Name: Una tecnica innovativa per la generazione e Observing Chemiluminescenza in un ambiente biologico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Scopri una tecnica innovativa di imaging chemiluminescente intraoperatorio che utilizza un complesso di rutenio per ottenere elevati rapporti segnale-rumore senza luce incidente. Questo metodo migliora la chiarezza delle immagini chirurgiche in vivo.

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Gli autori ringraziano il Prof. Jan Grimm e il Sig. Travis Shaffer per le loro utili discussioni e il Sig. David Gregory per l'editing del manoscritto. I servizi tecnici forniti dalla MSK Animal Imaging Core Facility, supportati in parte dal NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, sono riconosciuti con gratitudine. Gli autori ringraziano il NIH (K25 EB016673 e R21 CA191679, T.R. e 4R00CA178205-02, B.M.Z.), il Centro MSK per l'Imaging Molecolare e la Nanotecnologia (T.R.), la Tow Foundation (B.C.) e la National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 presso l'Hunter College for B.C. e T.M.S.) per il loro generoso sostegno. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata da finanziamenti della King Abdullah University of Science and Technology.

Dichiarazione etica: tutti gli esperimenti su animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e sotto le linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC). 1. Costruzione di un dispositivo di nebulizzazione <ol><li> Attaccare legno parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) verticalmente al centro di una parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) con due viti (4 x 25 mm 2). Attaccare legno parte C (11 × 2,5 × 1,8 centimetri 3) per mezzo della parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) utilizzando una vite, in modo che parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) possono ancora essere spostati. Vedere la Figura 1. </li><li> Due fori attraverso la punta inferiore del grilletto flacone spray di un mini spruzzatore 3 oz plastica (D) e spingere una barra di acciaio inossidabile (10 cm di &quot;acciaio 1/16) (E) fino a formare due anelli, uno su entrambi lato del grilletto. </li&gt; <li> Avvolgere la parte inferiore della bottiglia spray con nastro adesivo (F) per evitare le fascette di scivolare. Fissare il flacone spray al legno parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) con le due fascette di plastica (28 cm) (G). </li><li> Tagliare il motore 011 servo (I) e ricollegare con i cavi sciolti del servocomando (H). Quindi, fissare il servomotore all&#39;inizio legno parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) con nastro adesivo. </li><li> Attaccare una matita (J) alla leva servomotore utilizzando la graffetta (K). Strettamente collegare le parti più esterne della matita per gli anelli in tondino d&#39;acciaio che utilizzano fili torsione di plastica coperto (L) e fissare le estremità sulla matita con del nastro adesivo. </li><li> Tagliare il connettore del cavo magnetica dell&#39;unità di controllo del servomotore (M) e ricollegare al cavo dell&#39;altoparlante (N). Poi, il nastro l&#39;unità di controllo del servomotore al legno parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Tagliare un cavo W1 con connettori magnetici a metà e collegare una parte per l&#39;estremità libera del rame sCavo peaker (1 m). Collegare l&#39;interruttore a levetta (magnetico) i2 e potenza P1 al cavo W1 a disposizione e una batteria da 9V. </li></ol> 2. Sensibilità determinazione del metodo <ol><li> In una provetta da microcentrifuga da 1,5, preparare le soluzioni di [Ru (bpy) 3] Cl 2 in acqua ad osmosi inversa (100 l) in quantità di 260 mg (347 nmol), 52 mg (69 nmol), 26 mg (34 nmol) , 5 mcg (6.9 nmol), 3 mg (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), e 3 ng (3,5 pmol). </li><li> Miscelare 100 ml di ciascuna [Ru (bpy) 3] Cl 2 soluzione con 100 ml di una soluzione acquosa di nitrato di ammonio di cerio ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) in acqua (25 mM) su un vetrino da microscopio. </li><li> Impostare l&#39;acquisizione nel lettore bioluminescenza per l&#39;inizializzazione del software di imaging. <ol><li> Accedi al profilo utente e cercare l&#39;acquipannello di controllo sizione. Clicca su &quot;inizializzare&quot; e attendere che lo strumento è pronto. </li><li> Cercare &quot;Modalità Imaging&quot; e assicurarsi che &quot;luminescenti&quot; e &quot;fotografia&quot; sono controllati e che &quot;Fluorescent&quot; è incontrollato. </li><li> Change &quot;Tempo di esposizione&quot; impostazione &quot;luminescente&quot; per 20 s. Impostare le altre impostazioni per &quot;luminescente&quot; come segue: &quot;categorizzazione&quot;: media; &quot;F / stop&quot;: 1; e &quot;filtro per le emissioni&quot;: Open. NOTA: I tempi di esposizione potrebbero aver bisogno di essere adattato a seconda della strumentazione e l&#39;impostazione sperimentale utilizzato, se diverso dal setup presentato. </li><li> Per &quot;Photograph&quot;, utilizzare le seguenti impostazioni: &quot;Il tempo di esposizione&quot;: Auto; &quot;Categorizzazione&quot;: media; e &quot;F / stop&quot;: 8. Regolare il &quot;Soggetto Altezza&quot;, secondo l&#39;imaging target.Look per il menu a discesa &quot;Campo visivo&quot;. L&#39;impostazione iniziale è &quot;C.&quot; Passare alla &quot;B&quot; (14 cm di distanza tra il camera e fase del campione). </li></ol></li><li> Impostare il nebulizzatore posizionando un vetrino microscopico su un foglio di cartoncino nero sul pavimento della camera di imaging per proteggerlo dalla agente ossidante. Mescolare un 100 μLdroplet di [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution con 100 ml di una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Osservare la scatola mirino verde. <ol><li> Posizionare imaging soggetto sul cartoncino nero, tale che l&#39;area di interesse è al centro della scatola luminosa verde mirino visualizzato sulla fase del campione. Preparare il nebulizzatore staccando il flacone spray di plastica dal supporto ligneo. Riempire una soluzione di trietilammina (1: 3 in acqua / etanolo) nel suo serbatoio plastica e ricollegare al supporto in legno. </li><li> Posizionare il nebulizzatore all&#39;interno del lettore bioluminescenza e assicurarsi che il cavo di alimentazione sia scollegato dal cavo nebulizzatore. Assicurarsi che l&#39;interruttore di alimentazioneè attiva, l&#39;interruttore a levetta è spento, e il LED rosso è acceso Posizionare il nebulizzatore tale che il flusso di spruzzo è puntato verso la zona di interesse sull&#39;imaging soggetto, minimizzando la vista ostruzione dalla fotocamera a imaging soggetto dalla testa ugello. </li><li> Mettere piccoli pezzi neri di cartoncino oltre eventuali punti caldi (ad esempio, macchie bianche su preparati microscopici o siti di iniezione) per proteggerli da spruzzo. Inserire almeno 40 cm di cavo a distanza nebulizzatore all&#39;interno della camera di imaging, tale da non interferire con imaging soggetto, il nebulizzatore, o la serratura della porta magnetica. Chiudere la porta sistema di imaging. NOTA: Il mirino cambia dimensioni sulla base del &quot;campo visivo&quot; in &quot;Immagine vivente;&quot; assicurarsi che questo sia impostato su &quot;B&quot;. </li></ol></li><li> Acquisire un&#39;immagine avviando la sequenza di imaging. Fai clic su &quot;Acquisire&quot; nel &quot;Pannello di controllo di acquisizione.&quot; Al primo Sequ di imagingza, abilitare il salvataggio automatico se lo si desidera (consigliata) e scegliere una cartella di dati. Ignorare la finestra &quot;Edit imaging etichette&quot; fino alla fine della sequenza. NOTA: Il software di controllo visualizza le azioni dello strumento passo-passo in tempo reale. Dopo aver preparato la misurazione e spostando la fase del campione nella posizione giusta, apre l&#39;otturatore e conta il tempo di misura. L&#39;apertura dell&#39;otturatore può anche essere ascoltato da un suono click generato dalla macchina. </li><li> Come si apre l&#39;otturatore, spruzzare tre esplosioni di una soluzione di trietilammina (1: 3 in acqua / etanolo, 0,24 ± 0,04 ml per spruzzo Burst) commutando l&#39;interruttore a levetta tre volte per generare chemiluminescenza. NOTA: La fase del campione si sposta durante la misura. Lasciare sufficiente (almeno 40 cm) cavo all&#39;interno dello strumento per permettere questo. Assicurarsi che la soluzione da spruzzare dal nebulizzatore può essere aspirato dal tubo ascendente e che non vi siano bolle d&#39;aria nel tubo. Avere diverse batterie di riservas per il nebulizzatore pronti in caso necessario. </li></ol> 3. In Vivo Imaging Dopo sistemica dell&#39;iniezione endovenosa <ol><li> In una provetta da microcentrifuga da 1,5, preparare 100 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente tra l&#39;8 e il 33 nmol di [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparare una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in acqua (25 mM) allo stesso tempo. </li><li> Endovenosa iniettare 100 ml di [Ru (bpy) 3] Cl 2 nella vena della coda di topi sani (n = 5). </li><li> Euthanize i topi 10 minuti dopo l&#39;iniezione tramite CO 2 asfissia. <ol><li> Rimuovere la pelle con una Y-cut dal tronco, quindi rimuovere costale in una forma ad U per esporre il cuore e polmoni. Profumato topi tagliando una presa nell&#39;atrio destro e iniettando 20 ml di PBS attraverso un ago calibro 24 nel ventricolo sinistro 18. tagliare con cura attraverso il ventrepelle e esporre il rene e il fegato. Tagliare longitudinalmente attraverso gli organi di creare un taglio visibile. </li></ol></li><li> Impostare l&#39;acquisizione come descritto nei passaggi 2,3-2,6, con le seguenti modifiche. <ol><li> Dopo aver lavato accuratamente il serbatoio di plastica nebulizzatore, riempirla con una soluzione di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in acqua (25 mM) invece di trietilammina. NOTA: E &#39;importante lavare a fondo l&#39;ugello nebulizzatore dopo ogni uso, dal momento che cristallizzando (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 può distruggere l&#39;ugello di spruzzo dopo diversi usi. </li></ol></li><li> Utilizzare l&#39;intero campioni di origine animale o di organi per l&#39;imaging. <ol><li> Per tutta l&#39;imaging dell&#39;addome, posizionare la carcassa mouse con l&#39;addome aperto rivolto verso la telecamera ed il capo rivolto verso la parte posteriore dello strumento. Centrare l&#39;organo di essere ripreso (per esempio, il fegato o renali) nella casella di luce verde mirino. </li><li> Fo individuo di immagini di organi e la quantificazione, togliere il mouse dallo strumento di imaging e pin verso il basso. Partendo dalla cavità del corpo già aperto, asportare gli organi interni (ad esempio, reni, fegato, polmoni, muscoli, milza, cervello e cuore). Tagliare la pelle zampa posteriore per asportare il tessuto muscolare. Aprire con cautela il cranio con un bisturi per asportare il cervello. <ol><li> Se l&#39;organo di interesse è di reni, fegato milza, tagliare tutti gli organi in mezza longitudinalmente, posizionare ogni organo in una capsula di Petri o un pezzo di cartoncino nero. </li></ol></li><li> Seguire la procedura descritta nei passaggi 2,3-2,6 per stabilire l&#39;emissione relativa del tracciante chemiluminescente per singoli organi. </li></ol></li></ol> 4. imaging in vivo di Linfonodi <ol><li> Preparare 10 ml di una soluzione di PBS contenente 80 nmol di [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparare una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) allo stesso tempo. </li><li> Iniettare 10 ml della soluzione subdermally nella zampa posteriore di topi sani (n = 5). Come controllo negativo, iniettare la zampa controlaterale con 10 ml di PBS pura. Sacrificare i topi con CO 2 asfissia 15 minuti dopo l&#39;iniezione. Togliere la pelle su entrambe le zampe posteriori per esporre i canali linfatici fino ai linfonodi poplitea. </li><li> Impostare l&#39;acquisizione come descritto al punto 3.4. </li><li> Rimuovere i linfonodi poplitei da entrambe le gambe posteriori, tagliarli a metà, e spruzzare con ossidante su un piatto Petri, come descritto in precedenza (fase 3.5.3), ai fini della quantificazione. </li></ol>

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<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+labeling+and+bioanalytical+applications+of+a+tris%282%2C2%E2%80%B2-bipyridyl%29ruthenium%28II%29-based+electrochemiluminescence+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1146-1159 (2014).</li>
<li>Bœuf, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/262418715_Encapsulated_RutheniumII_Complexes_in_Biocompatible_PolyDL-lactide-co-glycolide_Nanoparticles_for_Application_in_Photodynamic_Therapy">Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy.</a> ChemPlusChem. 79 (1), 171-180 (2014).</li>
<li>Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+its+applications+in+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Surgery%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and its applications in surgery.</a> Brit. J. Surgery. 97 (4), 463-465 (2010).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo presentato una tecnologia capace di delineare otticamente tessuto tramite l&#39;emissione di fotoni create da un reporter chemiluminescente. A differenza di altri, più stabilito, tecnologie 4, 5, 6, 7, 8, 9, questo sistema reporter chemiluminescenza impiega una sonda immagini che non radioattivo e facilita il ri...

Negli ultimi decenni, le tecnologie di imaging hanno rivoluzionato il modo in cui i medici a diagnosticare e monitorare la malattia. Queste tecnologie di imaging, tuttavia, sono stati in gran parte limitato a sistemi di imaging di tutto il corpo, come la tomografia ad emissione di positroni (PET), singolo fotone-emissione di tomografia computerizzata (SPECT), tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI). Particolare attenzione è stata dedicata al cancro, e innovazioni tecnologiche di imaging hanno notevolmente migliorato il modo in cui questa malattia è diagnosticata e trattata. Nonostante questi progressi, c&#39;è un posto in cui queste tecnologie di imaging proprio non si adattano: la sala operatoria. Mentre le tecniche di imaging intero corpo può aiutare nella pianificazione chirurgica, che in genere non hanno risoluzioni spaziali alto abbastanza per aiutare i medici a determinare in tempo reale se tutto il tessuto tumorale è stata rimossa o tessuto tumorale residuo rimane nascosto ai margini chirurgici 1. Fare in modo che nessun infiltrativamargini del tumore sono lasciati alle spalle è uno dei più importanti obiettivi chirurgici e chirurghi devono camminare una corda tesa tra il rigoroso e prudente la resezione di tessuto. Se troppo viene rimosso, effetti collaterali indesiderati per il paziente sono aggravate; se troppo poco è stato rimosso, i tassi di recidiva sono aumentati 2, 3. Pertanto, è fondamentale per delineare i margini del tumore accurati, e crediamo che l&#39;imaging chemiluminescenza intraoperatoria può contribuire a migliorare l&#39;accuratezza della identificazione dei margini del tumore, aiutando i chirurghi di visualizzare il tessuto maligno che altrimenti potrebbero rimanere inosservato con tecniche consolidate. Ci sono molte tecnologie di imaging attualmente sotto inchiesta per il loro possibile utilità come sistemi di imaging intraoperatorie. Questi includono beta- e γ-radiazioni che emettono le sonde 4, la fluorescenza ottica 5, spettroscopia Raman 6 </sup&gt;, 7, e Cherenkov luminescenza 8, 9. Fino ad oggi, tuttavia, nessuno di questi si sono affermati come strumenti clinici standard. fluorescenza ottica ha finora dimostrato di essere il più promettente di queste tecniche ed è quindi la più esplorata. Mentre è già dimostrato di essere un valido strumento per molte applicazioni, non è priva di limiti. In effetti, il suo svantaggio principale è la fluorescenza di fondo generato dal tessuto biologico intrinsecamente autofluorescenti. Questo segnale di fondo autofluorescenti è un prodotto della eccitazione del tessuto circostante, oltre al fluoroforo, dalla sorgente di luce esterna necessaria per la generazione di un segnale fluorescente. Dal punto di vista pratico, questo autofluorescenza può potenzialmente portare a bassi rapporti segnale-rumore, che possono limitare l&#39;utilità di questa tecnologia in sala operatoria. Il principalevantaggio dell&#39;imaging chemiluminescenza sopra fluorescenza è che la luce di eccitazione è necessaria. Di conseguenza, non vi è alcun fondo autofluorescenza. Nell&#39;imaging chemiluminescenza, l&#39;energia di eccitazione viene invece generato chimicamente. Questo processo produce nessun segnale di fondo non volute e quindi può determinare maggiori rapporto segnale-rumore. Ciò potrebbe concludersi con l&#39;individuazione più precisa ed accurata dei margini chirurgici. Un po &#39;a sorpresa, l&#39;utilità di questo approccio come una tecnica di imaging intraoperatorio è rimasto inesplorato 10. Infatti, l&#39;esempio più vicino a questa tecnica è l&#39;ossidazione del luminolo da mieloperossidasi nei topi 11, 12, 13. Chemiluminescent di imaging biomedico è quindi una zona piuttosto inesplorato di ricerca che potrebbe offrire i seguenti vantaggi: (1) autofluorescenza minimo con un conseguente basso segnale di fondo con hirapporti Gher segnale-rumore; (2) lunghezze d&#39;onda sintonizzabili di emissioni chemiluminescenti che vanno dal visibile al vicino infrarosso; e (3) functionalizable complessi chemiluminescenza che, quando combinato con le tecnologie linker e biomolecole che già esistono mirati, forniscono l&#39;accesso a intere biblioteche di sonde di imaging molecolare mirati 14. Questo studio prova di principio illustra la potenziale utilità dell&#39;imaging chemiluminescente nella cornice biomedica utilizzando un agente di imaging a base di rutenio. Le proprietà chemiluminescenti di questo composto sono ben studiati, con indagini risalenti alla metà del 1960 15. All&#39;attivazione chimica, l&#39;agente produce luce a circa 600 nm 16, che è adatto per scopi di imaging medicale. L&#39;energia di attivazione è fornita da una reazione redox che porta ad un eccitato allo stato che ha una durata di 650 ns in acqua 17 -folldovuto dalla generazione di fotoni su rilassamento di questo stato eccitato. Attraverso l&#39;uso di un nebulizzatore remota apposito, siamo stati in grado di rilevare il composto sia ex vivo e in vivo. I risultati degli esperimenti iniziali sono molto promettenti, suggerendo ulteriori indagini di questa tecnologia.

<table><tbody><tr><td>Parte in legno A (12,5 & volte; 2,5 & volte; 1,8 cm)</td><td>&nbsp; Woodcraft</td><td>131404</td><td>Tagliato da un foglio di compensato di betulla da 3/4" x 24" x 30"</td></tr><tr><td>Parte di legno B (12,7 &volte; 10,7 &volte; 1,8 cm)</td><td>Woodcraft</td><td>131404</td><td>Tagliato da un foglio di compensato di betulla da 3/4" x 24" x 30"</td></tr><tr><td>Parte di legno C (11 &volte; 2,5 &volte; 1,8 cm)</td><td>Woodcraft</td><td>131404</td><td>Tagliato da un 3/4" x 24" x 30& rdquo; foglio di compensato di betulla</td></tr><tr><td>Viti (4 & volte; 25 mm)</td><td>Screwfix</td><td>79939</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Face Values 3 oz mini spruzzatore</td><td>Letto, bagno e oltre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>asta in acciaio inossidabile (10 cm di acciaio da 1/16")</td><td>Deposito metalli Int. Inc.</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>Matita Classic HB</td><td>Papermate</td><td>58592</td><td></td></tr><tr><td>Graffetta</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>cavo per altoparlanti</td><td>RCA Inc.</td><td></td><td></td>AH1650SN</tr><tr><td>Batteria alcalina Energizer 9V</td><td>Energizer Holdings Inc.</td><td>EN22</td><td></td></tr><tr><td>Hitech HS-82MG Micro Servomotore, coppia di uscita 3,4 kg/cm @ 6V</td><td>Hitech RCD USA Inc.</td><td>32082S</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commenti</td></tr><tr><td>Fascette per cavi in plastica da 28 cm</td><td>General Electric Inc.</td><td>50725</td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>3M Inc.</td><td>3939</td><td></td></tr><tr><td>littleBits w1 filo</td><td>littleBits Inc.</td><td>w1 filo</td><td></td></tr><tr><td>littleBits p1 potenza</td><td>littleBits Inc.</td><td>p1 alimentazione</td><td></td></tr><tr><td>littleBits i2 interruttore a levetta</td><td>littleBits Inc.</td><td>i2 interruttore</td><td></td>a levetta</tr><tr><td>littleBits 011 servo</td><td>littleBits Inc.</td><td>011 servo</td><td></td></tr><tr><td>20 cm fascette in plastica Four</td><td>Star Plastics</td><td>71TIE8000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2&prime;-bipiridil)diclororutenio(II) esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 224758 <tr><td>Nitrato di ammonio cerio(IV)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PBS1</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td>L'acqua è stata purificata utilizzando un Milipore Mili-Q (R &ge; 18 M&Omega;)</td></tr><tr><td>Topi nudi femmina (di razza)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>1929</td><td>età 5 - 6 settimane</td></tr><tr><td>Ceppo C57BL/6J&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topi maschi NU/J at&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2019</td><td>età 6 - 8 settimane</td></tr><tr><td>Lettore di bioluminescenza IVIS 200</td><td>Caliper Live Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Image 4.2 software</td><td>Perkin-Elmer</td><td>128165</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>ThermoScientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

una tecnica innovativa per la generazione e observing chemiluminescenza in un ambiente biologico

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Le tecniche di imaging intraoperatorio hanno il potenziale per rendere gli interventi chirurgici più sicuri ed efficaci; per questi motivi, tali tecniche si stanno rapidamente spostando in sala operatoria. Qui, presentiamo un nuovo approccio che utilizza una tecnica non ancora esplorata per l'imaging intraoperatorio: l'imaging chemiluminescente. Questo metodo impiega un reporter chemiluminescente a base di rutenio insieme a un sistema di nebulizzazione personalizzato per produrre immagini ex vivo o in vivo con elevati rapporti segnale/rumore. Il reporter a base di rutenio produce luce in seguito all'esposizione a una soluzione ossidante acquosa e alla ri-riduzione all'interno del tessuto circostante. Questo metodo ci ha permesso di rilevare concentrazioni di reporter fino a 6,9 pmol/cm2. In questo lavoro, presentiamo una guida visiva ai nostri studi proof-of-concept in vivo che coinvolgono iniezioni sottocutanee ed endovenose nei topi. I risultati suggeriscono che questa tecnologia è un candidato promettente per ulteriori ricerche precliniche e potrebbe in definitiva diventare uno strumento utile in sala operatoria.

Il sistema nebulizer descritto nella sezione del protocollo 1 può essere costruito a partire da materiali facilmente disponibili a basso costo. Esso è destinato ad essere un inserto per remote trigger spruzzatura dell'agente riducente / ossidante all'interno un lettore bioluminescente (Figura 1). Il nostro design consente il funzionamento sicuro del nebulizzatore all'interno del lettore bioluminescenza a 14 cm di distanza dalla lente. Non sono state osservate appannament...

Questo protocollo descrive una nuova tecnica di imaging intraoperatorio che utilizza un complesso di rutenio come fonte di emissione di luce chemiluminescente, producendo così alti rapporti segnale-rumore durante l'imaging in vivo. L'imaging intraoperatorio è un campo in espansione che potrebbe rivoluzionare il modo in cui vengono eseguite le procedure chirurgiche.

Una tecnica innovativa per la generazione e Observing Chemiluminescenza in un ambiente biologico

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di offrire una nuova tecnica di imaging preclinico, interoperatorio e chemiluminescente in grado di fornire vantaggi rispetto alle tecniche ottiche esistenti in termini di rapporti segnale/rumore e limiti di rilevamento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave che non sono state accessibili dalle tradizionali tecniche di imaging ottico in molti campi legati alle scienze biologiche. I principali vantaggi di questa tecnica sono che ha un elevato rapporto segnale/rumore e che non richiede né luce né radiazioni istantanee.Quindi quello che abbiamo scoperto è che le implicazioni di questa tecnica si estendono davvero all'imaging interoperatorio di più stati patologici, incluso il cancro, a causa degli elevati rapporti segnale-rumore che questa tecnica ha da offrire. Poiché la luce incidente non è necessaria per questa tecnica, non ci sono problemi con l'assorbimento della luce incidente. Inoltre, è disponibile una grande cassetta degli attrezzi chimici per funzionalizzare la molecola centrale chemiluminescente.Per iniziare la procedura preparare soluzioni standard da 100 microlitri di cloruro di tris(bypiridina)rutenio(II)in acqua ad osmosi inversa. Quindi, combinare ogni standard con 100 microlitri di una soluzione da 25 millimolari di nitrato di cerio di ammonio in acqua ad osmosi inversa su un vetrino da microscopio. Aprire il software di imaging del lettore di bioluminescenza e fare clic su Inizializza.In modalità imaging, assicurarsi che la luminescenza e la fotografia siano selezionate e che la fluescenza sia deselezionata. Imposta il tempo di esposizione luminescente, il binning, f/stop e i parametri del filtro di emissione. Imposta il tempo di esposizione della foto, il binning e i parametri f/stop.Quindi impostare l'altezza del soggetto in base al campione da riprendere. Impostare il campo visivo su B per una distanza di 14 centimetri tra la telecamera e il tavolino di campionamento. Coprire il pavimento della camera di imaging del lettore di bioluminescenza nella fase di campionamento con carta da costruzione nera.Quindi posizionare il primo vetrino con la gocciolina di miscela standard sul tavolino del campione con la gocciolina centrata nel mirino della lightbox verde. Quindi, riempi il flacone spray da tre once di un nebulizzatore su misura con la soluzione 1:3 di trietilammina in una soluzione 50/50 di acqua ed etanolo. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nel tubo di aspirazione.Posizionare il gruppo nebulizzatore nella camera di imaging con l'ugello di spruzzatura rivolto verso la gocciolina da riprendere senza ostruire la visuale della gocciolina da parte della telecamera. Assicurarsi che l'interruttore di alimentazione e l'indicatore di alimentazione del nebulizzatore siano accesi, che l'interruttore a levetta magnetico sia spento e che i cavi del nebulizzatore di alimentazione e del telecomando non siano aggrovigliati. Copri i punti caldi come i segni sulla diapositiva con piccoli pezzi di carta da costruzione nera.Posizionare almeno 40 centimetri del cavo remoto del nebulizzatore nella camera di imaging. Chiudere delicatamente lo sportello della camera senza crimpare i cavi del nebulizzatore. Nel software dello strumento, fare clic su acquisisci, abilitare il salvataggio automatico e impostare il percorso del file di dati.Avviare la sequenza di imaging. Quando l'otturatore si apre con un clic udibile, premere tre volte l'interruttore del nebulizzatore per spruzzare tre raffiche di soluzione di trietilammina sul campione. Ripetere la procedura con ogni vetrino standard per determinare la concentrazione minima rilevabile dell'agente di imaging del rutenio.Per iniziare la procedura di imaging in vivo, preparare 100 microlitri di una soluzione contenente tra 8 e 33 nanomoli di cloruro di tris(bypiridina)rutenio(II)in soluzione salina tamponata con fosfato. Preparare una soluzione acquosa da 25 millimolari di nitrato di cerio di ammonio. Successivamente, iniettare per via endovenosa 100 microlitri dell'agente di imaging del rutenio nella vena caudale di topi sani.Sacrificare i topi 10 minuti dopo l'iniezione per asfissia da anidride carbonica. Rimuovere la pelle dal busto con un taglio a Y e quindi rimuovere l'arco costale per esporre il cuore e i polmoni. Tagliare un'uscita nell'atrio destro e iniettare 20 millilitri di PBS attraverso un ago calibro 24 nel ventricolo sinistro.Taglia la pelle della pancia per esporre il rene e il fegato. Se l'organo di interesse è il fegato, il rene o la milza fanno un taglio longitudinale visibile attraverso l'organo. Preparare una nuova sequenza di imaging nel software del lettore bioluminescente.Per l'imaging dell'intero addome, posizionare il topo nella camera di imaging con l'addome aperto rivolto verso la fotocamera e la testa rivolta verso la parte posteriore dello strumento. Centra l'organo di interesse nel mirino della lightbox verde. Lavare accuratamente il flacone spray e l'ugello dal gruppo nebulizzatore, quindi riempire il flacone con la soluzione di nitrato di cerio ammonio.Posizionare il nebulizzatore nella camera di imaging con l'ugello di spruzzatura diretto verso il sito di imaging. Assicurarsi che la fotocamera non sia ostruita, che i cavi non siano aggrovigliati e che almeno 40 centimetri del cavo remoto siano nella camera. Chiudere la camera e avviare la sequenza di imaging.Quando l'otturatore si apre con un clic, premere tre volte l'interruttore per spruzzare tre raffiche di agente ossidante sul sito di imaging. Dopo l'imaging, rimuovere il gruppo nebulizzatore e sciacquare accuratamente l'ugello di spruzzatura per evitare la cristallizzazione del nitrato di cerio di ammonio. Per il successivo imaging e quantificazione dei singoli organi, rimuovere il topo dallo strumento e asportare gli organi interni partendo dalla cavità corporea aperta.Tagliare la pelle della zampa posteriore per asportare campioni di tessuto muscolare. Se l'organo di interesse è il fegato, il rene o la milza tagliare l'organo a metà longitudinalmente. Quindi posiziona l'organo su una capsula di Petri o su un pezzo di carta da costruzione nera.Immagina ogni organo allo stesso modo dell'intero animale, risciacquando l'ugello di spruzzatura dopo ogni sequenza. In questa procedura, ai topi è stato iniettato un agente di imaging a base di rutenio e il tessuto di interesse è stato spruzzato con un ossidante per indurre la chemiluminescenza. In queste condizioni, la concentrazione minima rilevabile dell'agente di imaging è stata determinata in 6,9 picomoli per centimetro quadrato.Le immagini in chemiluminescenza in luce bianca degli organi di interesse sono state ottenute con un lettore di bioluminescenza. Il segnale di chemiluminescenza è stato osservato prevalentemente nei reni dopo l'iniezione endovenosa, indicando l'eliminazione renale del catione tris(bypiridina)rutenio (II) idrofilo. Il rapporto segnale/rumore dell'agente di imaging rispetto al solo PBS era di 27:1 nei reni e di 21:1 nel fegato.I linfonodi poplitei di topo sono stati valutati anche con un'iniezione sottocutanea di una soluzione più concentrata dell'agente di imaging a base di rutenio. I linfonodi contenenti l'agente di imaging hanno mostrato una radiosità significativamente maggiore rispetto ai linfonodi contenenti solo PBS. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di escludere la luce ambientale e di evitare la contaminazione con il rutenio tris bpy. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging biomolecolare per esplorare stati patologici come il cancro nei topi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su questioni che non erano accessibili con le tradizionali tecniche di imaging ottico, qualsiasi domanda che potrebbe essere indagata con le tecniche tradizionali può potenzialmente essere affrontata con la chemiluminescenza.

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