge di una specifica classe (ad esempio, miRNA) al numero totale di letture per quella classe (ad esempio, il numero totale di miRNA letture) e segnali di report come Legge Per mappata miRNA (RPMM). (Ad esempio, RPMM = (miR-X / # totale di miRNA letture) * 1.000.000). </li><li> Ingresso normalizzato tabella di numeri come generico tecnologia unico colore nel software per basso livello e differenziali di alto livello analizza come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali). NOTA: Attualmente, ci sono geni housekeeping non ben caratterizzati / SRNPer quanto riguarda i livelli di HDL-sRNA. Un controllo picco-in può essere utilizzato, ma può essere problematico. Normalizzando HDL ingresso proteine ​​o il volume totale è consigliato. Ancora più importante, si consiglia di convalidare i risultati di sequenziamento da una delle varie strategie per quantificare miRNA e sRNAs formato Real-time PCR o PCR quantitativa. </li></ol>

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<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo è stato progettato per quantificare miRNA ed altri sRNAs da high-throughput sequencing o real-time PCR altamente puro HDL. Come con qualsiasi approccio, considerazioni speciali dovrebbero essere dati ad ogni fase del processo di purificazione HDL e RNA e quindi quantificare sRNAs. Questo protocollo è stato progettato per i progetti che iniziano con ≥ 2 ml di plasma. Tuttavia, le analisi di RNA di alta qualità possono essere completati con successo con HDL purificato da un minimo di 80 ml di plasma uman...

Extracellulari non codificante piccoli RNA (sRNAs) rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e potenziali bersagli terapeutici e probabilmente facilitare la comunicazione 1 cella-a-cella. Il tipo più ampiamente studiato di sRNA sono microRNA (miRNA), che sono circa il 22 nti di lunghezza e vengono elaborati da forme precursori più lunghi e trascrizioni primari 2. miRNA hanno dimostrato di livello post-trascrizionale regolare l&#39;espressione genica attraverso la soppressione della traduzione di proteine e induzione di mRNA degrado 2. Tuttavia, miRNA sono solo uno dei molti tipi di sRNAs; come sRNAs possono essere scissi dal tRNA controllanti (sRNAs tRNA-derivati, TDR), piccoli RNA nucleari (sRNAs sRNA-derivati, sndRNA), piccoli RNA nucleolari (sRNAs snoRNA-derivati, snRNA), RNA ribosomiale (sRNAs, RDR rRNA-derivati ), Y (RNA YDR), ed altri RNA vari 1. Alcuni esempi di questi nuovi sRNAs sono stati segnalati per funzione simile a miRNA; tuttavia, il fu biologicanctions di molti di questi sRNAs resta da stabilire, anche se i ruoli nella regolazione genica è probabile 3-6. Più interessante, miRNA e altri sRNAs sono stabilmente presenti nei fluidi extracellulari, tra cui la saliva, plasma, urine, e la bile. sRNAs extracellulari sono probabilmente protetti da RNasi attraverso la loro associazione con vescicole extracellulari (EV), lipoproteine, e / o complessi ribonucleoproteici extracellulari. In precedenza, abbiamo riportato che lipoproteine, cioè lipoproteine ad alta densità (HDL), miRNA di trasporto nel plasma 7. In questo studio, HDL sono stati isolati utilizzando un metodo sequenziale di ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC), fast-proteina cromatografia liquida (ad esclusione dimensionale gel filtrazione cromatografia FPLC), e cromatografia di affinità (anti-apolipoproteina AI (apoA-I) immunoprecipitazione ) 7. Usando entrambi gli array a bassa densità basati sulla PCR in tempo reale e analisi miRNA individuali, i livelli di miRNA sono stati quantificati sulla HDL isolati da guarirela tua e soggetti ipercolesterolemici 7. Usando questo approccio, siamo stati in grado al profilo miRNA e quantificare miRNA specifici preparati HDL elevata purezza. Dal 2011, abbiamo determinato che, sebbene cromatografia di affinità aumenta HDL purezza, la saturazione degli anticorpi limita fortemente il rendimento, e può essere un costo proibitivo. Attualmente, il nostro protocollo raccomanda un metodo tandem sequenziale in due fasi di DGUC seguito da FPLC, che produce anche i campioni di HDL di alta qualità per il down-stream isolamento RNA e sRNA quantificazione. A causa di recenti progressi nella high-throughput sequenziamento del sRNAs (sRNAseq), ad esempio, miRNA, e la maggiore consapevolezza delle altre classi non miRNA Srna, sRNAseq è l&#39;attuale stato-of-the-art in miRNA e sRNA profiling. Come tale, il nostro protocollo raccomanda miRNA quantificare e altri sRNAs su campioni di HDL utilizzando sRNAseq. Tuttavia, l&#39;RNA totale isolato da HDL può anche essere utilizzato per quantificare i singoli miRNA ed altri sRNAs o convalidare i risultati sRNAseq usando PCR in tempo reale unapproaches. Qui si descrive nel dettaglio un protocollo per la raccolta, la depurazione, la quantificazione, l&#39;analisi dei dati, e la convalida di elevata purezza HDL-sRNAs. L&#39;obiettivo generale di questo lavoro è quello di dimostrare la fattibilità e il processo di sRNA quantificazione in HDL altamente puro isolato da plasma umano.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA Sistema FPLC puro</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Colonne di aumento in linea</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>da tavolo centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (acquistabile tramite USA Scientific)</td></tr><tr><td>Microfuge&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Saggio del DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Libreria di sequenziamento Kit di quantificazione qPCR</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga ultra trasparenti</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di potassio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Filtri microcentrifughi 0,45 &; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Filtri microcentrifughi 0,22 &; micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Kit di isolamento dell'RNA totale</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Kit colorimetrico per colesterolo totale</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di centrifugazione cut-off da 10.000 m.w.</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>acquistato tramite provette per strisce PCR Millipore</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>acquistato tramite Fisher</td></tr><tr><td>Kit microRNA RT</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>Per 1000 reazioni</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>flacone da 50 ml</td></tr><tr><td>Kit Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Kit per pulizia e concentratore</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>acquistato tramite Fisher</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante piccolo rna quantificazione

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

La diversità dei piccoli RNA non codificanti (sRNA) è in rapida espansione e il loro ruolo nei processi biologici, tra cui regolazione genica, stanno emergendo. Più interessante, sRNAs si trovano anche al di fuori delle cellule e sono stabilmente presenti in tutti i liquidi biologici. Come tale, sRNAs extracellulari rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e sono probabilmente coinvolti nella segnalazione cellulare e reti di comunicazione intercellulare. Per valutare il loro potenziale come biomarcatori, sRNAs possono essere quantificati nel plasma, urine e altri fluidi. Tuttavia, per comprendere appieno l&#39;impatto di sRNAs extracellulari come segnali endocrini, è importante determinare quali vettori trasportano e li protegge nei fluidi biologici (ad esempio, plasma) che cellule e tessuti contribuiscono alle piscine Srna extracellulari, e le cellule e tessuti capaci di accettare e utilizzare extracellulare sRNA. Per raggiungere questi obiettivi, è fondamentale per isolare le popolazioni altamente pure di vettori extracellulariper sRNA profilatura e la quantificazione. Abbiamo precedentemente dimostrato che le lipoproteine, in particolare lipoproteine ​​ad alta densità (HDL), i trasporti microRNA (miRNA) funzionali tra le cellule e HDL-miRNA sono significativamente alterati nella malattia. Qui, abbiamo dettaglio un nuovo protocollo che utilizza tandem isolamento HDL con ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC) e fast-proteina-cromatografia liquida (FPLC) per ottenere HDL altamente puro per la profilatura a valle e la quantificazione di tutti sRNAs, tra miRNA, utilizzando sia alta sequenziamento -throughput e real-time PCR approcci. Questo protocollo sarà una risorsa preziosa per l&#39;indagine di sRNAs su HDL.

Questo protocollo è una serie di metodi consolidati legati insieme per consentire la quantificazione della sRNAs sulla altamente puro HDL by high throughput sequencing o real-time PCR (Figura 1). Per dimostrare la fattibilità e l&#39;impatto di questo protocollo, HDL è stato purificato da plasma umano con il metodo DGUC e FPLC tandem. Raccolti frazioni FPLC corrispondenti a HDL (il colesterolo dalla distribuzione) sono stati concentrati e RNA totale è stato isolato da 1 ...

Questo protocollo descrive l'isolamento e la quantificazione di piccoli RNA di lipoproteine ad alta densità.

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare le piccole RNA non codificanti presenti su lipoproteine purificate. Questo protocollo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle lipoproteine, come la definizione delle firme di piccole RNA nelle lipoproteine in condizioni di salute e di malattia, nonché lo sviluppo delle piccole RNA delle lipoproteine come biomarcatori di malattia o come messaggeri tra cellula e cellula. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di analizzare lipoproteine altamente purificate per rilevare variazioni delle piccole RNA in condizioni patologiche o sperimentali.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cardiometaboliche, poiché gli RNA extracellulari rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e gli RNA piccoli associati alle lipoproteine hanno un potenziale promettente come bersagli terapeutici in futuri studi. Sebbene questo metodo sia stato progettato per gli RNA piccoli dell'HDL, può essere adattato anche per gli RNA piccoli delle lipoproteine a densità molto bassa e a bassa densità. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa della mancanza di attrezzature adeguate e di competenze specifiche nella preparazione dei campioni per l'ultracentrifugazione su gradiente di densità.Questo protocollo è composto da metodi consolidati collegati tra loro per la quantificazione di piccole RNA su HDL altamente purificate, mediante sequenziamento ad alto rendimento o PCR in tempo reale. Questo video tratta la purificazione delle HDL. Il protocollo verrà dimostrato dal mio assistente, Evan Shadari.Per iniziare, aggiungere 90 microlitri di antiossidanti 100x a nove millilitri di plasma. Successivamente, regolare la densità del plasma a 1,025 grammi per millilitro, aggiungendo 0,251 grammi di bromuro di potassio ogni nove millilitri di plasma. Agitare dolcemente il plasma a temperatura ambiente fino a quando tutto il sale si sarà disciolto.Successivamente, trasferire il plasma in provette per ultracentrifuga, assicurandosi di avere uno strato di bolle nella parte superiore. Non deve essere presente aria intrappolata sotto il plasma. Poi, preparare un ago da 18 gauge piegandolo ad angolo di 90 gradi a un centimetro dalla punta, con la parte smussata rivolta verso l'alto.Quindi, utilizzando una siringa e l'ago piegato, posizionare con attenzione tre millilitri della soluzione di sovrasovrapposizione numero uno sul plasma. Rimuovere la maggior parte delle bolle sulla superficie, lasciando da due a tre millimetri tra il menisco e il bordo del tubo. Successivamente, inserire con cura i tubi nei contenitori dello SW 40 Ti.Pesare ogni secchio con i tappi e bilanciare esattamente i secchi che occuperanno posizioni opposte nella centrifuga. Successivamente, inserire il rotore nell'ultracentrifuga ed eseguire la centrifugazione a 274.400 ×g per 24 ore a quattro gradi Celsius, con il freno impostato a un valore intermedio pari a quattro. Il giorno successivo, rimuovere con attenzione i secchi dal rotore ed estrarre le provette dai secchi.Quindi, rimuovere lentamente due millilitri dallo strato superiore del sovrapposizione, utilizzando una siringa e un ago piegato. Questa è la frazione VLDL IDL. Successivamente, raccogliere i sette millilitri rimanenti di plasma e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri.Portare il volume del plasma a nove millilitri aggiungendo la soluzione di sovrapposizione numero due. Successivamente, regolare la densità a 1,080 grammi per millilitro aggiungendo 0,746 grammi di bromuro di potassio. Poi, agitare delicatamente il campione per sciogliere il sale, operazione che richiederà circa 20 minuti.Quindi, trasferire il campione in una provetta per ultracentrifuga senza intrappolare aria. Assicurarsi che si formi uno strato di bolle in superficie. Utilizzando l'ago curvo, sovrapporre con attenzione tre millilitri della soluzione di sovrapposizione numero tre.Quindi, rimuovere la maggior parte delle bolle e caricare con attenzione i tubi nel secchio SW 40 Ti. Bilanciarli e centrifugarli, come descritto in precedenza, per 24 ore. Il giorno successivo, prelevare con attenzione due millilitri dallo strato superiore dell'overlay utilizzando l'ago piegato.Questa è la frazione LDL. Successivamente, trasferire il campione rimanente in un nuovo tubo conico da 15 millilitri e portare il volume a nove millilitri con la soluzione numero quattro. A questo punto, regolare la densità a 1,30 grammi per millilitro aggiungendo circa 3,33 grammi di bromuro di potassio e agitando delicatamente il campione fino a quando il sale si scioglie.Successivamente, trasferire il campione in un tubo per ultracentrifuga e sovrapporre con attenzione tre millilitri della soluzione numero cinque. Ora, sottoporre il campione a ultracentrifugazione come in precedenza, ma per 48 ore. Due giorni dopo, raccogliere i due millilitri superiori del soprannatante utilizzando una siringa e un ago piegato.Questo costituisce la frazione HDL. Per rimuovere le soluzioni ad alta salinità, trasferire la frazione HDL in una membrana dialitica umida con cutoff di peso molecolare di 10.000. Successivamente, dializzare per 24 ore in un litro di XPBS 1x con agitazione delicata a quattro gradi Celsius.Sostituire la soluzione di PBS per tre volte nell'arco di 24 ore. Successivamente, determinare la concentrazione proteica della frazione di HDL utilizzando il metodo BCA. Le vescicole extracellulari, o esosomi, hanno una densità simile a quella delle HDL di piccole dimensioni e potrebbero quindi essere presenti nella stessa frazione di densità delle HDL.Pertanto, la frazione HDL richiede un'ulteriore purificazione mediante FPLC. Immediatamente prima di utilizzare la FPLC, far passare 1,2 milligrammi della frazione HDL DGUC in 500 microlitri di soluzione attraverso un filtro centrifugo da 0,22 micron. Raccogliere il campione filtrato in una siringa per iniezione FDLC, assicurandosi che non vengano intrappolate bolle d'aria.Successivamente, impostare la portata dell'FPLC a 0,3 millilitri al minuto con un limite di pressione a 2,6 megapascal. Quindi, equilibrare le colonne con 0,2 volumi di colonna di tampone. Ora iniettare il campione con tre millilitri di tampone nell'apparecchiatura FPLC e avviare la corsa.Raccogliere frazioni da 1,5 millilitro per un totale di 72 frazioni. Identificare le frazioni FPLC corrispondenti all'HDL ottenuto tramite DGUC determinando i livelli di colesterolo totale mediante un kit colorimetrico seguendo le istruzioni del produttore. Ci si aspetta di trovare da sei a sette frazioni FPLC contenenti HDL ottenuto tramite DGUC.Riunire tutte le frazioni contenenti HDL e concentrarle utilizzando un filtro centrifugo con cutoff di 10 chilodalton a 4.000 ×g per un'ora a quattro gradi Celsius, oppure fino a quando il concentrato di HDL raggiunge un volume di circa 100 microlitri. Successivamente, raccogliere il concentrato di HDL e quantificare le proteine mediante il metodo BCA. In seguito, utilizzare la stessa quantità di proteina totale di HDL per isolare l'RNA.Il plasma umano è stato frazionato mediante FPLC senza l'uso della separazione tramite gradiente di densità. Sei frazioni corrispondevano alle HDL e sei alle lipoproteine a densità molto bassa. I lipidi in nero, il colesterolo in rosso e le proteine in blu sono stati misurati tutti mediante kit colorimetrici.In confronto, l'uso della ultracentrifugazione su gradiente di densità prima della FPLC ha portato al ritrovamento di proteine lipidiche e colesterolo quasi esclusivamente nelle frazioni HDL. Da HDL ottenute da quattro donatori plasmatici sani, l'RNA totale è stato isolato e sequenziato utilizzando un protocollo ad un'unica lettura di 50 paia di basi. La distribuzione delle letture normalizzate illustra un arricchimento di RNA piccoli intorno a 21 e 34 nucleotidi.L'analisi della libreria ha mostrato che il 38 percento delle letture corrispondeva a microRNA e il 37 percento derivava da tRNA. Erano inoltre presenti RNA vari, RNA ribosomiali, piccoli RNA, RNA nucleolari piccoli e RNA non codificanti lunghi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro dieci giorni, se effettuata correttamente.Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di confermare le variazioni dell'RNA piccolo delle HDL osservate mediante sequenziamento ad alto rendimento con un altro metodo, come la PCR o il northern blotting. Dopo questa procedura, altri metodi, come la capacità di accettazione del flusso di colesterolo HDL e i saggi di attività anti-infiammatoria delle HDL, possono essere eseguiti durante le fasi di isolamento dell'RNA e di preparazione per il sequenziamento, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio determinare la correlazione tra le variazioni dell'RNA piccolo delle HDL e la funzionalità delle HDL stesse. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei settori dei lipidi e delle lipoproteine per studiare il carico non costituito da colesterolo, in particolare gli acidi nucleici e le malattie metaboliche, come ad esempio l'ipercolesterolemia o il diabete.E non dimenticare che lavorare con il plasma umano può essere estremamente pericoloso; è necessario disporre di un'adeguata formazione sui patogeni trasmessi dal sangue e indossare dispositivi di protezione individuale appropriati durante l'esecuzione di questa tecnica.

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