Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare piccole molecole in grado di interrompere l'interazione tra i canali TRIP8b e HCN. Questo metodo identifica le molecole candidate che potrebbero essere sviluppate in nuovi trattamenti per la depressione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere completata in modo ad alta produttività.

Questa tecnica ha implicazioni per lo sviluppo di una nuova terapia per il disturbo depressivo maggiore perché il nostro laboratorio ha dimostrato che l'interruzione del legame di TRIP8b con HCN può essere di beneficio terapeutico. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato pensando alla depressione, interrompere l'interazione tra TRIP8b e HCN può essere di beneficio terapeutico in altri disturbi come il dolore cronico. La dimostrazione visiva di questo protocollo è importante perché illustra i vantaggi dell'utilizzo di strumenti automatizzati ad alto rendimento per far progredire la ricerca di base e traslazionale in strutture aperte come il laboratorio di analisi ad alto rendimento della Northwestern University.

Dopo aver purificato il frammento proteico TRIP8b 241-602 ed esaminato le interazioni proteiche con un controllo positivo secondo il protocollo di testo, scongelare le aliquote di TRIP8b e HCN1-FITC e tenerle in ghiaccio. Utilizzare FP Buffer per preparare 20 millilitri di 2 micromolari TRIP8b e 50 nanomolari HCN1-FITC. Quindi erogare 25 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di una piastra per microtitolazione nera a 384 pozzetti a bassa legatura.

Per lo screening delle librerie, utilizzare un manipolatore acustico di liquidi per erogare 100 nanolitri di composti in ciascun pozzetto delle colonne da 3 a 22 per una concentrazione finale di 40 micromoli. Erogare 100 nanolitri di DMSO in ciascun pozzetto delle colonne 1 e 23 come controlli negativi. Erogare 100 nanolitri di peptide HCN1 non marcato in ciascun pozzetto delle colonne 2 e 24 come controlli positivi con una concentrazione finale di 10 micromoli.

Incubare le piastre a temperatura ambiente per due ore. Utilizzando un lettore di piastre, misurare la polarizzazione della fluorescenza. In alternativa, le lastre possono essere conservate per 16 ore a 4 gradi Celsius prima della lettura.

Utilizzando la seguente equazione, calcola la percentuale di inibizione, dove XN è la percentuale di inibizione normalizzata corrispondente al segnale X.X, positivo è il segnale medio dai pozzetti di controllo positivi e X negativo è il segnale medio dai pozzetti di controllo negativi. Per validare gli Hits con inibizione superiore al 50% preparare una master mix di 20 millilitri di 2 micromolari TRIP8b e 50 nanomolari HCN1 TAMRA in tampone FP. Erogare 25 microlitri della miscela master in ciascun pozzetto di una piastra per microtitolazione nera a 384 pozzetti.

Quindi aggiungere 100 nanolitri di composti da una piastra contenente due diluizioni seriali di ciascun composto attivo nei rispettivi pozzetti. Per i pozzetti di controllo negativo aggiungere 100 nanolitri di DMSO. Per un controllo positivo, aggiungere 100 nanolitri di peptide HCN1 non marcato diluito in serie con concentrazioni finali comprese tra 200 micromoli e 0,1 micromoli.

Incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore o a 4 gradi Celsius per 16 ore. Utilizzando un lettore di piastre, misurare la polarizzazione della fluorescenza. Calcola i valori IC50 adattando i dati FP dipendenti dalla concentrazione di ciascun composto utilizzando un modello di regressione non lineare a 4 parametri.

Scongelare un'aliquota di ciascuna proteina di fusione TRIP8b marcata HIS e HCN1 marcata GST e tenerle sul ghiaccio. Preparare 1 millilitro di 200 nanomolari HIS TRIP8b e 20 nanomoli di GST-HCN1C40 in tampone di saggio per ogni composto da testare. Utilizzare una pipetta a 16 canali per aggiungere 7 microlitri della miscela HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 a tre pozzetti per fila di file da A a N per testare ogni composto in triplicato.

Centrifugare brevemente la piastra per assicurarsi che i liquidi siano sul fondo di ogni pozzetto e per rimuovere eventuali bolle. Successivamente, erogare i composti Hit da testare nella piastra per ottenere una concentrazione finale di 200 micromoli nella riga A e terminare con 0,1 micromoli nella riga L.Aggiungere lo stesso volume di DMSO nella riga M.Quindi erogare il peptide HCN1 non marcato a una concentrazione finale di 10 micromoli nella riga N.Agitare la piastra per due minuti e incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente. Utilizzando il tampone di saggio, diluire le perle accettori Anti-GST da 1 a 50.

Con una pipetta a 16 canali, aggiungere 3,5 microlitri di perle accettori diluite a ciascun pozzetto della piastra e mescolare pipettando delicatamente per evitare la formazione di bolle. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per un'ora. Diluire le perle donatrici di chelato di nichel da 1 a 50 con il tampone di saggio senza esporre la miscela alla luce.

Aggiungere 3,5 microlitri di perle donatrici diluite in ciascun pozzetto della piastra e mescolare delicatamente, evitando bolle d'aria. Sigillare la piastra e incubarla al buio a temperatura ambiente per 1,5 ore. Quindi utilizzare un lettore di piastre per leggere la piastra con i parametri di misurazione elencati qui.

Infine, calcola i valori IC50 adattando i dati per ciascun composto utilizzando un modello di regressione non lineare a 4 parametri. Per valutare l'interazione con HCN1 TAFRA, TRIP8b è stato titolato in una concentrazione fissa di HCN1 TAMRA. Questo grafico mostra che all'aumentare della concentrazione di TRIP8b, più molecole di HCN1 TAMRA si legano e la polarizzazione aumenta.

In questo esperimento, quando l'HCN1 non marcato è stato titolato in una concentrazione fissa di TRIP8b e HCN1 TAMRA, il peptide marcato è stato spostato e il segnale è diminuito. Uno screening ad alto rendimento mostra la percentuale di inibizione di ciascun composto rappresentata da singoli punti sul grafico. I risultati di questo screening sono tracciati con controlli positivi e negativi e ciascuna delle percentuali medie di inibizione di ciascun composto in due esecuzioni del saggio.

In questo esperimento sono stati quindi convalidati composti che mostravano un'inibizione superiore al 50%. Le coordinate X e Y sono state determinate dalla percentuale di inibizione in due esecuzioni del saggio. In questo esperimento, HCN1C40 contiene un tag GST del terminale terminale che lega le perline accettori.

L'interazione dei domini TPR di TRIP8b e del tripeptide C terminale di HCN1 eccita la perlina donatrice con luce a lunghezza d'onda di 680 nanometri per produrre ossigeno singoletto. Infine, come mostrato in questo grafico, la titolazione di concentrazioni crescenti del composto colpito NUCC-5953 in una concentrazione fissa di TRIP8b e HCN1C40 ha aumentato l'inibizione dell'interazione TRIP8b HCN1. Prima di iniziare lo screening ad alto rendimento, convalidare la preparazione proteica e la polarizzazione della fluorescenza in saggi di prossimità basati su microsfere.

Assicurati che la proteina sia di elevata purezza. Aliquotare la proteina per evitare cicli multipli di congelamento, scongelamento. È importante utilizzare reagenti di alta qualità, tra cui DMSO e Triton freschi.

Non dimenticare che lavorare con il DMSO può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'elettrofisiologia e la citometria a flusso per determinare se i composti colpiti hanno attività nelle cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire uno schermo ad alta produttività con un saggio basato sulla polarizzazione della fluorescenza.