2.13: Esecuzione della cromatografia su strato sottile 1D

1. Piastre TLC

1. Gli adsorbenti comuni per la TLC sono il gel di silice, l'allumina e la cellulosa. Le lastre TLC sono disponibili in commercio con una varietà di proprietà. Scegli una lastra TLC e tagliala a una dimensione appropriata (circa 5 cm x 5 cm è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni). Per le lastre TLC con retro in vetro, incidere il vetro usando un righello e un tagliavetro, quindi rompere con cura lungo la linea.

2. Avvistamento

1. Sciogliere il campione in un solvente adatto per ottenere una soluzione di circa l'1%. Se possibile, il solvente dovrebbe essere apolare. Le frazioni cromatografiche su colonna e altre soluzioni diluite possono essere utilizzate senza diluizione se il soluto è presente a una concentrazione compresa tra lo 0,2% e il 2,0%.
2. Segna la linea di base con una matita a circa 1,0 cm dal fondo della lastra. Posizionare le macchie ad almeno 1,0 cm dal bordo della piastra ed etichettarle in modo appropriato.
3. Le macchie possono essere applicate utilizzando un capillare di vetro. Per individuare la piastra TLC, immergere il capillare nella soluzione per aspirare una piccola quantità di liquido. Toccare delicatamente la punta nella posizione desiderata sulla piastra TLC e rimuoverla immediatamente.
4. In alternativa, applicare i punti con una siringa da microlitro erogando circa 1 μL di soluzione per ogni applicazione.
5. Le macchie possono essere applicate in successione in ogni posizione, facendo attenzione a non disturbare la superficie dell'adsorbente con lo spotter. Lasciare asciugare il solvente tra un'applicazione e l'altra.

3. Scegliere un solvente in via di sviluppo

1. È preferibile utilizzare il solvente meno polare possibile per una buona separazione. I solventi comuni per la TLC includono esano, acetato di etile, diclorometano e metanolo (Tabella 1).
2. Un modo conveniente per trovare una fase mobile appropriata è individuare la lastra TLC con un campione. Applicare una quantità sufficiente di solvente direttamente sul punto per formare un cerchio di solvente di 1-2 cm di diametro. Segna la circonferenza del cerchio. Al momento della visualizzazione, un solvente appropriato mostrerà anelli ben separati, con l'anello più esterno a circa il 50% della distanza dal centro al fronte del solvente.
3. Potrebbe essere necessario regolare la polarità della fase mobile scegliendo due solventi miscibili e testandoli in proporzioni variabili. Esempi di miscele comuni sono gli esani con acetato di etile e il diclorometano con metanolo.

4. Sviluppo

1. Collocare la piastra TLC macchiata in una camera di sviluppo contenente il solvente di sviluppo appropriato. La linea del solvente deve essere al di sotto della linea di base contrassegnata sulla piastra TLC.
2. La camera di sviluppo può essere un barattolo con coperchio o un bicchiere ricoperto da un foglio di alluminio o da una pellicola di plastica. Utilizzare il contenitore più piccolo disponibile che possa ospitare la piastra TLC.
3. Non lasciare che il solvente raggiunga il bordo superiore della piastra. Quando il fronte del solvente (il limite in cui termina la parte umida dell'adsorbente) si trova a 5-10 mm dalla parte superiore della piastra, rimuovere la piastra TLC dalla camera di sviluppo e contrassegnare il fronte del solvente con una matita prima che il solvente si asciughi.

5. Visualizzazione

1. Le macchie colorate possono essere visualizzate immediatamente e contrassegnate con una matita. Spesso le macchie non sono visibili e quindi devono essere visualizzate con un altro metodo.
2. Spesso, l'adsorbente TLC contiene un indicatore fluorescente. I punti possono essere visualizzati utilizzando una lampada a raggi ultravioletti (UV) portatile. I composti che estinguono la fluorescenza appariranno come macchie scure quando la lastra viene irradiata con luce UV a onde corte (254 nm). I composti fluorescenti producono punti luminosi quando irradiati con luce UV di una lunghezza d'onda appropriata. Segna il centro di ogni punto con una matita.
3. Le macchie possono anche essere visualizzate applicando un reagente di visualizzazione o un colorante sulla piastra TLC. Il reagente di visualizzazione può essere applicato immergendo la piastra nel reagente o strofinando la piastra con un batuffolo di cotone imbevuto di un reagente non corrosivo.
4. Una soluzione al 20% di acido fosfomolibdico in etanolo è utile per la visualizzazione della maggior parte dei composti organici. Le macchie compaiono dopo il riscaldamento della piastra con una pistola termica o in un forno.
5. Altri reagenti possono essere utilizzati per la visualizzazione di classi specifiche di composti. Ad esempio, il reagente ninidrina viene utilizzato per la visualizzazione degli amminoacidi e la 2,4-dinitrofenilidrazina per aldeidi e chetoni.

6. Analisi

1. Il fattore di ritardo (R_f) è il rapporto tra la distanza percorsa da un composto su una piastra TLC e la distanza percorsa dal solvente. Questo può essere determinato misurando la distanza dalla linea di base al centro del punto e dividendo il valore per la distanza dalla linea di base al fronte del solvente.
   
2. Il R_f di un composto è caratteristico delle sue proprietà fisiche e dipende da fattori come la temperatura, la dimensione del campione, lo spessore e l'attività dell'adsorbente, la temperatura e la dimensione del campione.
3. Per confermare che un'incognita è identica a un composto noto, è necessario individuare uno standard sulla stessa lastra TLC. Sostanze identiche avranno la stessa caratteristica R_f.

La cromatografia su strato sottile, o TLC, è un metodo cromatografico utilizzato per separare miscele di composti non volatili, comunemente usato in chimica organica.

La TLC viene eseguita su una lastra con supporto in vetro o plastica. Una linea di base è segnata sulla targa, insieme alle etichette. La miscela in esame e i composti di riferimento vengono disciolti in un solvente appropriato e applicati in piccoli punti vicino al bordo inferiore della piastra TLC. La lastra viene posta in un barattolo e un solvente? (la fase mobile) separa la miscela in base alle proprietà fisiche di ciascun componente.

Nonostante il fatto che le tecniche di separazione più strumentali abbiano un potere risolutivo maggiore rispetto alle TLC, sono la velocità e il basso costo che rendono le TLC una tecnica interessante per l'analisi qualitativa al volo. Questo video illustra la preparazione, il funzionamento e l'analisi della cromatografia su strato sottile.

Le tecniche cromatografiche includono una fase stazionaria e una mobile. Nella TLC, la fase stazionaria è costituita da un sottile strato di materiale fissato alla piastra. Il materiale è una sostanza polare, come il gel di silice. La fase mobile è un liquido non polare che si muove verso l'alto lo strato adsorbente per azione capillare. Man mano che la fase mobile si sposta verso l'alto della piastra, trascina lungo i componenti di ciascun punto, che vengono successivamente separati in base alla polarità.

I composti meno polari trascorreranno più tempo nella fase mobile quando viene tirata su per la piastra. I composti che sono più polari sono più attratti dalla fase stazionaria e quindi non si sposteranno lungo la placca così lontano.

La separazione avviene in un contenitore in via di sviluppo. Questi possono essere barattoli con coperchio o bicchieri ricoperti da un foglio di alluminio. Utilizzare il contenitore più piccolo disponibile che ospiterà la piastra TLC per velocizzare la separazione.

La fase mobile, o solvente in via di sviluppo, dovrebbe essere il più apolare possibile per una buona separazione. Qui è mostrata una serie eluotropica per gel di silice, un elenco di fasi mobili comuni in ordine di aumento della potenza di estrazione.

È possibile testare contemporaneamente più fasi mobili. Su una piastra pulita, individuare il campione disciolto più volte, ad almeno 2 cm di distanza. Applicare una quantità sufficiente di fase mobile su ogni punto per formare un cerchio di 1-2 cm di diametro.

Segna la distanza percorsa dalla fase mobile. Se la fase mobile non è sufficientemente polare, il campione rimarrà vicino al punto iniziale. Se la fase mobile è troppo polare, tutto il campione migrerà con il fronte del solvente. Un'appropriata fase mobile mostrerà anelli ben separati, con l'anello più esterno a circa il 50% della distanza dal fronte del solvente.

Se necessario, due fasi mobili miscibili possono essere miscelate in proporzioni variabili per ottenere le proprietà desiderate. In questo caso, una miscela 1:1 di acetato di etile ed esano era troppo polare, ma una miscela 1:20 è stata opportunamente separata.

Con la fase mobile scelta, sei pronto per iniziare a sviluppare la lastra.

Per iniziare la procedura, tagliare una lastra TLC disponibile in commercio alla dimensione desiderata. Se la lastra ha un supporto in vetro, incidetela con un tagliavetro e rompetela con cura lungo la linea.

Con una matita, segna una linea di base a circa 1 cm dal fondo del piatto. Segnare la posizione in cui verranno individuati i campioni lungo la linea. Assicurati che le macchie siano ad almeno 1 cm dal bordo e a 3 mm di distanza. Etichettali in modo appropriato.

I campioni solidi devono essere disciolti in un solvente adatto. I solventi comuni includono esani, acetato di etile o diclorometano. Utilizzare il solvente meno polare che dissolverà il campione.

Prelevare la miscela campione/solvente con un capillare di vetro. Toccare delicatamente la punta nella posizione desiderata sulla piastra TLC e rimuoverla immediatamente. È importante non disturbare la fase stazionaria.

Mantieni la macchia il più piccola possibile, in quanto ciò porta a una migliore separazione. Se è necessario più campione, i punti possono essere applicati successivamente in ogni posizione. Lasciare asciugare il solvente tra un'applicazione e l'altra. Un flusso d'aria può essere utilizzato per asciugare solventi meno volatili.

La lastra TLC è ora pronta per essere sviluppata. Metti un pezzo di carta da filtro sul fondo del barattolo per aumentare la pressione del vapore. Aggiungete la fase mobile a una profondità che non raggiunga la linea di base. Tappare il barattolo quando non è in uso in modo che i vapori di solvente non fuoriescano.

Posizionare con cura la piastra TLC maculata nel barattolo di sviluppo. Assicurarsi che la fase mobile sia al di sotto della linea di base. Osservare l'andamento del fronte del solvente? L'avanguardia della fase mobile? poiché si sposterà rapidamente lungo la piastra.

Non lasciare che la fase mobile raggiunga il bordo superiore della piastra, poiché le bande del campione inizieranno ad espandersi attraverso la diffusione. Una volta che il fronte del solvente si avvicina alla parte superiore, rimuovere la piastra dalla camera di sviluppo e contrassegnare il fronte del solvente con una matita prima che il solvente si asciughi.

Se i composti non sono colorati, è possibile utilizzare una lampada UV per visualizzare le macchie. Il composto bloccherà la fluorescenza di fondo della piastra. Impostare la lampada sull'impostazione delle onde corte e illuminare la piastra asciutta. Con una matita, delinea eventuali punti visibili sotto la lampada. Con una matita, delinea eventuali punti visibili sotto la lampada.

Un'altra possibile tecnica di visualizzazione consiste nell'utilizzare il permanganato di potassio, un agente ossidante. Usando una pinzetta, immergi la piastra nella macchia di permanganato.

Rimuovere e tamponare la soluzione in eccesso con un tovagliolo di carta. In una cappa aspirante, riscaldare accuratamente la piastra con una pistola termica per visualizzare i punti. Usa una matita per segnare tutti i punti che appaiono.

Una volta visualizzati gli spot, la sostanza di interesse può essere confrontata con gli standard, come mostrato qui. In questo esempio, l'incognita è l'1,3-difenilpropinone, un elemento costitutivo della sintesi organica. Confrontando la banda con uno standard noto e il cloruro di benzoile, uno dei materiali di partenza, il prodotto può essere identificato.

Il fattore di ritardo, o Rf, viene utilizzato per identificare il composto sconosciuto. L'Rf è il rapporto tra la distanza percorsa da un composto su una piastra TLC e la distanza percorsa dalla fase mobile. Il fattore viene determinato misurando la distanza dalla linea di base al punto e dividendo per la distanza dalla linea di base al fronte del solvente.

La Rf di un dato composto dipende dalle condizioni utilizzate nell'esperimento, tra cui la scelta del solvente, lo spessore e l'attività dell'adsorbente, la temperatura e la dimensione del campione. Bisogna fare attenzione a mantenere questi fattori coerenti tra gli esperimenti.

Ci sono diverse applicazioni della cromatografia su strato sottile.

In questo esempio, è stato studiato il contenuto di triacilgliceridi delle ghiandole sebacee dei pipistrelli. La frazione lipidica superficiale è stata prima separata dalla polarità su una piastra TLC. La banda dei triacilgliceridi è stata quindi rimossa dalla piastra con una spatola. La polvere di silice è stata trasferita in una provetta da microcentrifuga con solvente. Dopo la centrifugazione, la fase stazionaria è stata lasciata sul fondo della provetta, mentre i composti sono rimasti disciolti nel solvente. I triacilgliceridi sono stati poi ulteriormente separati da un'altra proprietà fisica. In questo caso, la seconda dimensione della separazione era la dimensione molecolare.

La TLC può essere utilizzata anche per monitorare la progressione di una reazione chimica. In questo esempio, il materiale di partenza della reazione è stato utilizzato come standard e ha fatto scorrere insieme alla soluzione di reazione su una piastra TLC. Questo processo è stato ripetuto a intervalli specifici nel corso della reazione. Con il progredire della reazione, la banda del materiale di partenza diminuiva e la banda del prodotto si allargava. Quando non c'è stato alcun cambiamento nelle bande, o tutto il materiale di partenza è stato consumato, la reazione è stata completa. ?

Infine, le piastre TLC possono essere utilizzate nei biosaggi. In questo esempio, i composti sono stati separati dal trifoglio rosso con TLC. Ogni fascia è stata quindi posizionata sui batteri che crescono su piastre di agar. Le molecole che mostravano una crescita batterica inibita sono state ulteriormente analizzate per le loro proprietà antimicrobiche.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla cromatografia su strato sottile. A questo punto dovreste comprendere la teoria alla base della separazione, come scegliere una fase mobile appropriata per il vostro esperimento e come impostare e far funzionare una piastra TLC. Grazie per l'attenzione!