Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia
31 dicembre 2016
Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esprimere nuove proteine, come i canali ionici negli ovociti di Xenopus. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in qualsiasi campo che richieda un sistema di espressioni funzionali. I principali vantaggi delle varianti di questa tecnica sono la velocità, l'affidabilità e la migliore sopravvivenza degli ovociti.
Questo metodo può fornire informazioni sul funzionamento dei canali ionici. Inoltre, può essere applicato allo studio di qualsiasi altra proteina. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che i metodi classici portavano a un basso tasso di sopravvivenza degli ovociti.
Dopo aver rimosso i lobi delle ovaie dalle rane femmine secondo il protocollo di testo, posizionare i lobi nella soluzione sterile di Barth modificata integrata con penicillina e streptomicina. Tagliare i lobi per consentire l'accesso del tessuto all'ossigeno. Per individuare lo stadio da cinque a sei follicoli, usa una pinza per tenere l'ovaio e poi abbassa un'ansa di platino sui follicoli e ritira delicatamente l'ansa per interrompere il tessuto connettivo con il follicolo dal tessuto ovarico.
Separa gli ovociti dall'aspetto sano usando l'ansa di platino. Utilizzare una pipetta Pasteur di plastica con la punta tagliata a un diametro di 1,5 millimetri per trasferire i follicoli selezionati in una piastra di Petri di 35 millimetri di diametro. Dopo aver preparato i cRNA per il recettore GABA A e le pipette per microiniezione secondo il protocollo di testo, utilizzare olio di paraffina e una siringa da 10 millilitri con un ago sottile per riempire una pipetta per microiniezione.
Quindi montare la pipetta su un apparecchio per microiniezione costruito in casa. Utilizzando una pipetta con punta di plastica sterile, posizionare una goccia di soluzione di mRNA sul lato pulito di un pezzo di materiale termoplastico resistente all'umidità. Quindi immergere la punta della pipetta per iniezione nella gocciolina e accendere il motore per ritrarre lo stantuffo.
La soluzione di mRNA dovrebbe entrare nella pipetta e formare un'interfaccia visibile con l'olio. Quindi, ritrarre la punta della pipetta dalla gocciolina e applicare una pressione positiva all'interno della pipetta per iniezione. Una gocciolina di soluzione di mRNA dovrebbe formarsi sulla punta della pipetta per iniezione.
Utilizzando una piastra di Petri da 60 millimetri con rete di nylon incollata sul fondo e ricoperta di MBS per iniezione, allineare i follicoli con i loro poli vegetali rivolti verso l'alto. Con il micromanipolatore, posizionare la pipetta per iniezione su un singolo follicolo. Inserire l'ago per iniezione al centro del polo vegetale e applicare una pressione positiva all'interno della pipetta per iniettare 50 nanolitri di mRNA a una velocità di flusso di 0,6 microlitri al minuto.
Attendere da cinque a 10 secondi prima di rimuovere la punta della pipetta per iniezione dal follicolo per evitare la fuoriuscita dell'RNA messaggero. Trasferire i follicoli iniettati in una nuova piastra di Petri riempita con due millilitri di MBS. Metti il piatto in una cantinetta impostata a 18 gradi Celsius.
Incubare i follicoli iniettati da uno a sette giorni prima della registrazione, a seconda dell'identità della proteina appena espressa. Per rimuovere i follicoli, trasferire dieci follicoli iniettati in una provetta di vetro borosilicato contenente 0,5 millilitri di MBS, un milligrammo per millilitro di collagenasi e 0,1 milligrammi per millilitro di inibitore della tripsina. Immergere la provetta in un bagno d'acqua a 36 gradi Celsius e incubare i follicoli per 20 minuti.
La temperatura qui è critica perché un grado in più può uccidere gli ovociti. Sciacquare i follicoli trasferendoli in una seconda provetta contenente un millilitro di MBS a temperatura ambiente, e lasciarli nella provetta per una decina di secondi. Quindi trasferire i follicoli in una terza provetta contenente 0,5 millilitri di MBS a doppia concentrazione contenente quattro millimolari di EGTA e incubare i campioni a temperatura ambiente per quattro minuti, agitando di tanto in tanto le provette.
Il tempo di incubazione di quattro minuti è fondamentale per garantire che gli strati follicolari si stacchino dall'ovocita. Sciacquare i follicoli trasferendoli in un'altra provetta contenente un millilitro di MBS a temperatura ambiente, e lasciarli nella provetta per circa 10 secondi. Trasferire gli ovociti in una capsula di Petri da 35 millimetri contenente due millilitri di MBS.
Quindi, sotto uno stereomicroscopio, usa un anello di platino per separare gli involucri esterni dai follicoli semplicemente spingendo via l'ovocita nudo. Conservare gli ovociti denudati fino al momento dell'uso. In questo esperimento, gli ovociti di Xenopus individuati meccanicamente sono stati micro-iniettati con un rivestimento di mRNA per le subunità del recettore GABA A.
Quindi gli strati di cellule follicolari sono stati rimossi. Gli ovociti sono stati voltaggio-bloccati a -80 millivolt negativi ed esposti a concentrazioni crescenti di GABA e alla presenza di THDOC, un potente modulatore allosterico positivo del recettore GABA A. Questo pannello mostra le ampiezze di corrente suscitate a seconda delle concentrazioni di GABA, indicando la sensibilità di questa combinazione di subunità verso il GABA.
L'equazione utilizzata era I(c)Imax/n)dove c è la concentrazione di GABA, EC50 è la concentrazione di GABA in presenza di un THDOC micromolare, suscitando un'ampiezza di corrente semimassima. Imax è l'ampiezza massima della corrente. I è l'ampiezza corrente e n è il coefficiente di Hill.
L'EC50 del recettore alfa quattro beta due delta GABA A ammontava a 0,41 0,12 micromolari e n era 0,76 0,04 Una volta padroneggiato, gli strati di cellule follicolari possono essere rimossi in mezz'ora se eseguiti correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per migliorare la procedura di espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare gli ovociti di Xenopus circondati da strati di cellule follicolari, la loro microiniezione con mRNA e la successiva rimozione degli strati di cellule follicolari.
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Panoramica
In questo articolo vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di follicoli singoli e per eseguire microiniezioni di RNA citoplasmatico in oociti di Xenopus. Viene inoltre presentato un metodo per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici che coinvolgono canali ionici attivati da ligandi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Elettrofisiologia
Sfondo
- Gli oociti di Xenopus sono comunemente utilizzati come sistema modello per lo studio dell'espressione proteica.
- I metodi classici spesso determinano bassi tassi di sopravvivenza degli oociti.
- Tecniche migliorate possono aumentare l'affidabilità e la velocità degli esperimenti.
- Comprendere la funzione dei canali ionici è fondamentale per varie ricerche biologiche.
Scopo dello studio
- Esprimere nuove proteine, in particolare canali ionici, in un sistema funzionale.
- Fornire informazioni sul funzionamento dei canali ionici.
- Migliorare i tassi di sopravvivenza degli oociti durante gli esperimenti.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di follicoli singoli da oociti di Xenopus.
- Microiniezioni di RNA citoplasmatico.
- Rimozione degli strati cellulari circostanti.
- Esperimenti elettrofisiologici con rapidi cambiamenti della soluzione.
Risultati principali
- Le procedure ottimizzate hanno determinato tassi di sopravvivenza più elevati degli ovociti.
- Migliorata velocità e affidabilità dell'espressione proteica.
- Espressione riuscita di canali ionici negli ovociti.
- Comprensione avanzata della funzionalità dei canali ionici.
Conclusioni
- I metodi descritti possono essere applicati a diverse proteine oltre ai canali ionici.
- Queste tecniche rappresentano un notevole progresso nello studio dei sistemi di espressione funzionale.
- Ulteriori ricerche possono sfruttare questi metodi per affrontare questioni biologiche più ampie.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Ottimizzato Xenopus protocolli di microiniezione negli oociti e di rimozione delle cellule follicolari consentono un'espressione funzionale robusta di canali ionici e proteine di membrana, supportando la validazione precoce delle target e la riduzione dei rischi meccanicistici nella ricerca biofarmaceutica&D. Il basso rumore di fondo endogeno del canale del sistema e il rapido scambio della soluzione facilitano saggi elettrofisiologici quantitativi, migliorando l'affidabilità predittiva nell'identificazione e nello screening dei composti promettenti. Questi metodi semplificano il passaggio dall'ipotesi molecolare al riscontro funzionale, riducendo l'ambiguità biologica in punti critici di svolta della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente l'analisi funzionale di canali ionici e trasportatori candidati in un sistema controllato.
- Permette la riduzione del rischio meccanicistico isolando l'attività specifica della proteina dal rumore di fondo endogeno.
- Facilita la valutazione quantitativa della farmacologia dei recettori attivati da ligandi per la validazione del bersaglio.
- Fornisce una piattaforma per test rapidi di ipotesi e triage del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Permette una preparazione riproducibile e scalabile di oociti per saggi elettrofisiologici successivi.
- Consente misurazioni quantitative standardizzate delle correnti per lo screening di composti.
- Supporta la prontezza del saggio per la valutazione ad alto rendimento di modulatori dei canali.
- Permette il riutilizzo della piattaforma per diversi bersagli proteici di membrana.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le risposte funzionali alla farmacologia dei canali ionici rilevante per la malattia, quando appropriato.
- Garantisce continuità dalla scoperta molecolare alla validazione preclinica della funzione del canale.
- Permette decisioni di avanzamento ponderate sul rischio, basate su dati elettrofisiologici quantitativi.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali per i canali ionici come bersagli terapeutici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questi protocolli ottimizzati con oociti di Xenopus collocano l'espressione funzionale e l'analisi elettrofisiologica all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta, l'identificazione di composti promettenti e la ricerca preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi riguardo alla funzione e alla farmacologia delle proteine di membrana.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili delle correnti per la valutazione dei composti.
- Analisi: Permette il calcolo di EC50, coefficiente di Hill e corrente massimale per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati molecolari a modelli preclinici per bersagli a canale ionico.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e adattabile per studi diversificati sull'espressione proteica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la capacità analitica dei saggi funzionali.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorità e l'avanzamento di programmi su canali ionici e trasportatori, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microiniezione, manipolazione degli oociti e registrazione elettrofisiologica.
- Richiede l'accesso a strumentazione specializzata per il voltage clamp e il cambio delle soluzioni.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione degli oociti e i protocolli del saggio.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse classi di proteine o tipi di ligandi.
- I parametri di temperatura e incubazione sono fondamentali per la vitalità degli oociti e il successo del saggio.
