Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid
26 dicembre 2016
Identificare nuovi bersagli farmacologici che passano dai test preclinici agli studi sull'uomo è una priorità scientifica. A tal fine, qui descriviamo un approccio di genomica funzionale per esaminare l'impatto della deplezione genica sugli sferoidi delle linee cellulari tumorali, che modellano in modo più appropriato i tumori umani in vivo.
L'obiettivo di questo protocollo di screening siRNA è quello di studiare l'impatto del silenziamento genico sulla crescita degli sferoidi delle linee cellulari tumorali. Rispetto alle tradizionali tecniche di coltura cellulare bidimensionale, gli sferoidi tumorali mostrano condizioni più simili a quelle riscontrate nei tumori in vivo. Questo metodo è utile per la valutazione funzionale di geni frequentemente alterati nei tumori umani e, cosa più importante, può essere utilizzato per determinare quali geni sono potenziali oncogeni o soppressori tumorali in condizioni di coltura più complesse, come quella osservata nella coltura tridimensionale e, in particolare, in ipossia.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facilmente adattabile in modo che i ricercatori possano usarla per studiare i loro particolari geni di interesse nelle loro linee cellulari preferite. Riteniamo che si basi sugli attuali approcci mirati di screening dell'sRNA. È generalmente apprezzato il fatto che gli screening mirati, piuttosto che i ceppi dell'intero genoma, consentano agli scienziati di porre domande specifiche e generare risultati più robusti.
Abbiamo analizzato l'effetto del silenziamento genico sulla vitalità e sulle dimensioni degli sferoidi, ma è possibile utilizzare anche coloranti biometrici per una diversa lettura dello schermo, come l'apoptosi. A dimostrare la procedura è Patty Wai del nostro laboratorio. Iniziare scongelando le piastre a 96 pozzetti contenenti la libreria siRNA a temperatura ambiente.
Quindi centrifugare per cinque minuti a 1.000 volte g, utilizzando una centrifuga da banco. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 10 microlitri di terreno sierico ridotto contenente il reagente di trasfezione ottimizzato ai pozzetti di ciascuna piastra. Incubare per 15 minuti per consentire la formazione di complessi di trasfezione, contenenti siRNA.
Come per qualsiasi pipeline di screening, la capacità di formazione di sferoidi delle linee cellulari in condizioni di trasfezione deve essere ottimizzata in modo robusto prima di eseguire lo screening completo. Successivamente, tripsinizzare le cellule da vagliare fino a quando non si staccano dal pallone. Una volta che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina con un volume appropriato di terreno specifico per la linea cellulare, trasferirla in una provetta da centrifuga e centrifugare per cinque minuti a 1.000 volte g in una centrifuga da banco per raccogliere le cellule.
Scartare il surnatante e risospendere il pellet in una sospensione a cella singola con un volume appropriato di mezzo. Eseguire un conteggio delle celle utilizzando un contatore di celle automatizzato. Quindi diluire la sospensione a 5.000 cellule per 180 microlitri con terreno freddo.
Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio. Utilizzando una pipetta multicanale, impostata a 180 microlitri, pipettare per miscelare e trasferire la sospensione cellulare nella piastra a 96 pozzetti contenente il siRNA. Centrifugare la piastra a 1.000 volte g in una centrifuga pre-raffreddata a 4 gradi Celsius per 10 minuti, quindi incubare la piastra in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius.
A questo punto, le celle appariranno come un mosaico sul fondo dei pozzetti. Dopo 24 ore, osservare le cellule al microscopio. A questo punto, le cellule dovrebbero essere aggregate insieme per formare un unico sferoide al centro del pozzo.
Aggiungere 100 microlitri di terreno completo a ciascun pozzetto per incoraggiare la crescita prima di tornare all'incubatrice. Dopo tre giorni di crescita, rimuovere delicatamente 100 microlitri di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 100 microlitri di terreno fresco. Il settimo giorno, esaminare gli sferoidi al microscopio, quindi procedere alla quantificazione delle dimensioni degli sferoidi su un lettore di piastre in grado di monitorare quantitativamente la crescita degli sferoidi nel tempo.
Per quantificare la dimensione dello sferoide, aprire prima il software sul computer. Selezionare la piastra a 96 pozzetti, selezionare il tipo di piastra appropriato e immettere un nome per l'esperimento. Quindi, inserire la piastra a 96 pozzetti contenente gli sferoidi in un citometro per imaging a piastre a micropozzetti da banco.
Quindi, seleziona l'applicazione Tumorsphere. Selezionare la messa a fuoco basata sull'immagine per modificare la messa a fuoco in modo che lo sferoide sia a fuoco e abbia un contrasto ottimale. Selezionare i pozzetti che richiedono la scansione e avviare la scansione.
Quindi, assicurati che la maschera dell'oggetto rappresenti accuratamente la dimensione dello sferoide. Per gli sferoidi BT474 cresciuti per sette giorni, regolare Precisione su Alta e impostare il diametro minimo della colonia su 200 micron. Utilizzare la funzione Esporta per esportare i dati sotto forma di un file di dati annotati che verrà analizzato per identificare i siRNA con un effetto statisticamente significativo sull'area sferoide.
Dopo l'imaging, rimuovere 100 microlitri di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 100 microlitri di colorante di vitalità luminescente per determinare la vitalità cellulare. Dopo aver incubato le piastre per 15 minuti, scansionare la piastra utilizzando un lettore di piastre luminescente. Questo protocollo può anche essere adattato per l'uso con altre linee cellulari tumorali.
La procedura di trasfezione inversa dei controlli non mirati non ha influenzato significativamente la vitalità per nessuna delle linee testate, mentre la trasfezione dell'ubiquitina B, un controllo positivo per l'uccisione delle cellule, ha diminuito significativamente la vitalità. Le cellule BT474 sono state trasfettate inversamente con la libreria siRNA umana siGENOME a 200 geni in triplice copia. È stata osservata area sferoidale e vitalità.
Sono stati identificati valori anomali significativi con un punteggio z superiore a 1,7. I siRNA che aumentano o riducono significativamente l'area sferoidale e la vitalità sono ombreggiati in blu e il rosso rappresenta i siRNA di controllo. Questa serie di micrografie mostra immagini rappresentative degli sferoidi BT474 sette giorni dopo la trasfezione inversa con E-caderina, un controllo non mirato, PIK3CA, ERBB2 o SF3B1 siRNA.
Questo istogramma mostra come il trattamento con ciascun siRNA abbia influenzato la vitalità cellulare sette giorni dopo la trasfezione inversa. Il knockdown di ERBB2 e PIK3CA ha ridotto significativamente la vitalità cellulare rispetto ai controlli. Questa immagine dimostra che gli sferoidi possono essere immunocolorati con successo per rivelare l'impatto del silenziamento genico sulle proteine bersaglio.
Una volta padroneggiati, diverse centinaia di geni possono essere sottoposti a screening in più linee cellulari in un giorno, e questo consente l'identificazione robusta di potenziali nuovi geni importanti per la sopravvivenza in colture tridimensionali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare con successo sferoidi di cellule tumorali suscettibili di silenziamento genico mediato da sRNA. Sarai anche in grado di studiare l'impatto del silenziamento genico eseguendo l'immunoistochimica sugli sferoidi.
Questo può offrire preziose informazioni spaziali che possono informarti sulla biologia sottostante.
Panoramica
Questo articolo presenta un approccio di genomica funzionale per identificare potenziali bersagli farmacologici esaminando gli effetti della deplezione genica sugli sferoidi di linee cellulari tumorali. Questi sferoidi forniscono un modello più accurato dei tumori umani in vivo rispetto alle tradizionali colture 2D.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Genomica funzionale
- Biologia del cancro
- Tecniche di coltura cellulare
Contesto
- Il silenziamento genico può rivelare oncogeni e soppressori tumorali.
- Gli sferoidi tumorali imitano più da vicino il microambiente del tumore rispetto alle colture 2D.
- Lo screening mirato con siRNA consente un'indagine genica specifica.
- Le condizioni ipossiche possono essere studiate utilizzando questo metodo.
Obiettivo dello studio
- Indagare l'impatto del silenziamento genico sulla crescita degli sferoidi tumorali.
- Identificare geni che possono servire come nuovi bersagli farmacologici.
- Migliorare la comprensione della funzione genica in un ambiente di coltura 3D.
Metodi utilizzati
- Screening siRNA in sferoidi di linee cellulari tumorali.
- Ottimizzazione delle condizioni di trasfezione per una robusta formazione di sferoidi.
- Quantificazione della dimensione e della vitalità degli sferoidi utilizzando la citometria ad imaging.
- Analisi degli effetti del silenziamento genico sulla vitalità e sulla crescita cellulare.
Risultati principali
- Sono stati osservati effetti significativi di siRNA specifici sulla vitalità e sulla dimensione degli sferoidi.
- Il knockdown di ERBB2 e PIK3CA ha ridotto la vitalità cellulare rispetto ai controlli.
- È stata ottenuta un'identificazione robusta di geni importanti per la sopravvivenza nella coltura 3D.
- È stata dimostrata l'adattabilità del metodo per varie linee cellulari tumorali.
Conclusioni
- Questo approccio consente lo screening di centinaia di geni in un solo giorno.
- Fornisce uno strumento prezioso per identificare potenziali bersagli terapeutici nel cancro.
- Il metodo migliora la comprensione della funzione genica in un contesto più fisiologicamente rilevante.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Functional genomics screening in 3D cancer spheroid models enhances target validation by revealing gene dependencies under physiologically relevant conditions. This approach improves predictive confidence in identifying novel drug targets by capturing tumor microenvironment influences often missed in 2D cultures. The method supports early discovery decisions by linking gene silencing effects to spheroid growth and viability, enabling mechanistic de-risking of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the impact of gene silencing on cancer spheroid growth and viability.
- Operational Value: Enables functional assessment of frequently altered genes in human cancers under complex culture conditions.
- Predictive Value: Identifies potential oncogenes or tumor suppressors that are critical for survival in 3D culture, supporting target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes siRNA screening to generate quantitative readouts of spheroid area and viability for gene effect analysis.
- Operational Value: Requires optimization of transfection conditions and spheroid formation capacity to ensure robust and reproducible screening outcomes.
- Assay Readiness: Employs imaging cytometry and luminescent viability dyes to enable high-content, quantitative monitoring of spheroid growth over time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Confirms spatial impact of gene dependencies via immunohistochemistry, linking molecular findings to protein-level changes in spheroids.
- Preclinical Continuity: Demonstrates dependency on HER2 amplification and PIK3CA mutation in BT474 spheroids, validating known cancer drivers in a 3D model.
- Mechanistic De-risking: Provides spatial and functional validation of gene effects, reducing ambiguity in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for targets requiring validation in complex, hypoxia-prone tumor models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to spheroid viability and size changes.
- Screening: Enables assay standardization through reverse transfection protocols and standardized spheroid formation in 96-well formats.
- Analytics: Generates quantitative spheroid area and viability data via imaging cytometry and luminescent readouts, enabling statistical identification of significant hits (e.g., z-score >1.7).
- Translational Research: Connects gene silencing effects to spatial protein expression via immunohistochemistry, enhancing biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Adaptable across cancer cell lines and siRNA libraries, positioning it as a reusable platform for target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing gene dependencies in a tumor-relevant 3D context.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized spheroid formation, transfection optimization, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from 2D models and increasing confidence in target essentiality.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection techniques, and 3D model handling to ensure robust spheroid formation.
- Dependent on access to imaging cytometry and luminescent plate readers for quantitative spheroid size and viability assessment.
- Necessitates optimization of transfection conditions and cell density (5,000 cells/180 µL) for consistent spheroid formation across wells.
- Requires adaptation considerations when extending to other cancer cell lines or hypoxia-modulated conditions.
- Practical limitation: Screening throughput depends on siRNA library size and imaging capacity, though hundreds of genes can be screened per day once optimized.
