Name: Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Impara le procedure ottimizzate per la microiniezione di RNA citoplasmatico negli ovociti di Xenopus e la rimozione degli strati cellulari follicolari. Questi metodi migliorano la sopravvivenza degli ovociti e l'affidabilità dell'espressione proteica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica 315230_156929/1. M.C.M. ha ricevuto una borsa di studio (Beca Chile Postdoctorado da CONICYT, Ministerio de Educacion, Cile).

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato locale del cantone di Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15). 1. Preparazione di Xenopus ovociti <ol><li> Mantenere rane (Xenopus laevis) su un 12 h / 12 h luce / buio ciclo in acqua che viene rigorosamente mantenuta a 20 ° C. </li><li> Rimuovere i lobi delle ovaie da rane femmina 9. NOTA: La rimozione dei lobi è uno stimolo per la rigenerazione, e spesso la qualità degli ovociti migliora con la chirurgia. L&#39;oocita è coperto da uno strato vitellina, uno strato di cellule del follicolo, e tessuto connettivo contiene i vasi sanguigni 21. L&#39;intera struttura è denominata &quot;follicolo.&quot; </li><li> Posizionare i lobi delle ovaie che sono densamente imballati con i follicoli che contengono gli ovociti in sterili di Barth Saline 7 (MBS) integrato con la penicillina e la streptomicina (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mmNaHCO 3, 0,82 mM MgSO 4, 0.41 mM CaCl 2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 mg / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina). </li><li> Single-out fase V-VI 21 follicoli. Tenere il lobo dell&#39;ovaio con una pinza. Abbassare l&#39;anello di platino (figura 1) nei follicoli e prelevare delicatamente il ciclo per distruggere il tessuto connettivo contenente il follicolo dal tessuto ovarico. NOTA: Fase V-VI 21 follicoli sono caratterizzati dalla loro dimensione (1.0 - 1,2 mm di diametro) e per il buon contrasto tra il pigmentata nell&#39;emisfero animale scuro e l&#39;emisfero vegetale giallastro. </li><li> Trasferire solo follicoli sani aspetto (cioè perfettamente sferiche e pigmentati intatta) ad un diametro Petri piastra da 35 mm con una pipetta di plastica Pasteur (intercettato torna ad un diametro di 1,5 mm di apertura). </li></ol> Nota: Il sistema di microiniezione qui descritto è derivato da quello riportato da Kressmann e Birnstiel 22. <ol><li> Preparare CRNAs dai rispettivi cDNA codificanti per le subunità della α 4 β 2 δ GABA A recettori mediante trascrizione in vitro, l&#39;aggiunta di una poli (A +) della coda, e RNA quantificazione mediante gel elettroforesi 23. </li><li> Preparare pipette microiniezione da capillari di vetro borosilicato (1,0 mm di diametro esterno (OD), diametro interno 0,58 mm (ID), 100 mm di lunghezza) con un estrattore micropipetta. Rompere le punte dei capillari di vetro sotto un microscopio con un micromanipolatore e microfilamenti per creare un diametro della punta di 12 - 15 micron con una punta smussata. </li><li> Backfill le pipette microiniezione con olio di paraffina con una siringa da 10 ml, e poi montare la pipetta microiniezione su un MICR autocostruitoApparecchiatura oinjection (Figura 2). NOTA: L&#39;apparato di iniezione oleodinamico homebuilt costituito da un motore griglia controllata da un interruttore a pedale. Un ulteriore interruttore cambia la modalità di rotazione del motore. Questo motore aziona una vite micrometrica (0,5 mm / giro) che avanza o si ritrae lo stantuffo di una siringa di vetro 10 ml. L&#39;iniezione è ad una velocità di circa 3 giri al minuto, 0,5 giro corrisponde ad una iniezione di 50 nL in un follicolo. La punta della siringa è collegato al tubo di politetrafluoroetilene parete spessa che è a sua volta collegato all&#39;ago iniezione tramite un brevissimo pezzo di tubo Tygon. Il capillare iniezione è mantenuto da un mandrino che è controllato da un micromanipolatore. L&#39;intero sistema è riempito con olio di paraffina. Eventuali bolle d&#39;aria devono essere evitati, in quanto saranno compromettere il sistema di iniezione. Il setup è illuminato con una sorgente di luce fredda. Un stereomicroscopio è necessario per il controllo ottico. I follicoli vengono visualizzati sotto la luce fredda con un stereomicroscope (40X di ingrandimento). Prestazioni del setup di iniezione è verificata l&#39;iniezione di tracciante radioattivo in ovociti di Xenopus. Un volume di 45 - 55 nL deve essere consegnato per iniezione. </li><li> Usando una pipetta con una punta di plastica sterili, verificare l&#39;installazione posizionando una goccia di acqua sterile sulla parte interna pulita di una termoplastico resistente all&#39;umidità (2 x 2 cm). Immergere la punta della pipetta iniezione in questo gocciolina, e poi girare il motore per ritrarre lo stantuffo (pressione negativa all&#39;interno della pipetta di iniezione). NOTA: acqua deve entrare nella pipetta e formare un&#39;interfaccia visibile con l&#39;olio. </li><li> Ritrarre la punta della pipetta dalla gocciolina e applicare una pressione positiva all&#39;interno della pipetta di iniezione. Una goccia d&#39;acqua dovrebbe formare sulla punta della pipetta di iniezione. </li><li> Preparare per l&#39;iniezione dei follicoli rivestendoli con i poli vegetali rivolto verso l&#39;alto negli interstizi di una maglia di nylon (G: 0,8 mm) incollati al fondo di un Pepiatto tri (60 mm) coperto di MBS. </li><li> Dispensare 2 ml di mRNA usando una pipetta con una punta di plastica sterile sulla parte interna pulita di un materiale termoplastico. Prendere l&#39;mRNA up nella pipetta di iniezione applicando pressione negativa all&#39;interno della pipetta di iniezione. </li><li> Posizionare la pipetta di iniezione su un follicolo individuo che usa il micromanipolatore. </li><li> Inserire l&#39;ago iniezione nel centro del polo vegetale e iniettare 50 nL di mRNA ad una portata di 0,6 ml / min applicando una pressione positiva all&#39;interno della pipetta. Attendere 5 - 10 s prima di rimuovere la punta della pipetta di iniezione dal follicolo per evitare mRNA fuga. NOTA: L&#39;mRNA deve essere iniettato nel polo vegetale (giallo) per evitare l&#39;iniezione nel nucleo, che si trova nell&#39;emisfero animale. </li><li> Trasferire i follicoli iniettati in un piatto Petri (35 mm) riempita con 2 mL di MBS. Porre la capsula in un dispositivo di raffreddamento di vino impostato a 18 ° C. Incubare i follicoli iniettati per 1 -7 d prima della registrazione, a seconda dell&#39;identità della nuova proteina espressa. </li></ol> 3. Spogliarello dei follicoli (Figura 3) NOTA: Come menzionato sopra, l&#39;ovocita ricoperta da uno strato vitellina, cellule follicolari e tessuto connettivo, che contiene i vasi sanguigni 24, è noto come un &quot;follicolo.&quot; Tutti i livelli tranne lo strato vitellina, che fornisce stabilità meccanica senza impedire l&#39;accesso delle soluzioni alla superficie cellulare, devono essere rimossi prima esperimenti elettrofisiologici. Il follicolo senza gli strati di cellule circostanti è già stato definito un ovocita &quot;dissodata&quot; 25. Questa operazione viene generalmente eseguita nello stesso giorno come gli esperimenti elettrofisiologici. <ol><li> Trasferimento dieci iniettato follicoli in una provetta di vetro borosilicato contenente 0,5 mL di MBS, 1 mg / ml di collagenasi, e 0,1 mg / mL inibitore della tripsina. Immergere il tubo in un bagno d&#39;acqua mantenuto a 36 ° C. incubare ilfollicoli per 20 minuti e agitare i tubi di tanto in tanto. </li><li> Sciacquare i follicoli trasferendoli ad un secondo tubo contenente 1 ml di MBS a temperatura ambiente. Lasciarli nel tubo per circa 10 s. </li><li> Trasferire i follicoli ad un terzo tubo contenente 0,5 mL di MBS doppiamente concentrati contenenti 4 mM etilenglicol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetraacetico (EGTA), e incubare per 4 min a RT. Agitare il tubo di tanto in tanto. NOTA: La soluzione ipertonica (MBS concentrati doppiamente) viene utilizzato per indurre il restringimento degli ovociti all&#39;interno di strati di cellule del follicolo, staccando così strati di cellule follicolari dalla ovocita; EGTA viene aggiunto per inibire l&#39;attività collagenasi. </li><li> Sciacquare i follicoli trasferendoli ad un secondo tubo contenente 1 ml di MBS a temperatura ambiente. Lasciarli nel tubo per circa 10 s. </li><li> Trasferire gli ovociti ad una piastra di Petri (35 mm di diametro) contenente 2 mL di MBS. Sotto uno stereomicroscopio, separare le buste esterno dal follicoli dasemplicemente spingendo l&#39;ovocita nuda distanza utilizzando l&#39;anello di platino. NOTA: Le buste esterne degli ovociti bastone saldamente al piatto di coltura e possono essere facilmente separati dai ovociti. Alcuni ovociti spontaneamente perdere le loro buste esterne e saranno recuperati come ovociti denudati. Questa procedura comporta una preparazione relativamente stabile che mantiene l&#39;aspetto sferico degli ovociti. </li></ol> 4. Soluzione cambiano velocemente in tutto il ovociti <ol><li> Eseguire un esperimento morsetto di tensione, come descritto 9,26. </li><li> Cambiare la soluzione del sistema di perfusione gravità alimentata ruotando gli interruttori perfusione come richiesto dall&#39;esperimento. <ol><li> Applicare la soluzione di perfusione a 6 ml / min attraverso un capillare di vetro con diametro interno di 1,35 mm, la cui imboccatura è posto circa 0,4 mm dalla superficie del ovocita, per consentire rapidi cambiamenti nella concentrazione di agonista intorno ovocita. NOTA: Il tasso di cambiamento è stato in precedenza stimad come 70% in meno di 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi descritti in questo articolo si discostano da quelli utilizzati tradizionalmente 7-9. È standard per esporre i lobi delle ovaie ad un 1 a 2 h trattamento collagenasi 8; isolare intatti, ovociti denudati; e li inietta con mRNA utilizzando dispositivi di iniezione commerciali. Questa procedura classica presenta i seguenti inconvenienti: 1) Gli oociti sono suscettibili di essere danneggiato dalla lunga esposizione ad alte concentrazioni di collagenasi. 2) Gli ovociti denudati instabili devono...

Ovociti di Xenopus sono ampiamente utilizzati come un sistema di espressione (Riferimenti 2 - 3, e riferimenti ivi). Essi sono in grado di assemblare correttamente e integrare proteine ​​multisubunit funzionalmente attivi nelle loro membrane plasmatiche. Utilizzando questo sistema, è possibile indagare funzionalmente proteine ​​di membrana da solo o in combinazione con altre proteine, per studiare le proprietà dei mutanti, chimerici, o proteine ​​concatenati, e allo schermo potenziali farmaci. Vantaggi di usare ovociti rispetto ad altri sistemi di espressione eterologhi includono la semplice manipolazione delle cellule giganti, l&#39;alta percentuale di cellule che esprimono informazioni genetiche estranee, il semplice controllo dell&#39;ambiente dell&#39;ovocita mediante bagno di perfusione, e il controllo del potenziale di membrana . L&#39;inconveniente di questo sistema di espressione è la variazione stagionale osservato in molti laboratori 17-20. La ragione di questa variazioneè tutt&#39;altro che chiaro. Inoltre, la qualità degli ovociti è spesso osservato variare fortemente. I metodi tradizionali 7-9 hanno incluso l&#39;isolamento di lobi dell&#39;ovaia, l&#39;esposizione dei lobi ovariche di collagenasi per alcune ore, la selezione di ovociti denudati, e la microiniezione ovocita. Qui, una serie di alternative, procedure veloci sono riferito che ci hanno permesso di lavorare con questo sistema di espressione per più di 30 anni senza variazioni stagionali e piccole variazioni nella qualità degli ovociti. I metodi modificati e migliorati qui descritte per l&#39;isolamento di ovociti, microiniezione con cRNA, e la rimozione di strati di cellule follicolari possono essere usate per l&#39;espressione di qualsiasi proteina di scelta nel oocita di Xenopus. Il metodo molto semplice per modifiche soluzione veloce del mezzo intorno l&#39;ovocita può essere applicato allo studio di qualsiasi recettore ionotropico e dei vettori.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu; g penicillina/mL e 100 &mu; g streptomicina/mL</td></tr><tr><td>Anello di filo di platino</td><td>fatto</td><td></td><td></td>in casa</tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, tipo 701N</td></tr><tr><td>Tubo in politetrafluoroetilene a parete spessa</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1,0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>Olio di paraffina</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Rete in nylon, G: 0,8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; più ricco Beuteltuchfabrik AG Tubo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>in vetro borosilicato&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB Grado standard</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina di tipo I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>Jencons (Scientific) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID mm (per perfusione), azienda alternativa: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Capillare in vetro borosilicato</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&nbsp; 0.58 ID x 100 Lunghezza mm (per microiniezione)&nbsp;</td></tr><tr><td>Capillare in vetro borosilicato</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1,2 OD x 0,69 ID x 100 Lunghezza mm (per pinza di tensione a due elettrodi)</td></tr><tr><td>&gamma;-Acido amminobutirrico (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&alfa;,21-Diidrossi-5&alfa;-gravido-20-one (THDOC)</td><td>Motore grill Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>Micromotore DC Tipo 2230 con ingranaggio Tipo 22/2</td></tr><tr><td>vite micrometrica</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Pipette sterili per il trasferimento di plastica</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus ovociti: metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

L&#39;oocita di Xenopus come un sistema di espressione eterologa di proteine, è stato descritto da Gurdon et al. 1 ed è stato ampiamente utilizzato dalla sua scoperta (Riferimenti 2 - 3, e riferimenti ivi). Una caratteristica che rende l&#39;ovocita attraente per l&#39;espressione canale estero è la scarsa abbondanza di canali ionici endogeni 4. Questo sistema di espressione è dimostrato utile per la caratterizzazione di molte proteine, tra i quali canali ionici ligando-dipendenti. L&#39;espressione dei recettori GABA in oociti di Xenopus e la loro caratterizzazione funzionale è descritto qui, compreso l&#39;isolamento degli ovociti, microiniezioni con cRNA, la rimozione di strati di cellule follicolari e soluzione cambia veloci esperimenti elettrofisiologici. Le procedure sono state ottimizzate in questo laboratorio 5,6 e si discostano da quelli utilizzati di routine 7-9. Tradizionalmente, gli ovociti denudati vengono preparaticon un trattamento prolungato collagenasi di lobi ovariche a temperatura ambiente, e questi ovociti denudati sono microiniezione con mRNA. Utilizzando i metodi ottimizzati, diverse proteine di membrana sono state espresse e studiato con questo sistema, come ricombinanti recettori GABA A 10-12, canali del cloro ricombinanti umani 13, canali di potassio trypanosome 14, e un trasportatore myo-inositolo 15, 16. I metodi qui descritti possono essere applicati alla espressione di qualsiasi proteina di scelta in oociti di Xenopus, e la variazione rapida soluzione possono essere utilizzati per studiare altri canali ionici ligando-dipendenti.

Oociti di Xenopus sono stati individuati meccanicamente utilizzando un&#39;ansa di platino (Figura 1). Gli ovociti sono stati microiniettati con mRNA codificante per il GABA A subunità alfa 4, ß 2, δ, 0.5: 0.5: 2.5 fmol / ovocita (Figura 2). Dopo 4 d, strati di cellule follicolari sono stati rimossi (figura 3). Gli oociti sono stati bloccati tensione a -80 mV e esposte a concentrazioni crescenti ...

Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.

Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esprimere nuove proteine, come i canali ionici negli ovociti di Xenopus. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in qualsiasi campo che richieda un sistema di espressioni funzionali. I principali vantaggi delle varianti di questa tecnica sono la velocità, l'affidabilità e la migliore sopravvivenza degli ovociti.Questo metodo può fornire informazioni sul funzionamento dei canali ionici. Inoltre, può essere applicato allo studio di qualsiasi altra proteina. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che i metodi classici portavano a un basso tasso di sopravvivenza degli ovociti.Dopo aver rimosso i lobi delle ovaie dalle rane femmine secondo il protocollo di testo, posizionare i lobi nella soluzione sterile di Barth modificata integrata con penicillina e streptomicina. Tagliare i lobi per consentire l'accesso del tessuto all'ossigeno. Per individuare lo stadio da cinque a sei follicoli, usa una pinza per tenere l'ovaio e poi abbassa un'ansa di platino sui follicoli e ritira delicatamente l'ansa per interrompere il tessuto connettivo con il follicolo dal tessuto ovarico.Separa gli ovociti dall'aspetto sano usando l'ansa di platino. Utilizzare una pipetta Pasteur di plastica con la punta tagliata a un diametro di 1,5 millimetri per trasferire i follicoli selezionati in una piastra di Petri di 35 millimetri di diametro. Dopo aver preparato i cRNA per il recettore GABA A e le pipette per microiniezione secondo il protocollo di testo, utilizzare olio di paraffina e una siringa da 10 millilitri con un ago sottile per riempire una pipetta per microiniezione.Quindi montare la pipetta su un apparecchio per microiniezione costruito in casa. Utilizzando una pipetta con punta di plastica sterile, posizionare una goccia di soluzione di mRNA sul lato pulito di un pezzo di materiale termoplastico resistente all'umidità. Quindi immergere la punta della pipetta per iniezione nella gocciolina e accendere il motore per ritrarre lo stantuffo.La soluzione di mRNA dovrebbe entrare nella pipetta e formare un'interfaccia visibile con l'olio. Quindi, ritrarre la punta della pipetta dalla gocciolina e applicare una pressione positiva all'interno della pipetta per iniezione. Una gocciolina di soluzione di mRNA dovrebbe formarsi sulla punta della pipetta per iniezione.Utilizzando una piastra di Petri da 60 millimetri con rete di nylon incollata sul fondo e ricoperta di MBS per iniezione, allineare i follicoli con i loro poli vegetali rivolti verso l'alto. Con il micromanipolatore, posizionare la pipetta per iniezione su un singolo follicolo. Inserire l'ago per iniezione al centro del polo vegetale e applicare una pressione positiva all'interno della pipetta per iniettare 50 nanolitri di mRNA a una velocità di flusso di 0,6 microlitri al minuto.Attendere da cinque a 10 secondi prima di rimuovere la punta della pipetta per iniezione dal follicolo per evitare la fuoriuscita dell'RNA messaggero. Trasferire i follicoli iniettati in una nuova piastra di Petri riempita con due millilitri di MBS. Metti il piatto in una cantinetta impostata a 18 gradi Celsius.Incubare i follicoli iniettati da uno a sette giorni prima della registrazione, a seconda dell'identità della proteina appena espressa. Per rimuovere i follicoli, trasferire dieci follicoli iniettati in una provetta di vetro borosilicato contenente 0,5 millilitri di MBS, un milligrammo per millilitro di collagenasi e 0,1 milligrammi per millilitro di inibitore della tripsina. Immergere la provetta in un bagno d'acqua a 36 gradi Celsius e incubare i follicoli per 20 minuti.La temperatura qui è critica perché un grado in più può uccidere gli ovociti. Sciacquare i follicoli trasferendoli in una seconda provetta contenente un millilitro di MBS a temperatura ambiente, e lasciarli nella provetta per una decina di secondi. Quindi trasferire i follicoli in una terza provetta contenente 0,5 millilitri di MBS a doppia concentrazione contenente quattro millimolari di EGTA e incubare i campioni a temperatura ambiente per quattro minuti, agitando di tanto in tanto le provette.Il tempo di incubazione di quattro minuti è fondamentale per garantire che gli strati follicolari si stacchino dall'ovocita. Sciacquare i follicoli trasferendoli in un'altra provetta contenente un millilitro di MBS a temperatura ambiente, e lasciarli nella provetta per circa 10 secondi. Trasferire gli ovociti in una capsula di Petri da 35 millimetri contenente due millilitri di MBS.Quindi, sotto uno stereomicroscopio, usa un anello di platino per separare gli involucri esterni dai follicoli semplicemente spingendo via l'ovocita nudo. Conservare gli ovociti denudati fino al momento dell'uso. In questo esperimento, gli ovociti di Xenopus individuati meccanicamente sono stati micro-iniettati con un rivestimento di mRNA per le subunità del recettore GABA A.Quindi gli strati di cellule follicolari sono stati rimossi. Gli ovociti sono stati voltaggio-bloccati a -80 millivolt negativi ed esposti a concentrazioni crescenti di GABA e alla presenza di THDOC, un potente modulatore allosterico positivo del recettore GABA A. Questo pannello mostra le ampiezze di corrente suscitate a seconda delle concentrazioni di GABA, indicando la sensibilità di questa combinazione di subunità verso il GABA.L'equazione utilizzata era I(c)Imax/n)dove c è la concentrazione di GABA, EC50 è la concentrazione di GABA in presenza di un THDOC micromolare, suscitando un'ampiezza di corrente semimassima. Imax è l'ampiezza massima della corrente. I è l'ampiezza corrente e n è il coefficiente di Hill.L'EC50 del recettore alfa quattro beta due delta GABA A ammontava a 0,41 0,12 micromolari e n era 0,76 0,04 Una volta padroneggiato, gli strati di cellule follicolari possono essere rimossi in mezz'ora se eseguiti correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per migliorare la procedura di espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare gli ovociti di Xenopus circondati da strati di cellule follicolari, la loro microiniezione con mRNA e la successiva rimozione degli strati di cellule follicolari.

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Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia (Video) | JoVE Journal

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