Esecuzione della cromatografia su strato sottile 1D

1. Piastre TLC

1. Gli adsorbenti comuni per la TLC sono il gel di silice, l'allumina e la cellulosa. Le lastre TLC sono disponibili in commercio con una varietà di proprietà. Scegli una lastra TLC e tagliala a una dimensione appropriata (circa 5 cm x 5 cm è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni). Per le lastre TLC con retro in vetro, incidere il vetro usando un righello e un tagliavetro, quindi rompere con cura lungo la linea.

2. Avvistamento

1. Sciogliere il campione in un solvente adatto per ottenere una soluzione di circa l'1%. Se possibile, il solvente dovrebbe essere apolare. Le frazioni cromatografiche su colonna e altre soluzioni diluite possono essere utilizzate senza diluizione se il soluto è presente a una concentrazione compresa tra lo 0,2% e il 2,0%.
2. Segna la linea di base con una matita a circa 1,0 cm dal fondo della lastra. Posizionare le macchie ad almeno 1,0 cm dal bordo della piastra ed etichettarle in modo appropriato.
3. Le macchie possono essere applicate utilizzando un capillare di vetro. Per individuare la piastra TLC, immergere il capillare nella soluzione per aspirare una piccola quantità di liquido. Toccare delicatamente la punta nella posizione desiderata sulla piastra TLC e rimuoverla immediatamente.
4. In alternativa, applicare i punti con una siringa da microlitro erogando circa 1 μL di soluzione per ogni applicazione.
5. Le macchie possono essere applicate in successione in ogni posizione, facendo attenzione a non disturbare la superficie dell'adsorbente con lo spotter. Lasciare asciugare il solvente tra un'applicazione e l'altra.

3. Scegliere un solvente in via di sviluppo

1. È preferibile utilizzare il solvente meno polare possibile per una buona separazione. I solventi comuni per la TLC includono esano, acetato di etile, diclorometano e metanolo (Tabella 1).
2. Un modo conveniente per trovare una fase mobile appropriata è individuare la lastra TLC con un campione. Applicare una quantità sufficiente di solvente direttamente sul punto per formare un cerchio di solvente di 1-2 cm di diametro. Segna la circonferenza del cerchio. Al momento della visualizzazione, un solvente appropriato mostrerà anelli ben separati, con l'anello più esterno a circa il 50% della distanza dal centro al fronte del solvente.
3. Potrebbe essere necessario regolare la polarità della fase mobile scegliendo due solventi miscibili e testandoli in proporzioni variabili. Esempi di miscele comuni sono gli esani con acetato di etile e il diclorometano con metanolo.

4. Sviluppo

1. Collocare la piastra TLC macchiata in una camera di sviluppo contenente il solvente di sviluppo appropriato. La linea del solvente deve essere al di sotto della linea di base contrassegnata sulla piastra TLC.
2. La camera di sviluppo può essere un barattolo con coperchio o un bicchiere ricoperto da un foglio di alluminio o da una pellicola di plastica. Utilizzare il contenitore più piccolo disponibile che possa ospitare la piastra TLC.
3. Non lasciare che il solvente raggiunga il bordo superiore della piastra. Quando il fronte del solvente (il limite in cui termina la parte umida dell'adsorbente) si trova a 5-10 mm dalla parte superiore della piastra, rimuovere la piastra TLC dalla camera di sviluppo e contrassegnare il fronte del solvente con una matita prima che il solvente si asciughi.

5. Visualizzazione

1. Le macchie colorate possono essere visualizzate immediatamente e contrassegnate con una matita. Spesso le macchie non sono visibili e quindi devono essere visualizzate con un altro metodo.
2. Spesso, l'adsorbente TLC contiene un indicatore fluorescente. I punti possono essere visualizzati utilizzando una lampada a raggi ultravioletti (UV) portatile. I composti che estinguono la fluorescenza appariranno come macchie scure quando la lastra viene irradiata con luce UV a onde corte (254 nm). I composti fluorescenti producono punti luminosi quando irradiati con luce UV di una lunghezza d'onda appropriata. Segna il centro di ogni punto con una matita.
3. Le macchie possono anche essere visualizzate applicando un reagente di visualizzazione o un colorante sulla piastra TLC. Il reagente di visualizzazione può essere applicato immergendo la piastra nel reagente o strofinando la piastra con un batuffolo di cotone imbevuto di un reagente non corrosivo.
4. Una soluzione al 20% di acido fosfomolibdico in etanolo è utile per la visualizzazione della maggior parte dei composti organici. Le macchie compaiono dopo il riscaldamento della piastra con una pistola termica o in un forno.
5. Altri reagenti possono essere utilizzati per la visualizzazione di classi specifiche di composti. Ad esempio, il reagente ninidrina viene utilizzato per la visualizzazione degli amminoacidi e la 2,4-dinitrofenilidrazina per aldeidi e chetoni.

6. Analisi

1. Il fattore di ritardo (R_f) è il rapporto tra la distanza percorsa da un composto su una piastra TLC e la distanza percorsa dal solvente. Questo può essere determinato misurando la distanza dalla linea di base al centro del punto e dividendo il valore per la distanza dalla linea di base al fronte del solvente.
   
2. Il R_f di un composto è caratteristico delle sue proprietà fisiche e dipende da fattori come la temperatura, la dimensione del campione, lo spessore e l'attività dell'adsorbente, la temperatura e la dimensione del campione.
3. Per confermare che un'incognita è identica a un composto noto, è necessario individuare uno standard sulla stessa lastra TLC. Sostanze identiche avranno la stessa caratteristica R_f.