Imaging di cellule di figura alterazione e la cella in Movimento Drosophila gastrulation Utilizzando DE-caderina Reporter mosche transgeniche
29 dicembre 2016
Qui descriviamo una procedura per catturare immagini dal vivo della gastrulazione di Drosophila. Questo ci ha permesso di comprendere meglio la costrizione apicale coinvolta nello sviluppo precoce e di analizzare ulteriormente i meccanismi che regolano i movimenti cellulari durante la modificazione della struttura tissutale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di comprendere meglio la forma e il movimento cellulare durante la gastrulazione della Drosophila. Qui forniamo un robusto metodo di misurazione della gastrulazione di Drosophila, per saggiare l'inizio del movimento cellulare morfogenetico, durante questa fase dello sviluppo embrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il riarrangiamento cellulare al momento della gastrulazione, può essere identificato insieme alla costrizione apicale, durante la gastrulazione.
Per iniziare l'esperimento, preparare una miscela di 375 millilitri di acqua. 125 millilitri di succo di mela 100% disponibile in commercio. 12,5 grammi di agar.
12,5 grammi di glucosio. Quindi, scaldare la miscela nel microonde, fino a quando l'agar non si sarà sciolto. E versalo in un piatto di coltura cellulare di tre centimetri.
Conservare la miscela a 4 gradi Celsius, per un uso futuro. Dopo aver preparato il piatto di mele, aggiungere sopra un sottile strato di pasta di lievito impastato, per permettere alle mosche di deporre le uova. Mettere 25 mosche maschi e 25 femmine in una bottiglia su un piatto di mele ricoperto di lievito impastato.
Avvolgi le bottiglie di plastica di Drosophilas con un foglio di alluminio per spingere le mosche a deporre più uova. Tenere la bottiglia capovolta in un'incubatrice per una notte. La mattina dopo, sostituisci il piatto di succo di mela con uno nuovo.
Quindi avvolgere la bottiglia con un foglio di alluminio e lasciare che le mosche depongano le uova per tre o quattro ore. Dopo che le mosche hanno deposto le uova, staccare le uova dal piatto con un batuffolo di cotone. Raccogli gli embrioni in un colino e lavali con soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS.
Lavare gli embrioni altre tre volte con PBS, in piastre di coltura a 12 pozzetti. Decorionare gli embrioni con il 50% di candeggina, in piastre di coltura a 12 pozzetti. Dopo il processo di decorionazione, lavare gli embrioni altre tre volte con PBS.
Trasferire gli embrioni in una piastra di coltura cellulare di tre centimetri contenente PBS. E seleziona gli embrioni al quinto stadio al microscopio, in base al livello di trasparenza ai loro confini. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri, raccogliere gli embrioni in stadi.
Quindi, posizionare due embrioni selezionati su un vetrino coprioggetto e rimuovere il PBS in eccesso con carta velina. Con una carta velina finemente attorcigliata, orientare il lato dorsale degli embrioni verso l'alto fino al vetrino coprioggetto. Quindi attaccare gli embrioni al vetrino coprioggetto con grasso siliconico utilizzando un ago sottile.
Aggiungere una piccola goccia di olio di carbonio cavo 700 sugli embrioni e posizionare il vetrino coprioggetti contenente gli embrioni capovolto sul vetrino dentellato. Lasciando un po' di spazio nella parte inferiore della diapositiva. Quindi incollare il vetrino coprioggetto al vetrino.
Infine, esamina gli embrioni utilizzando un sistema di imaging confocale, un laser ad argon 488 e un obiettivo a immersione in olio. Le immagini time-lapse sono state catturate da immagini dal vivo, utilizzando la GFP DE-caderina del movimento cellulare nell'arco di 500 secondi, per analizzare le aree apicali delle singole cellule, di Drosophila durante la gastrulazione. A 500 secondi, la costrizione apicale e l'invaginazione sono chiaramente visibili.
Utilizzando il nostro metodo. Possiamo comprendere ulteriormente i meccanismi molecolari della gastrulazione di Drosophila, così come la transizione epiteliale a mesenchimale, coinvolta nelle metastasi tumorali.
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Panoramica
Questo articolo presenta una procedura per acquisire immagini in vivo della gastrulazione di Drosophila, migliorando la comprensione della costrizione apicale durante lo sviluppo iniziale. La tecnica consente un'analisi dettagliata dei movimenti cellulari coinvolti nella modifica della struttura del tessuto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Biologia cellulare
Sfondo
- La gastrulazione di Drosophila è una fase critica dello sviluppo embrionale.
- Comprendere la forma e il movimento cellulare è essenziale per afferrare i processi dello sviluppo.
- La costrizione apicale svolge un ruolo significativo nei movimenti morfogenetici.
- Le tecniche di imaging in tempo reale possono fornire informazioni sui comportamenti cellulari dinamici.
Scopo dello studio
- Migliorare la comprensione dei movimenti cellulari durante la gastrulazione di Drosophila.
- Sviluppare un metodo robusto per misurare il movimento cellulare morfogenetico.
- Identificare il riarrangiamento delle cellule e la costrizione apicale durante la gastrulazione.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una miscela specifica per l'analisi mediante imaging.
- Acquisizione in tempo reale di embrioni di Drosophila durante la gastrulazione.
- Analisi dei movimenti cellulari e dei cambiamenti di forma.
- Identificazione degli eventi morfogenetici chiave.
Risultati principali
- Acquisizione con successo di immagini in vivo della gastrulazione di Drosophila.
- Identificazione della costrizione apicale e del riarrangiamento cellulare.
- Migliore comprensione della dinamica cellulare durante lo sviluppo embrionale.
- Metodologia solida per futuri studi in biologia dello sviluppo.
Conclusioni
- La procedura fornisce informazioni preziose sulla gastrulazione di Drosophila.
- L'immagine in tempo reale è uno strumento potente per lo studio dei movimenti cellulari.
- I risultati contribuiscono alla comprensione più ampia dei processi dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
L'analisi in tempo reale della modifica della forma cellulare e del movimento durante la gastrulazione di Drosophila fornisce una piattaforma solida per analizzare i meccanismi molecolari alla base della transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), un processo implicato nella fibrosi e nella metastasi tumorale. Questo metodo consente una visualizzazione ad alta risoluzione della costrizione apicale e del riarrangiamento cellulare, sostenendo una previsione affidabile nella validazione precoce di bersagli per percorsi correlati all'EMT. L'approccio rafforza la continuità traslazionale dalla biologia dello sviluppo a studi meccanicistici rilevanti per le malattie nella ricerca e sviluppo biofarmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della funzione genica e della dinamica delle vie associate alla MTE in un contesto multicellulare vivente.
- Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la visualizzazione diretta di eventi morfogenetici associati a meccanismi patologici.
- Facilita la validazione funzionale di bersagli genici che controllano la restrizione apicale e le transizioni del destino cellulare.
- Fornisce un'elevata capacità predittiva per la priorizzazione di bersagli modulatori della MTE nei portafogli oncologici e antifibrotici.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un sistema di imaging validato per la quantificazione in tempo reale del movimento cellulare e delle variazioni di forma.
- Permette la misurazione riproducibile della costrizione apicale e del riarrangiamento cellulare come risultati quantitativi del saggio.
- Supporta la standardizzazione di piattaforme per lo screening fenotipico di composti che modulano l'EMT.
- Prepara sistemi biologici robusti per flussi di lavoro di screening ad alto contenuto successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i processi di EMT dello sviluppo a modelli rilevanti per la malattia di metastasi e rimodellamento tissutale.
- Fornisce informazioni meccanicistiche che guidano la selezione di biomarcatori traslazionali per studi preclinici.
- Permette un avanzamento proporzionato al rischio di candidati mirati all'EMT basato su evidenze fenotipiche in cellule vive.
- Consolida la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica nei settori delle malattie guidate dall'EMT.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di imaging si integra nel percorso della scoperta, dal test iniziale delle ipotesi allo sviluppo di modelli preclinici per bersagli legati all'EMT.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi di regolazione dell'EMT e della morfogenesi.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per la forma cellulare e il movimento, consentendo la preparazione del saggio.
- Analisi: Fornisce dati di imaging ad alto contenuto informativo per l'analisi comparativa di perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Ricerca traslazionale: Collega i meccanismi dello sviluppo a modelli di EMT rilevanti per le malattie, al fine di allineare i biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma di imaging riutilizzabile e adattabile a diversi studi sull'EMT e sulla morfogenesi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce i rischi meccanicistici nei programmi di scoperta mirati all'EMT.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro di imaging standardizzati e scalabili per garantire riproducibilità tra progetti.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi biologici in fase avanzata nelle indicazioni guidate dall'EMT.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio degli asset che modulano l'EMT in diverse aree terapeutiche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging in vivo, nella microscopia confocale e nell'embriologia di Drosophila.
- Richiede l'accesso a strumentazione avanzata per l'imaging e a software analitici per l'analisi in time-lapse.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale dei protocolli di staging degli embrioni e di imaging per garantire la riproducibilità.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei costrutti reporter e delle condizioni di imaging.
- I limiti pratici includono vincoli sulla capacità di elaborazione e la necessità di un'accurata manipolazione degli embrioni.
