Name: Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Scopri il saggio FRET in cellule vive per valutare le conformazioni selettive dei recettori GPCR con diversi agonisti. Questo metodo modulare aiuta a studiare le interazioni recettore-effettore e gli effetti dei farmaci.

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RUM è stato finanziato dalla Compagnia americano Heart Association Pre-dottorato (14PRE18560010). La ricerca è stata finanziata dalla American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14270009) e NIH (1DP2 CA186752-01 &amp; 1-R01-GM-105.646-01-A1) alla SS

1. Preparazione del DNA <ol><li> Sensore di design costruisce utilizzando uno schema di clonazione modulare. Si prega di fare riferimento al design del sensore β 2 -AR descritto in precedenza 1. </li><li> Preparare DNA secondo il protocollo kit miniprep commerciale ed eluire in 2 soluzione mM Tris-HCl, pH 8, a concentrazione ≥ 750 ng / ml, A 260 / A 280 di 1,7-1,9, A 260 / A 230 di 2,0-2,29. </li></ol> 2. colture cellulari Preparazione <ol><li> cellule Culture HEK-293T-Flp-n in DMEM contenente 4,5 g / L D-glucosio, supplementato con 10% FBS (inattivato con il calore) (v / v), 1% integratore di L-glutammina, 20 mM HEPES, pH 7,5 a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2. Maneggiare le cellule in cappa biologica per le fasi successive. </li><li> Consentono alle cellule di crescere ad un monostrato confluenti prima passaging in piatti a sei pozzetti. Tempo per raggiungere confluenza dipende dalla densità di placcatura iniziale. Utilizzare i piatti chevenire a confluenza entro 1 - 2 giorni di placcatura per sei-bene placcatura. Un piatto confluenti 10 centimetri tessuto coltura trattata ha densità cellulare di circa 4 x 10 6 cellule / ml. Vedere la Figura 1 per un&#39;immagine della crescita coltura cellulare. </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS, e trypsinize con 0,25% tripsina (vedi la discussione, comma 2). Tavola 8 x 10 5 cellule / pozzetto in 2 ml di media nel tessuto della cultura trattati con sei piatti bene e lasciare ad aderire per 16 - 20 ore. </li></ol> 3. Condizioni Transfection <ol><li> Stagger trasfezioni per costrutti che potrebbero richiedere diverse quantità di tempo per raggiungere l&#39;espressione ottimale (tra i 20 - 36 ore). Sincronizzare le condizioni per un tempo esperimento unico. hanno anche un controllo untransfected bene a densità cellulare equivalente da utilizzare per il rumore di fondo e la dispersione sottrazione durante l&#39;analisi. </li><li> Portare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente: i media siero ridotti, il DNA, il reagente di trasfezione. </li><li> In uncappa biologica combinare reagenti in una provetta sterile, nel seguente ordine: mescolare 2 DNA mg con 100 pl ridotti mezzi di siero. Spike 6 ml di trasfezione reagente in media mix / DNA senza la superficie di miscela o il lato del tubo toccare. Impostare una reazione trasfezione per pozzetto. condizioni di trasfezione possono essere ottimizzate (1-4 mg di DNA, 3 - 6 ml di trasfezione reagente) per raggiungere livelli di espressione coerenti. Vedere la Tabella 1 per rapporti più ottimizzato. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente in cappuccio di sicurezza biologica per il 15 - 30 min. Non usare reazione se lasciato a incubare per più di 30 min. </li><li> Aggiungere reazione alle cellule in un modo goccia a goccia attraverso bene e agitare delicatamente sei pozzetti per garantire la completa miscelazione. Aggiungere una reazione per pozzetto. </li><li> Dopo 20 ore di espressione, monitor di fluorescenza utilizzando colture di tessuti microscopio a fluorescenza. Valutare l&#39;espressione popolazione con 10 volte la localizzazione oggettiva e proteine ​​in una cellula a 40X. observe per l&#39;espressione della proteina in membrana plasmatica (PM). Se si nota sostanziale interiorizzazione, monitorare trasfezione fino a quando non viene rilevato espressione significativa al PM. </li></ol> 4. reagente agricole per la preparazione <ol><li> Preparare 100 titoli di droga mm e conservare a -80 ° C: bitartrato isoproterenolo (100 mm in dH 2 O contenente 300 mm acido ascorbico). Fare sul ghiaccio / in camera fredda, e flash-freeze immediatamente. Aliquote possono essere fatte e utilizzati fino ad un anno. </li><li> Preparare cellulare Buffer (~ 2 ml / condizione) e conservare in un bagno d&#39;acqua C 37 °. Fare fresco ogni giorno. Tabella di riferimento 2 per Buffer costituenti cellulari. </li><li> Preparare Drug Buffer (10 ml) e conservare a temperatura ambiente. Tabella di riferimento 2 per i componenti della droga Buffer. </li><li> Lavaggio acido cuvette con HCI concentrato. Neutralizzare con una base debole (1 M KOH), e lavare accuratamente le provette con dH 2 O. </li><li> Preparare stazione di lavoro intorno fluorimetro con diversiscatole da 10, 200 e 1.000 ml punte per pipette, un timer impostato con 10 minuti di conto alla rovescia, una linea di vuoto raggiungibile con suggerimenti per la pulizia cuvette, delicate salviettine attività, e spruzzatore con ultrapura H 2 O. </li><li> Riscaldare bagno d&#39;acqua esterna per fluorimetro e il calore del blocco a 37 ° C. </li><li> Accendere fluorimetro; impostare il programma di raccolta di fluorescenza per la raccolta dei CFP all&#39;eccitazione 430 nm, banda passante 8 nm; gamma di emissione 450 nm - 600 nm, banda passante 4 nm. Per la raccolta YFP solo come controllo del sensore (vedi Discussione) set di eccitazione a 490 nm, banda passante 8 nm, emissione gamma 500 - 600 nm, banda passante 4 nm. impostazioni di raccolta della PCP verranno utilizzati per acquisire uno spettro FRET in questo esperimento. </li><li> Posizionare dodici 1,5 ml provette da microcentrifuga in blocco di calore come mostrato nella figura 2 qui sotto. Questi tubi sono supporti per tubi aliquote di cellule (provette da microcentrifuga 500 microlitri.) Mettere un piccolo pezzo di tessuto in supporti 1 e 7 per attutire le cuvette messi qui. Nota: utilizzare cuvette separati per la condizione non trattata e la condizione farmaco per prevenire la contaminazione incrociata. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Figura 2. Microcentrifuga tubo Set Up e posizione di riferimento in Heat Block Cuvette per i campioni non trattati è in posizione 1.; tubi aliquote cellulare sono nelle posizioni 2 - 6. Cuvette per i campioni trattati con farmaci è in posizione 7; tubi aliquote cellulare sono in posizioni 8 - 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="9"><li> Riempire i titolari di 2 - 6 e 8 - 12 con ~ 750 ml di acqua per creare un mini 37 ° C bagnomaria. </li><li> Mettere dieci 500 microprovette microlitri per aliquote di cellule in bagni di mini-acqua (supporti 2 - 6, 8 - 12). Ogni tubo sarà una ripetizione individuale della condizione (5 untreated, 5 droga trattata). </li><li> Monitorare le cellule per l&#39;espressione (vedi punto 3.6). </li></ol> 5. Esperimento &amp; Data Collection <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> Figura 3. Sperimentale schematica. Una guida dettagliata passo-saggio per set up sperimentale e l&#39;esecuzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Riferimento Figura 3 per schematica sperimentale. Quando le cellule sono pronte per essere raccolte, sulla base di espressione della proteina rilevata con il microscopio a fluorescenza (vedi la discussione, il paragrafo 4): in cappuccio di sicurezza biologica, rimuovere delicatamente ~ 1 ml di media, Risospendere le cellule in loro cultura con un P 1.000 e trasferire risospensione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Nota: Evitare l&#39;uso di tripsina in quanto può digerire l&#39;N-terminale e /o vincolante tasca del sensore GPCR. </li><li> Contare le cellule per garantire la corretta densità cellulare in risospensione. Ottimizzare il volume risospensione per 4 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Spin cellule oscillante secchio centrifuga a temperatura ambiente, 290 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule in 1 ml cellulare Buffer (conservato a 37 ° C) e ripetere il punto 5.3. Durante il secondo giro, raccogliere 100 mM di droga stock aliquota da -80 ° C. Fai la diluizione 1: 100 in Drug tampone per 1 mM magazzino di lavoro e mantenere a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la seconda centrifugazione, rimuovere surnatante e cellule delicatamente risospendere in 1 ml di tampone cellulare (4 x 10 6 cellule / ml). Misura OD 600 del campione nello spettrofotometro usando 1 ml di cellule e 1 ml di tampone cellulare come bianco. Erogare le cellule in una provetta di plastica usa e getta e ritorno in una provetta immediatamente dopo spettrofotometria. </li><li> Per un controllo cel untransfectedl condizione di spettro, risospendere delicatamente le cellule untransfected in 1 ml cellulare tampone con P 1.000 pipetta, aggiungere 90 ml di cellule di Cuvette e acquisire spettro FRET a eccitazione 430 nm, banda passante 8 nm, emissione 450-600 nm, banda passante 4 nm. Raccogliere 3 - 5 spettri di ripetizione con freschi 90 ml di cellule. Mantenere magazzino di cellule a 37 ° C tra le specifiche, risospendere delicatamente con P 1.000 tra ciascuna aliquota del campione, e risciacquare provetta con ultrapura H 2 O tra i campioni. </li><li> Per le condizioni sperimentali, aliquote di 90 microlitri di cellule trasfettate per ciascuno dei 500 tubi microlitri in supporti 2 - 6, 8 - 12 nel blocco termico. Risospendere delicatamente magazzino di cellule con P 1.000 pipetta tra ciascuna aliquota. </li><li> Dopo che le cellule sono aliquotati, aggiungere 10 ml di tampone di droga ai tubi 2-6 per non trattati condizione campioni. </li><li> Iniziare esperimento con l&#39;aggiunta di 10 ml di soluzione di 1 farmaco mm nel tubo 8, avviare il timer per il conto alla rovescia da 10 min, e mescolare delicatamente tubo con P200 pipetta. Chiudi tubo e ritorno a 37° C blocco di calore. </li><li> Immediatamente raccogliere tubo 2, mescolare delicatamente con P200 (utilizzare una nuova punta), aggiungere 90 ml di sospensione cellulare per non trattata condizioni cuvetta, e il luogo in fluorimetro. </li><li> Acquisire spettro FRET a eccitazione 430 nm, banda passante 8 nm, emissione 450-600 nm, banda passante 4 nm. </li><li> Alle 9 min - 10 sec, spike tubo 9 con 10 ml di soluzione di 1 farmaco mM, mescolare delicatamente con un P200 (utilizzare una nuova punta), ed il tubo per riscaldare blocco tornare. </li><li> Ripetere i passaggi 5,10-5,11 con tubo 3 e 5.12 con il tubo 10. </li><li> Ripetere i passaggi 5,10-5,13 ad intervalli di 1 minuto (8:10, 7:10, ecc) fino a quando gli spettri sono raccolti per tutte le condizioni campioni non trattati, e di droga è stato aggiunto a tutti i campioni di condizione di droga. Utilizzare una punta fresca per ogni passo pipetta per evitare la contaminazione incrociata. </li><li> A 5 min - 10 sec, iniziare a mescolare tubo 8 (condizione di droga) delicatamente con P200 pipetta, aggiungere 90 ml di sospensione cellulare per cuvetta separata per il campione di droga trattati e il luogo in fluorimetro. </li><li> acquisire Fspettro RET (vedere il punto 5.11 per le impostazioni). </li><li> Ripetere i passaggi 5,15-5,16 ad intervalli di 1 minuto (4:10, 3:10, ecc) per restanti condizioni di droga campioni (tubi 9 - 12). </li><li> Dopo esperimento si conclude, salvare i file di progetto, lavare accuratamente le provette con ultrapura H 2 O, e ri-Stock tubi per il prossimo condizione. Fare attenzione per evitare la contaminazione incrociata nella fase di lavaggio. Cambiare la punta sulla bottiglia H 2 O, nonché sulla linea del vuoto tra lavaggi. </li></ol> Analisi 6. Dati <ol><li> Salvare e file di dati di esportazione in SPC formato da utilizzare per l&#39;analisi. programmi di analisi sono disponibili per il download dal sito web pubblicazione Sivaramakrishnan Lab. </li><li> Creare file di percorso per il software di analisi che includono i programmi di analisi (v9, V15), file di esempi untransfected (vedere il punto 5.6 per la raccolta delle cellule spettro untransfected) file, file di dati di output e valori separati da virgola (CSV) per l&#39;immissione dei dati. </li><li> Inserire le seguenti informazioniin file CSV (vedi esempio nella tabella 3) e designa rispettive condizioni per ogni campione, tra cui: Il nome del file - singoli file grafico SPC Receptor - designato quale costrutto GPCR è stato testato (ad esempio, Β2) Legante - designato quale peptide variante del costrutto è stato testato (ad esempio, S) Agonist - designare non trattati (N) o le condizioni trattati con farmaci (D) Directory - la cartella percorso in cui vengono salvati i file SPC, di solito organizzati per data OD - registrato densità ottica del campione da spettrofotometro </li><li> Inserisci i nomi dei file per i campioni untransfected (passo 5,6) per sottrarre buffer e rumore di scattering da campioni. </li><li> Entra condizioni in programma di analisi. </li><li> Eseguire programmi di analizzare campioni all&#39;interno dei singoli condizioni (V9) e le varie patologie (v15). </li><li> Escludere file di esempio, che sono valori anomali evidenti nel set di dati, o regolare per la sottrazione aumentando o diminuendo il valore OD di indivifile doppi. </li><li> Esportare i dati in file di output per l&#39;accesso ai calcolato FRET rapporti (525 nm / 475 nm). </li><li> Calcolare ΔFRET sottraendo il rapporto medio FRET per la condizione trattata dai singoli rapporti di FRET per le condizioni di trattamento (farmaci). </li></ol>

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<li>Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+control+of+protein+interaction+using+a+modular+ER%2FK+%CE%B1-helix+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.

La gamma dinamica stretta di misurazioni FRET in questo sistema accentua la necessità di controllo di qualità sensibile in ogni fase di questo protocollo. I passi più importanti per assicurare un esperimento riuscito FRET sono 1) la coltura delle cellule, 2) trasfezione 3) l&#39;espressione della proteina e 4) puntuale, preciso coordinamento durante l&#39;esecuzione del test. la salute delle cellule e la qualità di manutenzione / placcatura possono avere un impatto significativo sul rumore r...

recettori G-proteina-accoppiati (GPCR) sono recettori sette transmembrana. Il genoma umano contiene solo circa 800 geni codificanti per GPCR, attivati ​​da una varietà di ligandi compresi luce, odoranti, ormoni, peptidi, farmaci e altre piccole molecole. Quasi il 30% di tutti i farmaci attualmente sul GPCR bersaglio mercato perché svolgono un ruolo importante in molti stati di malattia 2. Nonostante decenni di intenso lavoro svolto su questa famiglia di recettori, rimangono significative questioni in sospeso in materia, in particolare per quanto riguarda i meccanismi molecolari che guidano le interazioni GPCR-effettrici. Ad oggi, solo una struttura cristallina ad alta risoluzione è stato pubblicato, permettono di approfondire l&#39;interazione tra il recettore β 2 adrenergico (β 2 -AR) e la proteina Gs 3. Insieme alla vasta ricerca nel corso degli ultimi tre decenni, si ribadisce una specifica componente strutturale che è fondamentale in questointerazione: la subunità Gα C-terminale. Questa struttura è importante sia per l&#39;attivazione della proteina G dalla selezione proteine ​​GPCR 4 e G 5-6. Quindi, il Gα C-terminale fornisce un collegamento cruciale tra la stimolazione del ligando GPCR e l&#39;attivazione della proteina G selettivo. La ricerca negli ultimi dieci anni suggerisce che i GPCR popolano un vasto paesaggio conformazionale, con ligando vincolante stabilizzazione sottoinsiemi di conformazioni GPCR. Mentre sono disponibili per esaminare il paesaggio conformazionale GPCR diverse tecniche, tra cui la cristallografia, NMR e spettroscopia di fluorescenza, e spettrometria di massa, vi è una scarsità di approcci per spiegare il loro significato funzionale nella selezione effettore 7. Qui, descriviamo un Fӧrster trasferimento di energia di risonanza (FRET) approccio basata su per rilevare proteine ​​G-selettivo conformazioni GPCR. FRET basa sulla prossimità e orientamento parallelo di due fluorofori con sovrapposizione di emissione (donatore) unND eccitazione (accettore) spettri 8. Come fluorofori donatore e accettore avvicinano insieme come risultato di una variazione conformazionale nella proteina o un&#39;interazione proteina-proteina, il FRET tra loro aumenta, e può essere misurata usando una serie di metodi 8. Biosensori FRET-based sono stati impiegati ampiamente nel campo GPCR 9. Essi sono stati utilizzati per sondare cambiamenti conformazione del GPCR inserendo donatore e accettore nel terzo ciclo intracellulare e GPCR C-terminale; I sensori sono stati progettati per sondare GPCR e le interazioni effettrici etichettando separatamente i GPCR e effettrici (proteine ​​G subunità / arrestine) con un paio FRET 10; alcuni sensori rilevano anche i cambiamenti conformazionali nella proteina G 11. Questi biosensori hanno permesso il campo per chiedere una moltitudine di questioni in sospeso, tra cui i cambiamenti conformazionali nella GPCR e effettori, cinetiche di interazione GPCR-effettrici e ligandi allosterici 12. Il nostro gruppoera particolarmente interessato a creare un biosensore in grado di rilevare G specifiche proteine ​​conformazioni GPCR in condizioni di agonisti-driven. Questo biosensore si basa su una tecnologia sviluppata di recente nominato SPASM (sistematica di proteine ​​affinità la forza di modulazione) 13. SPASM coinvolge tethering interagire domini proteici usando un / K linker ER, che controlla le loro concentrazioni efficaci. Accanto al linker con un paio FRET di fluorofori crea uno strumento che può segnalare lo stato dell&#39;interazione tra proteine ​​12. In precedenza 1 il modulo SPASM è stato utilizzato per legare la Gα C-terminale di un GPCR e monitorare le loro interazioni con fluorofori FRET, mCitrine (di cui al presente protocollo da parte sua variante comunemente noto, giallo fluorescente delle proteine ​​(YFP), di eccitazione / picco di emissione a 490/525 nm) e mCerulean (di cui al presente protocollo per la sua comunemente noto variante Cyan Fluorescent Protein (PCP), di eccitazione / picco di emissione 430/475 nm). Da N- al C-terminale, tla sua geneticamente codificato singolo polipeptide contiene: un full length GPCR, FRET accettore (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker, FRET donatore (mCerulean / PCP), e il peptide Gα C-terminale. In questo studio, i sensori sono abbreviati come GPCR-linker lunghezza Gα peptide. Tutti i componenti sono separati da una non strutturato (Gly-Ser-Gly) 4 linker che permette la rotazione libera di ciascun dominio. La caratterizzazione dettagliata di tali sensori è stato precedentemente effettuata utilizzando due GPCR prototipo: β 2 -AR e opsin 1. Questo sensore è transientemente trasfettato in cellule HEK-293T e fluorimetro basato vivo esperimenti cellulari misura spettri di fluorescenza della coppia FRET in unità arbitrarie di conteggi al secondo (CPS) in presenza o assenza di ligando. Queste misurazioni vengono utilizzati per calcolare un rapporto FRET tra i fluorofori (YFP max / CFP max). Un cambiamento di FRET (ΔFRET) viene calcolato sottraendo il rapporto medio FRETcampioni non trattati dal rapporto di FRET di campioni ligando trattati. ΔFRET può essere paragonato attraverso costrutti (β 2 -AR-10 nm-Gαs peptide contro beta2-AR-10 nm-no peptide). Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di esprimere questi sensori in cellule HEK-293T dal vivo, monitoriamo la loro espressione, e la messa a punto, l&#39;esecuzione e l&#39;analisi delle cellule vive fluorimetro a base Fret misura per non trattati rispetto a condizioni trattati con farmaci. Anche se questo protocollo è specifico per il sensore di peptide β 2 -AR-10 nm-Gαs trattati con 100 micron isoproterenolo bitartrato, può essere ottimizzato per diverse coppie GPCR-Gα e leganti.

<table><tbody><tr><td>Sensore di peptidi B2-AR-10 nm-Gas</td><td>Addgene</td><td>47438</td><td>Kit</td></tr> <tr><td>di miniprep plasmidico</td> https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/ <td>GeneJET Fermentas/Fisher Sci</td><td>FERK0503</td><td>Eluire in 2 mM tampone di eluizione Tris</td></tr><tr><td>Cellule HEK-293T-Flp-n</td><td>Life Technologies</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM- alto glucosio</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Caldo in&nbsp; 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>FBS, certificato, inattivato a caldo, di origine statunitense</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning MT25060CL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Terreni sierici ridotti; Portare a RT prima dell'uso</td></tr><tr><td>XtremeGene HP trasfezione reagenet</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Altamente raccomandato per la sua consistenza. Portare a RT prima dell'uso</td></tr><tr><td>FluoroMax 4</td><td>Horiba</td> Utilizzare con il <td></td><td>software FluorEssence V3.8</td></tr><tr><td>cuvetta al quarzo con percorso di 3 mm</td><td>Starna</td><td>NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td><td>Potrebbe richiedere un supporto/adattatore per cuvette per l'uso in Fluorimetro, disponibile da Starna</td></tr><tr><td>Sc100-S3 Pompa a bagnomaria a circolazione riscaldata</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-826</td><td>Caldo a 37 &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Thermomixer Heat Block</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>Caldo a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura priva di DNA/RNAsi</td><td>Life Technologies 10977015</td><td></td><td>Utilizzare a RT</td></tr><tr><td>D(+)-glucosio, anidro</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina dal polmone bovino</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina emisolfato</td><td>EMD</td><td>10-897</td><td></td></tr><tr><td>acido L-ascorbico, grado reagente</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>(-)- isoproterenolo (+)-bitartrato</td><td>Sigma</td><td>I2760</td><td>Utilizzare aliquote fresche ad ogni esperimento</td></tr></tbody></table>

conformazioni gpcr g di proteine-selettivi misurata utilizzando fret sensori in un fluorometer assay live cell suspension

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Fӧrster trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di studi sono diventati sempre più comuni nelle indagini di segnalazione GPCR. Il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato un sensore intra-molecolare FRET per rilevare l&#39;interazione tra subunità Gα e GPCR in cellule live che seguono la stimolazione agonista. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo per rilevare i cambiamenti nella FRET tra il β 2 del recettore adrenergico ed il Gαs C-terminale del peptide in seguito al trattamento con 100 micron isoproterenolo cloridrato come precedentemente caratterizzati 1. Il nostro sensore FRET è un singolo polipeptide che consiste in serie di un GPCR full-length, un fluoroforo FRET accettore (mCitrine), un ER / K SPASM (sistematica di proteine ​​affinità la forza di modulazione) linker, un fluoroforo FRET donatore (mCerulean), e un Gα C peptide -Terminal. Questo protocollo sarà la preparazione delle cellule dettaglio, le condizioni di trasfezione, installazione di apparecchiature, l&#39;esecuzione del test, e analisi dei dati. Questo disegno sperimentale rileva piccolo changes in FRET indicativi di interazioni proteina-proteina, e può anche essere utilizzato per confrontare la forza di interazione tra ligandi e abbinamenti di proteine ​​GPCR-G. Per migliorare il rapporto segnale-rumore nelle nostre misurazioni, questo protocollo richiede precisione accresciuto in tutte le fasi, ed è presentato qui per consentire l&#39;esecuzione riproducibile.

Uno schema generalizzato dell&#39;esperimento allestimento e l&#39;esecuzione è illustrato dalla Figura 3. Per rilevare un cambiamento FRET nella gamma dinamica stretta del sensore, è fondamentale per rispettare le sfumature di sistema da rispettare. Qualità cellulare è indispensabile per l&#39;espressione della proteina e coerenza campionamento. Figura 1 Caratteristiche immagini di cellule coltivate crescono in un monostrato coerente (10X) che è ottimale pe...

Semplici metodi per rilevare l'attivazione selettiva delle proteine G da parte dei recettori accoppiati a proteine G rimangono una sfida eccezionale nella segnalazione cellulare. Qui, i biosensori per il trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sono stati sviluppati legando a coppie un GPCR a peptidi proteici G per sondare i cambiamenti conformazionali a concentrazioni controllate in cellule vive.

Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

L'obiettivo generale di questo saggio basato sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) in cellule vive è valutare le conformazioni del recettore accoppiato a proteine G, o GPCR, selettive per le proteine G in diverse condizioni di agonisti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei GPCR riguardo alle interazioni dei GPCR con diversi effettori e l'effetto di diversi farmaci sulla conformazione del recettore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i sensori sono modulari e possono essere facilmente riprogettati per diverse combinazioni di GPCR e peptidi G alfa, inclusi i sottounità G alfa complete.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla selezione delle proteine G e sulla risposta a diversi ligandi, può essere altresì applicato per esplorare le conseguenze fisiologiche dell'attivazione differenziale delle proteine G. Prima di iniziare la procedura, coltivare le cellule di interesse in un mezzo completo a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al cinque percento di anidride carbonica fino al raggiungimento della confluenza.Successivamente, staccare le cellule con tripsina e passare le colture a otto volte 10 alla quinta cellule per cellula in due millimetri di mezzo in piatti da coltura tessutale trattati da sei pozzetti per una coltura della durata di sedici-20 ore. Dopo 16-20 ore, preparare una reazione di trasfezione per ogni pozzetto quando le cellule si sono attaccate alle piastre all'interno di una cappa a sicurezza biologica e lasciare equilibrare le miscele di reagenti per 15-30 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere una reazione per ogni coltura cellulare, goccia a goccia, in tutto il pozzetto.Agitare delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione omogenea del reagente in tutte le colture. Quindi reinserire la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 20 ore, analizzare le colture per l'espressione proteica della membrana plasmatica e valutare lo stato di salute delle cellule.Se si osserva un'internalizzazione significativa della proteina, monitorare la trasfezione fino a quando non viene rilevata un'espressione significativa sulla membrana plasmatica. Valutare il livello di espressione della proteina è fondamentale per un'ottimale impostazione sperimentale. Se le cellule sono state trasfettate in modo inefficiente o se l'espressione della proteina è troppo bassa, attendere prima di raccogliere le cellule.In caso contrario, il segnale fluorescente potrebbe non essere adeguato per l'analisi. Quando le cellule sono pronte per essere raccolte, trasferirle nell'armadio a sicurezza biologica e rimuovere delicatamente un millilitro di mezzo. Utilizzando una pipetta P1000, risospendere le cellule in un millilitro di mezzo residuo per pozzetto e trasferire le sospensioni cellulari in singole provette microcentrifuga da 1,5 millilitro.Contare le cellule e formare il pellet delle cellule mediante centrifugazione. Rimuovere il mezzo dal pellet cellulare. Sospendere delicatamente il soprannatante in un millilitro di tampone cellulare a 37 gradi Celsius e ripetere la centrifugazione.Risospendere il pellet a una concentrazione di quattro per dieci alla sesta cellula per millilitro in tampone cellulare fresco dopo la seconda centrifugazione. Successivamente, aggiungere 90 microlitri di cellule di controllo in una cuvetta ed acquisire lo spettro FRET di controllo. Dopo aver raccolto da tre a cinque spettri di controllo ripetuti utilizzando 90 microlitri freschi di cellule per ogni misurazione, ripetere i passaggi di risospensione, centrifugazione e lavaggio per le cellule trasfettate.Aliquotare 90 microlitri di cellule trasfettate in ciascun tubo da 500 microlitri nei contenitori da due a sei e da otto a 12 posizionati su un blocco termico, risospendendo delicatamente le cellule tra un'aliquota e l'altra. Una volta trasferite tutte le cellule, aggiungere 10 microlitri di tampone senza farmaco ai tubi da due a sei per i campioni del gruppo non trattato. Successivamente, aggiungere 10 microlitri della soluzione del farmaco a una concentrazione di un millimolare al tubo otto.Avviare un timer per un conto alla rovescia di 10 minuti e utilizzare una pipetta P200 per mescolare delicatamente il contenuto del tubo. Chiudere il tubo dopo il mescolamento e riporlo nel blocco riscaldante. Successivamente, prendere immediatamente il secondo tubo.Mescolare delicatamente il contenuto con una nuova punta. Aggiungere 90 microlitri della sospensione di cellule trasfettate nella cuvetta della condizione non trattata e posizionare la cuvetta nel fluorimetro. Acquisire lo spettro FRET del campione utilizzando gli stessi parametri impiegati per gli spettri di controllo.A nove minuti e 10 secondi, aggiungere 10 microlitri della soluzione del farmaco da un millimolare al tubo nove. Mescolare delicatamente il contenuto del tubo e riposizionarlo sul blocco riscaldante. Successivamente, prendere immediatamente il tubo tre e mescolare e misurare il contenuto della cuvetta come appena dimostrato per il tubo due.A cinque minuti e dieci secondi, mescolare delicatamente il tubo otto con una pipetta P200. Aggiungere 90 microlitri della sospensione cellulare in una cuvetta separata per la misurazione del campione trattato con il farmaco e acquisire lo spettro FRET per il campione in condizioni di trattamento farmacologico. Dopo aver acquisito tutti gli spettri, salvare i file del progetto.Sciacquare accuratamente le cuvette con acqua ultrapura e rifornire i tubi per la condizione successiva. In questa immagine è mostrato un monostrato cellulare omogeneo, ottimale per la semina in piastre a sei pozzetti e per la trasfezione. Tuttavia, queste cellule che crescono in modelli raggruppati, dando origine a forme dendritiche, non sono raccomandate per una semina uniforme e per un'analisi accurata dell'espressione proteica o delle misurazioni FRET.Le condizioni di trasfezione possono essere ottimizzate anche per ottenere un'espressione riproducibile. Una volta raccolti tutti i dati e inseriti in un file CSV per l'analisi, i risultati ottenuti saranno simili a questi spettri rappresentativi di FRET grezzo e medi normalizzati. Tutti gli spettri di FRET grezzi di questo esperimento rappresentativo mostrano un segnale regolare e un rapporto segnale-rumore sufficiente, consentendo un'analisi dati coerente con un picco minimo dell'acqua proveniente dal campione.Quando i dati vengono normalizzati a 475 nanometri, i conteggi al secondo di questo valore sono impostati a 1,0 e la variazione significativa nella lettura a 525 nanometri tra i campioni trattati e non trattati diventa evidente. Se l'espressione proteica è bassa o se vi è un'efficienza di trasfezione scarsa oppure una bassa densità cellulare nella cuvetta durante la lettura della fluorescenza, i dati grezzi potrebbero risultare rumorosi, causando problemi nella sottrazione del fondo e nella normalizzazione, con conseguente mancato allineamento degli spettri e impossibilità di analizzarli. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 25 minuti se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di essere delicati durante la manipolazione delle cellule in tutte le fasi dell'esperimento. Dopo aver seguito questa procedura, la tecnica può essere ampliata per testare diversi sensori FRET per recettori, diversi farmaci e effettori e diversi tipi cellulari. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha contribuito al campo dei recettori accoppiati alle proteine G (GPCR), in cui studi recenti che utilizzano questi sensori hanno chiarito il meccanismo molecolare della selezione delle proteine G.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare specifiche conformazioni dei recettori accoppiati a proteine G utilizzando un saggio di misurazione basato su un costrutto FRET ancorato in cellule vive. Non dimenticare che lavorare con colture cellulari di mammifero e con determinati farmaci sperimentali può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare l'apposita attrezzatura di protezione individuale, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Biologia

Questo protocollo descrive come immagine interazioni proteina-proteina mediante un saggio basato su FRET prossimità.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Utilizzando un spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia, a livello di pixel mappe di Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficienze sono ottenute per le cellule che esprimono recettori di membrana ipotizzato per formare omo-oligomeriche complessi. Dal FRET mappe efficienza, siamo in grado di stimare le informazioni stechiometrico sui complessi oligomeri in fase di studio.

Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

Qui, descriviamo dettagliati vivere metodi di imaging per lo studio delle cellule chemiotassi. Vi presentiamo fluorescenza metodi microscopici di monitorare le dinamiche spazio-temporali di segnalazione eventi nella migrazione delle cellule. Misurazione di eventi di segnalazione ci permette di capire meglio come un GPCR di segnalazione rete raggiunge gradiente di rilevamento di fattori chemiotattici e controlli migratori direzionale delle cellule eucariotiche.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia è una potente tecnica di monitoraggio in tempo reale degli eventi di segnalazione nelle cellule in diretta tramite biosensori vari giornalisti. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da componenti disponibili in commercio e come usarlo per esperimenti FRET.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Le interazioni di GPCR-z-arrestin sono un campo emergente nella scoperta di farmaci GPCR. Metodi accurati, precisi e facili da impostare sono necessari per monitorare tali interazioni nei sistemi viventi. Mostriamo un saggio di complemento strutturale per monitorare le interazioni di GPCR-arresto-arresto in celle viventi in tempo reale, e può essere esteso a qualsiasi GPCR.

Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci

Dato che i GPCR sono interessanti obiettivi drogabili, lo screening dei ligandi GPCR è quindi indispensabile per l'identificazione dei composti di piombo e per gli studi di deorfanotrizzazione. A fronte di questi sforzi, descriviamo PRESTO-Tango, una piattaforma di risorse open source utilizzata per la profilazione simultanea del reclutamento transitorio di z-arrestin2 a circa 300 GPCR utilizzando un test reporter basato su TEV.

Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

Questo studio presenta una procedura dettagliata per eseguire esperimenti di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a singola molecola (smFRET) sui recettori accoppiati a proteine G (GPCR) utilizzando la marcatura sito-specifica tramite incorporazione di amminoacidi innaturali (UAA). Il protocollo fornisce una guida passo-passo per la preparazione dei campioni smFRET, gli esperimenti e l'analisi dei dati.

Visualizzazione della dinamica conformazionale dei recettori di membrana utilizzando FRET a singola molecola

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Il protocollo presentato in questo studio illustra l'efficacia del cAMP Difference Detector In Situ  nella misurazione del cAMP attraverso due metodi. Un metodo utilizza uno spettrofotometro per la lettura di piastre a 96 pozzetti con celle HEK-293. L'altro metodo dimostra le singole cellule HASM sotto un microscopio a fluorescenza.

Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ

Questo protocollo descrive l'uso di biosensori basati su BRET per la misurazione in tempo reale dell'attivazione della proteina G nelle cellule HEK293 viventi dopo stimolazione del ligando del recettore accoppiato alla proteina G. Qui, il recettore β2-adrenergico e il recettore dei cannabinoidi di tipo 1 servono come esempi per dimostrare l'efficienza dei sensori per diversi sottotipi di proteine G e in vari GPCR.

Biosensori a base di proteine G basati su BRET per la misurazione dell'attività del recettore accoppiato a proteine G in cellule vive

Scopri il saggio FRET in cellule vive per valutare le conformazioni selettive dei recettori GPCR con diversi agonisti. Questo metodo modulare aiuta a studiare le interazioni recettore-effettore e gli effetti dei farmaci.

Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension

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