Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia
December 31st, 2016
Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esprimere nuove proteine, come i canali ionici negli ovociti di Xenopus. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in qualsiasi campo che richieda un sistema di espressioni funzionali. I principali vantaggi delle varianti di questa tecnica sono la velocità, l'affidabilità e la migliore sopravvivenza degli ovociti.
Questo metodo può fornire informazioni sul funzionamento dei canali ionici. Inoltre, può essere applicato allo studio di qualsiasi altra proteina. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che i metodi classici portavano a un basso tasso di sopravvivenza degli ovociti.
Dopo aver rimosso i lobi delle ovaie dalle rane femmine secondo il protocollo di testo, posizionare i lobi nella soluzione sterile di Barth modificata integrata con penicillina e streptomicina. Tagliare i lobi per consentire l'accesso del tessuto all'ossigeno. Per individuare lo stadio da cinque a sei follicoli, usa una pinza per tenere l'ovaio e poi abbassa un'ansa di platino sui follicoli e ritira delicatamente l'ansa per interrompere il tessuto connettivo con il follicolo dal tessuto ovarico.
Separa gli ovociti dall'aspetto sano usando l'ansa di platino. Utilizzare una pipetta Pasteur di plastica con la punta tagliata a un diametro di 1,5 millimetri per trasferire i follicoli selezionati in una piastra di Petri di 35 millimetri di diametro. Dopo aver preparato i cRNA per il recettore GABA A e le pipette per microiniezione secondo il protocollo di testo, utilizzare olio di paraffina e una siringa da 10 millilitri con un ago sottile per riempire una pipetta per microiniezione.
Quindi montare la pipetta su un apparecchio per microiniezione costruito in casa. Utilizzando una pipetta con punta di plastica sterile, posizionare una goccia di soluzione di mRNA sul lato pulito di un pezzo di materiale termoplastico resistente all'umidità. Quindi immergere la punta della pipetta per iniezione nella gocciolina e accendere il motore per ritrarre lo stantuffo.
La soluzione di mRNA dovrebbe entrare nella pipetta e formare un'interfaccia visibile con l'olio. Quindi, ritrarre la punta della pipetta dalla gocciolina e applicare una pressione positiva all'interno della pipetta per iniezione. Una gocciolina di soluzione di mRNA dovrebbe formarsi sulla punta della pipetta per iniezione.
Utilizzando una piastra di Petri da 60 millimetri con rete di nylon incollata sul fondo e ricoperta di MBS per iniezione, allineare i follicoli con i loro poli vegetali rivolti verso l'alto. Con il micromanipolatore, posizionare la pipetta per iniezione su un singolo follicolo. Inserire l'ago per iniezione al centro del polo vegetale e applicare una pressione positiva all'interno della pipetta per iniettare 50 nanolitri di mRNA a una velocità di flusso di 0,6 microlitri al minuto.
Attendere da cinque a 10 secondi prima di rimuovere la punta della pipetta per iniezione dal follicolo per evitare la fuoriuscita dell'RNA messaggero. Trasferire i follicoli iniettati in una nuova piastra di Petri riempita con due millilitri di MBS. Metti il piatto in una cantinetta impostata a 18 gradi Celsius.
Incubare i follicoli iniettati da uno a sette giorni prima della registrazione, a seconda dell'identità della proteina appena espressa. Per rimuovere i follicoli, trasferire dieci follicoli iniettati in una provetta di vetro borosilicato contenente 0,5 millilitri di MBS, un milligrammo per millilitro di collagenasi e 0,1 milligrammi per millilitro di inibitore della tripsina. Immergere la provetta in un bagno d'acqua a 36 gradi Celsius e incubare i follicoli per 20 minuti.
La temperatura qui è critica perché un grado in più può uccidere gli ovociti. Sciacquare i follicoli trasferendoli in una seconda provetta contenente un millilitro di MBS a temperatura ambiente, e lasciarli nella provetta per una decina di secondi. Quindi trasferire i follicoli in una terza provetta contenente 0,5 millilitri di MBS a doppia concentrazione contenente quattro millimolari di EGTA e incubare i campioni a temperatura ambiente per quattro minuti, agitando di tanto in tanto le provette.
Il tempo di incubazione di quattro minuti è fondamentale per garantire che gli strati follicolari si stacchino dall'ovocita. Sciacquare i follicoli trasferendoli in un'altra provetta contenente un millilitro di MBS a temperatura ambiente, e lasciarli nella provetta per circa 10 secondi. Trasferire gli ovociti in una capsula di Petri da 35 millimetri contenente due millilitri di MBS.
Quindi, sotto uno stereomicroscopio, usa un anello di platino per separare gli involucri esterni dai follicoli semplicemente spingendo via l'ovocita nudo. Conservare gli ovociti denudati fino al momento dell'uso. In questo esperimento, gli ovociti di Xenopus individuati meccanicamente sono stati micro-iniettati con un rivestimento di mRNA per le subunità del recettore GABA A.
Quindi gli strati di cellule follicolari sono stati rimossi. Gli ovociti sono stati voltaggio-bloccati a -80 millivolt negativi ed esposti a concentrazioni crescenti di GABA e alla presenza di THDOC, un potente modulatore allosterico positivo del recettore GABA A. Questo pannello mostra le ampiezze di corrente suscitate a seconda delle concentrazioni di GABA, indicando la sensibilità di questa combinazione di subunità verso il GABA.
L'equazione utilizzata era I(c)Imax/n)dove c è la concentrazione di GABA, EC50 è la concentrazione di GABA in presenza di un THDOC micromolare, suscitando un'ampiezza di corrente semimassima. Imax è l'ampiezza massima della corrente. I è l'ampiezza corrente e n è il coefficiente di Hill.
L'EC50 del recettore alfa quattro beta due delta GABA A ammontava a 0,41 0,12 micromolari e n era 0,76 0,04 Una volta padroneggiato, gli strati di cellule follicolari possono essere rimossi in mezz'ora se eseguiti correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per migliorare la procedura di espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare gli ovociti di Xenopus circondati da strati di cellule follicolari, la loro microiniezione con mRNA e la successiva rimozione degli strati di cellule follicolari.
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Panoramica
Questo articolo descrive procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli e l'esecuzione di microiniezioni di RNA citoplasmatico negli ovociti di Xenopus. Presenta inoltre un metodo per rapidi cambi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici che coinvolgono canali ionici legati a ligandi.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Elettrofisiologia
Contesto
- Gli ovociti di Xenopus sono comunemente usati come sistema modello per studiare l'espressione proteica.
- I metodi classici spesso risultano in bassi tassi di sopravvivenza degli ovociti.
- Le tecniche migliorate possono aumentare l'affidabilità e la velocità degli esperimenti.
- Comprendere la funzione dei canali ionici è cruciale per vari studi biologici.
Obiettivo dello studio
- Esprimere nuove proteine, in particolare i canali ionici, in un sistema funzionale.
- Fornire informazioni sul funzionamento dei canali ionici.
- Migliorare i tassi di sopravvivenza degli ovociti durante gli esperimenti.
Metodi utilizzati
- Isolamento di singoli follicoli dagli ovociti di Xenopus.
- Microiniezioni di RNA citoplasmatico.
- Rimozione degli strati cellulari circostanti.
- Esperimenti elettrofisiologici con rapidi cambi di soluzione.
Principali risultati
- Le procedure ottimizzate hanno portato a tassi di sopravvivenza degli ovociti più elevati.
- Migliorata velocità e affidabilità dell'espressione proteica.
- Espressione di successo dei canali ionici negli ovociti.
- Migliorata comprensione della funzionalità dei canali ionici.
Conclusioni
- I metodi descritti possono essere applicati a varie proteine oltre ai canali ionici.
- Queste tecniche rappresentano un significativo avanzamento nello studio dei sistemi di espressione funzionale.
- Ulteriori ricerche possono sfruttare questi metodi per domande biologiche più ampie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Optimized Xenopus oocyte microinjection and follicular cell removal protocols enable robust functional expression of ion channels and membrane proteins, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The system's low endogenous channel background and rapid solution exchange facilitate quantitative electrophysiological assays, enhancing predictive confidence for lead identification and screening. These methods streamline the transition from molecular hypothesis to functional readout, reducing biological ambiguity at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of candidate ion channels and transporters in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating protein-specific activity from endogenous background.
- Facilitates quantitative assessment of ligand-gated receptor pharmacology for target validation.
- Provides a platform for rapid hypothesis testing and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, scalable preparation of oocytes for downstream electrophysiological assays.
- Enables standardized, quantitative current measurements for compound screening.
- Supports assay readiness for high-throughput evaluation of channel modulators.
- Allows platform reuse for diverse membrane protein targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant ion channel pharmacology when appropriate.
- Provides continuity from molecular discovery to preclinical validation of channel function.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative electrophysiological data.
- Supports translational biomarker development for ion channel targets.
Pipeline & Workflow Integration
These optimized Xenopus oocyte protocols position functional expression and electrophysiological analysis at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of membrane protein function and pharmacology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative current measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables EC50, Hill coefficient, and maximal current calculations for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models for ion channel targets.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse protein expression studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput of functional assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ion channel and transporter programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, oocyte handling, and electrophysiological recording.
- Demands access to specialized instrumentation for voltage clamp and solution exchange.
- Necessitates cross-team standardization of oocyte preparation and assay protocols.
- Adaptation may be needed for different protein classes or ligand types.
- Temperature and incubation parameters are critical for oocyte viability and assay success.
