Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension

L'obiettivo generale di questo saggio basato sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) in cellule vive è valutare le conformazioni del recettore accoppiato a proteine G, o GPCR, selettive per le proteine G in diverse condizioni di agonisti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei GPCR riguardo alle interazioni dei GPCR con diversi effettori e l'effetto di diversi farmaci sulla conformazione del recettore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i sensori sono modulari e possono essere facilmente riprogettati per diverse combinazioni di GPCR e peptidi G alfa, inclusi i sottounità G alfa complete.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla selezione delle proteine G e sulla risposta a diversi ligandi, può essere altresì applicato per esplorare le conseguenze fisiologiche dell'attivazione differenziale delle proteine G. Prima di iniziare la procedura, coltivare le cellule di interesse in un mezzo completo a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al cinque percento di anidride carbonica fino al raggiungimento della confluenza.

Successivamente, staccare le cellule con tripsina e passare le colture a otto volte 10 alla quinta cellule per cellula in due millimetri di mezzo in piatti da coltura tessutale trattati da sei pozzetti per una coltura della durata di sedici-20 ore. Dopo 16-20 ore, preparare una reazione di trasfezione per ogni pozzetto quando le cellule si sono attaccate alle piastre all'interno di una cappa a sicurezza biologica e lasciare equilibrare le miscele di reagenti per 15-30 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere una reazione per ogni coltura cellulare, goccia a goccia, in tutto il pozzetto.

Agitare delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione omogenea del reagente in tutte le colture. Quindi reinserire la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 20 ore, analizzare le colture per l'espressione proteica della membrana plasmatica e valutare lo stato di salute delle cellule.

Se si osserva un'internalizzazione significativa della proteina, monitorare la trasfezione fino a quando non viene rilevata un'espressione significativa sulla membrana plasmatica. Valutare il livello di espressione della proteina è fondamentale per un'ottimale impostazione sperimentale. Se le cellule sono state trasfettate in modo inefficiente o se l'espressione della proteina è troppo bassa, attendere prima di raccogliere le cellule.

In caso contrario, il segnale fluorescente potrebbe non essere adeguato per l'analisi. Quando le cellule sono pronte per essere raccolte, trasferirle nell'armadio a sicurezza biologica e rimuovere delicatamente un millilitro di mezzo. Utilizzando una pipetta P1000, risospendere le cellule in un millilitro di mezzo residuo per pozzetto e trasferire le sospensioni cellulari in singole provette microcentrifuga da 1,5 millilitro.

Contare le cellule e formare il pellet delle cellule mediante centrifugazione. Rimuovere il mezzo dal pellet cellulare. Sospendere delicatamente il soprannatante in un millilitro di tampone cellulare a 37 gradi Celsius e ripetere la centrifugazione.

Risospendere il pellet a una concentrazione di quattro per dieci alla sesta cellula per millilitro in tampone cellulare fresco dopo la seconda centrifugazione. Successivamente, aggiungere 90 microlitri di cellule di controllo in una cuvetta ed acquisire lo spettro FRET di controllo. Dopo aver raccolto da tre a cinque spettri di controllo ripetuti utilizzando 90 microlitri freschi di cellule per ogni misurazione, ripetere i passaggi di risospensione, centrifugazione e lavaggio per le cellule trasfettate.

Aliquotare 90 microlitri di cellule trasfettate in ciascun tubo da 500 microlitri nei contenitori da due a sei e da otto a 12 posizionati su un blocco termico, risospendendo delicatamente le cellule tra un'aliquota e l'altra. Una volta trasferite tutte le cellule, aggiungere 10 microlitri di tampone senza farmaco ai tubi da due a sei per i campioni del gruppo non trattato. Successivamente, aggiungere 10 microlitri della soluzione del farmaco a una concentrazione di un millimolare al tubo otto.

Avviare un timer per un conto alla rovescia di 10 minuti e utilizzare una pipetta P200 per mescolare delicatamente il contenuto del tubo. Chiudere il tubo dopo il mescolamento e riporlo nel blocco riscaldante. Successivamente, prendere immediatamente il secondo tubo.

Mescolare delicatamente il contenuto con una nuova punta. Aggiungere 90 microlitri della sospensione di cellule trasfettate nella cuvetta della condizione non trattata e posizionare la cuvetta nel fluorimetro. Acquisire lo spettro FRET del campione utilizzando gli stessi parametri impiegati per gli spettri di controllo.

A nove minuti e 10 secondi, aggiungere 10 microlitri della soluzione del farmaco da un millimolare al tubo nove. Mescolare delicatamente il contenuto del tubo e riposizionarlo sul blocco riscaldante. Successivamente, prendere immediatamente il tubo tre e mescolare e misurare il contenuto della cuvetta come appena dimostrato per il tubo due.

A cinque minuti e dieci secondi, mescolare delicatamente il tubo otto con una pipetta P200. Aggiungere 90 microlitri della sospensione cellulare in una cuvetta separata per la misurazione del campione trattato con il farmaco e acquisire lo spettro FRET per il campione in condizioni di trattamento farmacologico. Dopo aver acquisito tutti gli spettri, salvare i file del progetto.

Sciacquare accuratamente le cuvette con acqua ultrapura e rifornire i tubi per la condizione successiva. In questa immagine è mostrato un monostrato cellulare omogeneo, ottimale per la semina in piastre a sei pozzetti e per la trasfezione. Tuttavia, queste cellule che crescono in modelli raggruppati, dando origine a forme dendritiche, non sono raccomandate per una semina uniforme e per un'analisi accurata dell'espressione proteica o delle misurazioni FRET.

Le condizioni di trasfezione possono essere ottimizzate anche per ottenere un'espressione riproducibile. Una volta raccolti tutti i dati e inseriti in un file CSV per l'analisi, i risultati ottenuti saranno simili a questi spettri rappresentativi di FRET grezzo e medi normalizzati. Tutti gli spettri di FRET grezzi di questo esperimento rappresentativo mostrano un segnale regolare e un rapporto segnale-rumore sufficiente, consentendo un'analisi dati coerente con un picco minimo dell'acqua proveniente dal campione.

Quando i dati vengono normalizzati a 475 nanometri, i conteggi al secondo di questo valore sono impostati a 1,0 e la variazione significativa nella lettura a 525 nanometri tra i campioni trattati e non trattati diventa evidente. Se l'espressione proteica è bassa o se vi è un'efficienza di trasfezione scarsa oppure una bassa densità cellulare nella cuvetta durante la lettura della fluorescenza, i dati grezzi potrebbero risultare rumorosi, causando problemi nella sottrazione del fondo e nella normalizzazione, con conseguente mancato allineamento degli spettri e impossibilità di analizzarli. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 25 minuti se eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di essere delicati durante la manipolazione delle cellule in tutte le fasi dell'esperimento. Dopo aver seguito questa procedura, la tecnica può essere ampliata per testare diversi sensori FRET per recettori, diversi farmaci e effettori e diversi tipi cellulari. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha contribuito al campo dei recettori accoppiati alle proteine G (GPCR), in cui studi recenti che utilizzano questi sensori hanno chiarito il meccanismo molecolare della selezione delle proteine G.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare specifiche conformazioni dei recettori accoppiati a proteine G utilizzando un saggio di misurazione basato su un costrutto FRET ancorato in cellule vive. Non dimenticare che lavorare con colture cellulari di mammifero e con determinati farmaci sperimentali può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare l'apposita attrezzatura di protezione individuale, durante l'esecuzione di questa procedura.