Una tecnica innovativa per la generazione e Observing Chemiluminescenza in un ambiente biologico

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di offrire una nuova tecnica di imaging preclinico, interoperatorio e chemiluminescente in grado di fornire vantaggi rispetto alle tecniche ottiche esistenti in termini di rapporti segnale/rumore e limiti di rilevamento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave che non sono state accessibili dalle tradizionali tecniche di imaging ottico in molti campi legati alle scienze biologiche. I principali vantaggi di questa tecnica sono che ha un elevato rapporto segnale/rumore e che non richiede né luce né radiazioni istantanee.

Quindi quello che abbiamo scoperto è che le implicazioni di questa tecnica si estendono davvero all'imaging interoperatorio di più stati patologici, incluso il cancro, a causa degli elevati rapporti segnale-rumore che questa tecnica ha da offrire. Poiché la luce incidente non è necessaria per questa tecnica, non ci sono problemi con l'assorbimento della luce incidente. Inoltre, è disponibile una grande cassetta degli attrezzi chimici per funzionalizzare la molecola centrale chemiluminescente.

Per iniziare la procedura preparare soluzioni standard da 100 microlitri di cloruro di tris(bypiridina)rutenio(II)in acqua ad osmosi inversa. Quindi, combinare ogni standard con 100 microlitri di una soluzione da 25 millimolari di nitrato di cerio di ammonio in acqua ad osmosi inversa su un vetrino da microscopio. Aprire il software di imaging del lettore di bioluminescenza e fare clic su Inizializza.

In modalità imaging, assicurarsi che la luminescenza e la fotografia siano selezionate e che la fluescenza sia deselezionata. Imposta il tempo di esposizione luminescente, il binning, f/stop e i parametri del filtro di emissione. Imposta il tempo di esposizione della foto, il binning e i parametri f/stop.

Quindi impostare l'altezza del soggetto in base al campione da riprendere. Impostare il campo visivo su B per una distanza di 14 centimetri tra la telecamera e il tavolino di campionamento. Coprire il pavimento della camera di imaging del lettore di bioluminescenza nella fase di campionamento con carta da costruzione nera.

Quindi posizionare il primo vetrino con la gocciolina di miscela standard sul tavolino del campione con la gocciolina centrata nel mirino della lightbox verde. Quindi, riempi il flacone spray da tre once di un nebulizzatore su misura con la soluzione 1:3 di trietilammina in una soluzione 50/50 di acqua ed etanolo. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nel tubo di aspirazione.

Posizionare il gruppo nebulizzatore nella camera di imaging con l'ugello di spruzzatura rivolto verso la gocciolina da riprendere senza ostruire la visuale della gocciolina da parte della telecamera. Assicurarsi che l'interruttore di alimentazione e l'indicatore di alimentazione del nebulizzatore siano accesi, che l'interruttore a levetta magnetico sia spento e che i cavi del nebulizzatore di alimentazione e del telecomando non siano aggrovigliati. Copri i punti caldi come i segni sulla diapositiva con piccoli pezzi di carta da costruzione nera.

Posizionare almeno 40 centimetri del cavo remoto del nebulizzatore nella camera di imaging. Chiudere delicatamente lo sportello della camera senza crimpare i cavi del nebulizzatore. Nel software dello strumento, fare clic su acquisisci, abilitare il salvataggio automatico e impostare il percorso del file di dati.

Avviare la sequenza di imaging. Quando l'otturatore si apre con un clic udibile, premere tre volte l'interruttore del nebulizzatore per spruzzare tre raffiche di soluzione di trietilammina sul campione. Ripetere la procedura con ogni vetrino standard per determinare la concentrazione minima rilevabile dell'agente di imaging del rutenio.

Per iniziare la procedura di imaging in vivo, preparare 100 microlitri di una soluzione contenente tra 8 e 33 nanomoli di cloruro di tris(bypiridina)rutenio(II)in soluzione salina tamponata con fosfato. Preparare una soluzione acquosa da 25 millimolari di nitrato di cerio di ammonio. Successivamente, iniettare per via endovenosa 100 microlitri dell'agente di imaging del rutenio nella vena caudale di topi sani.

Sacrificare i topi 10 minuti dopo l'iniezione per asfissia da anidride carbonica. Rimuovere la pelle dal busto con un taglio a Y e quindi rimuovere l'arco costale per esporre il cuore e i polmoni. Tagliare un'uscita nell'atrio destro e iniettare 20 millilitri di PBS attraverso un ago calibro 24 nel ventricolo sinistro.

Taglia la pelle della pancia per esporre il rene e il fegato. Se l'organo di interesse è il fegato, il rene o la milza fanno un taglio longitudinale visibile attraverso l'organo. Preparare una nuova sequenza di imaging nel software del lettore bioluminescente.

Per l'imaging dell'intero addome, posizionare il topo nella camera di imaging con l'addome aperto rivolto verso la fotocamera e la testa rivolta verso la parte posteriore dello strumento. Centra l'organo di interesse nel mirino della lightbox verde. Lavare accuratamente il flacone spray e l'ugello dal gruppo nebulizzatore, quindi riempire il flacone con la soluzione di nitrato di cerio ammonio.

Posizionare il nebulizzatore nella camera di imaging con l'ugello di spruzzatura diretto verso il sito di imaging. Assicurarsi che la fotocamera non sia ostruita, che i cavi non siano aggrovigliati e che almeno 40 centimetri del cavo remoto siano nella camera. Chiudere la camera e avviare la sequenza di imaging.

Quando l'otturatore si apre con un clic, premere tre volte l'interruttore per spruzzare tre raffiche di agente ossidante sul sito di imaging. Dopo l'imaging, rimuovere il gruppo nebulizzatore e sciacquare accuratamente l'ugello di spruzzatura per evitare la cristallizzazione del nitrato di cerio di ammonio. Per il successivo imaging e quantificazione dei singoli organi, rimuovere il topo dallo strumento e asportare gli organi interni partendo dalla cavità corporea aperta.

Tagliare la pelle della zampa posteriore per asportare campioni di tessuto muscolare. Se l'organo di interesse è il fegato, il rene o la milza tagliare l'organo a metà longitudinalmente. Quindi posiziona l'organo su una capsula di Petri o su un pezzo di carta da costruzione nera.

Immagina ogni organo allo stesso modo dell'intero animale, risciacquando l'ugello di spruzzatura dopo ogni sequenza. In questa procedura, ai topi è stato iniettato un agente di imaging a base di rutenio e il tessuto di interesse è stato spruzzato con un ossidante per indurre la chemiluminescenza. In queste condizioni, la concentrazione minima rilevabile dell'agente di imaging è stata determinata in 6,9 picomoli per centimetro quadrato.

Le immagini in chemiluminescenza in luce bianca degli organi di interesse sono state ottenute con un lettore di bioluminescenza. Il segnale di chemiluminescenza è stato osservato prevalentemente nei reni dopo l'iniezione endovenosa, indicando l'eliminazione renale del catione tris(bypiridina)rutenio (II) idrofilo. Il rapporto segnale/rumore dell'agente di imaging rispetto al solo PBS era di 27:1 nei reni e di 21:1 nel fegato.

I linfonodi poplitei di topo sono stati valutati anche con un'iniezione sottocutanea di una soluzione più concentrata dell'agente di imaging a base di rutenio. I linfonodi contenenti l'agente di imaging hanno mostrato una radiosità significativamente maggiore rispetto ai linfonodi contenenti solo PBS. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di escludere la luce ambientale e di evitare la contaminazione con il rutenio tris bpy. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging biomolecolare per esplorare stati patologici come il cancro nei topi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su questioni che non erano accessibili con le tradizionali tecniche di imaging ottico, qualsiasi domanda che potrebbe essere indagata con le tecniche tradizionali può potenzialmente essere affrontata con la chemiluminescenza.