Anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique A et protéine G Perles

L’objectif global de cette méthode est de marquer les anticorps à l’aide de matrices fluorescentes à partir d’échantillons purifiés ou directement à partir de milieux cellulaires à l’aide de billes magnétiques de protéine A ou G. Cette méthode peut être utilisée pour optimiser la chimie de marquage, même d’une petite quantité d’anticorps dans le milieu cellulaire. Conduisant à une meilleure application en aval des anticorps.

Les principaux avantages de cette technique sont que les anticorps ne nécessitent pas de purification, que la chimie des amines ou des thiols peut être utilisée et que la méthode peut être automatisée ou manuelle. Commencez par remettre uniformément les perles en suspension en les secouant doucement. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes dans un tube de microsentrifuge de 1,5 millilitre.

Ensuite, placez le tube dans un support magnétique. Après 10 secondes, remplacez soigneusement la mémoire tampon de stockage par 250 microlitres de tampon de liaison aux anticorps et mélangez bien les billes. Après 10 secondes supplémentaires, remplacez soigneusement le tampon de liaison par un millilitre de l’anticorps d’intérêt.

Et mélangez l’échantillon pendant 60 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, remettez les tubes dans l’aimant et retirez le surnageant lorsque les billes se sont déplacées sur les côtés du tube. Ensuite, rincez les billes et le mélange d’anticorps en deux lavages de 10 secondes avec 250 microlitres de tampon de lavage liant les anticorps par lavage.

Pour marquer les anticorps à l’aide de la chimie des amines, après le deuxième lavage, remplacez le tampon de lavage par 100 microlitres de tampon de conjugaison d’amines et ajoutez 2,5 microlitres de colorant réactif aux amines fraîchement préparé pour 100 microgrammes d’anitbody. Agitez l’échantillon pendant 60 minutes à température ambiante pour maintenir les billes en suspension pendant l’étiquetage. Ensuite, remettez le tube dans l’aimant pendant 10 secondes et retirez le surnageant.

Lavez les billes deux fois avec un tampon de lavage anticorps, comme nous venons de le démontrer. Ensuite, remplacez le tampon de lavage par 50 microlitres de tampon d’élution et mélangez les billes pendant cinq minutes. Remettez le tube dans l’aimant pendant 10 secondes et transférez l’anticorps élué dans un nouveau tube de microcentrifugation contenant cinq microlitres de tampon de neutralisation.

Éluer l’anticorps une fois de plus, comme nous venons de le démontrer, en prélevant les échantillons élués. Ensuite, mesurez l’absorbance du conjugué anticorps-colorant à 280 nanomètres et au lambda max pour le colorant. Pour marquer les anticorps à l’aide de la chimie thiolique, après le deuxième lavage, remplacez le tampon de lavage par 250 microlitres de tampon de conjugaison thiol et mélangez les billes avec un pipetage doux.

Après 10 secondes, lavez les billes deux fois avec un tampon de lavage anticorps. Ensuite, remplacez le tampon de lavage par 100 microlitres de tampon de conjugaison thiol et ajoutez du DTT à une concentration finale de 2,5 millimolaires. Mélangez les perles pendant encore 60 minutes.

Ensuite, remettez les billes dans l’aimant pendant 10 secondes et jetez le tampon. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de tampon de conjugaison thiolaire aux billes en mélangeant doucement. Après 10 secondes, lavez les billes deux fois avec un tampon de lavage anticorps, en remplaçant le deuxième lavage par 100 microlitres de tampon de conjugaison de thiol frais.

Maintenant, ajoutez 2,5 microlitres de colorant réactif au thiol fraîchement préparé pour 100 microgrammes d’anticorps et mélangez les billes pendant 60 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, remettez le tube dans l’aimant pendant 10 secondes. Et remplacez le surnageant par 250 microlitres de tampon de conjugaison de thiol frais avec un mélange doux.

Après 10 secondes, lavez les perles deux fois. Ensuite, remplacez le tampon de lavage par 50 microlitres de tampon d’élution et éluez l’anticorps conjugué deux fois, comme cela vient d’être démontré. Ensuite, mesurez l’absorbance du conjugué anticorps-colorant à 280 nanomètres et au lambda max pour le colorant.

La forte affinité entre les anticorps et la protéine G, la forte affinité de l’aimant pour les billes et l’optimisation de la méthode avant la purification des billes entraînent ensemble une perte nominale d’anticorps pendant la réaction de marquage, comme en témoigne la récupération efficace de trois isotypes différents d’anticorps de souris après le démarquage fluorescent par rapport à la simple purification. Cette récupération est également évidente dans les gels de Coomassie, où les faibles propriétés de liaison non spécifiques des billes magnétiques de la protéine G entraînent la présence de chaînes lourdes et légères hautement purifiées et démarquées par fluorescence. Sur le marquage des billes avec des billes magnétiques de protéine A, il est également compatible avec plusieurs colorants fluorescents, ce qui permet une récupération élevée et de bons rapports colorant/anticorps.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures, si elle est correctement exécutée. Permettre de manipuler plusieurs échantillons manuellement ou une plate-forme automatisée pour un meilleur débit. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les billes magnétiques en suspension à tout moment.

Choisissez le volume de billes magnétiques approprié pour l’échantillon. Et optimiser la quantité de colorant fluorescent pour l’anticorps d’intérêt. À la suite de cette procédure, les anticorps marqués doivent être testés pour déterminer leur fonctionnalité à l’aide d’essais biologiques pertinents, tels que l’ELISA, les faits ou les essais cellulaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les anticorps purifiés et non purifiés avec des marqueurs fluorescents ou d’autres petites molécules, comme la biotine ou les médicaments cytotoxiques, à l’aide de billes magnétiques de protéine A ou G.