Name: Una proteina metodo di preparazione per lhigh-throughput identificazione di proteine che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Scopri un metodo di immunoprecipitazione per identificare proteine che interagiscono con cofattori nucleari in cellule HEK 293. Questa tecnica LC-MS/MS consente di analizzare i meccanismi di regolazione trascrizionale.

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Questo studio è stato supportato dalla Fondazione Astellas per la Ricerca sui Disturbi Metabolici (HT), dalla Fondazione Scientifica Takeda (HT) e da una Società Giapponese per la Promozione della Scienza Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.

1. trasfezione <ol><li> Seed HEK293 cellule in piastre di coltura da 100 mm (2 x 10 6 cellule / piatto). Cultura le cellule in mezzo di Eagle modificato di Dulbecco supplementato con 10% di siero fetale di vitello, 100 ug / ml di streptomicina e 100 unità / ml di penicillina. Incubare le cellule in un incubatore umidificato al 5% di CO 2 e 37 ° C. </li><li> Il giorno successivo, trasfezione le cellule con 10 mg di FLAG-tagged ARIP4 plasmide con 40 ml di reagente di trasfezione secondo le istruzioni 11 del produttore. </li></ol> 2. Protein Extraction <ol><li> Circa 36 hr dopo la trasfezione, lavare le cellule con PBS ghiacciato e raccogliere le cellule con un raschietto. Trasferire le cellule in un 1,5 mltube e centrifugare è a 8000 xg per 2 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5x il volume di pellet di 0,4 tampone M KCl (buffer sale alta: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.4 M KCl, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x proteasi inibitore cocktail). Ruotare l&#39;impasto per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare la provetta a 17.700 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante (estratto whole-cell) in una nuova provetta 2 mL e aggiungere 3x il volume iniziale di 0 M KCl tampone (tampone di diluizione: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoetanolo, 1x inibitori della proteasi cocktail). </li><li> Eseguire un&#39;altra centrifugazione (17.700 xg per 10 min a 4 ° C) e trasferire il surnatante (estratto integrale cella) in una nuova provetta 2 ml. </li></ol> 3. immunoprecipitazione <ol><li> Durante la centrifugazione (2.4), lavare 50 ml di perline Anti-Flag con PBS, 0,1 M glicina-cloridrato, e poi 1 M Tris-cloridrato, seguita da lavaggio due volte con 0,1 M tampone KCl (Low buffer di sale: 20 mm Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerolo, 0,1% NP-40, 10 mM B-Mercaptoethanol, 1x inibitori della proteasi cocktail). La centrifugazione per questo processo di lavaggio viene eseguito a 2.000 xg per 1 min a 4 ° C. </li><li> Mescolare 50 ml di perline FLAG con gli estratti di cellule intere e ruotare delicatamente la miscela per 4 ore a 2-4 ° C (1% di estratto cellule intere dal punto 2.4 deve essere mantenuta a -80 ° C per un uso futuro come ingresso). </li><li> Trasferire il campione ad una colonna di spin micro (caduta per gravità). Mantenere il flusso continuo in una provetta da 1,5 ml, congelare con azoto liquido, e conservarlo a -80 ° C (verificare i livelli proteici sia l&#39;ingresso e flow-through utilizzando l&#39;analisi Western blot). </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,1 M KCl tampone (buffer Low sale) per lavare le perline FLAG (caduta di gravità). </li><li> Ripetere passaggio 3.4 almeno altre quattro volte (per un totale di cinque lavaggi). </li></ol> 4. eluizione <ol><li> Porre la colonna in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 2000 xg per 1 min; le perline si asciugheranno. </li><li> Chiudere la parte inferiore dellala colonna. </li><li> Aggiungere 50 ml (pari al volume di perline FLAG) di 0,1 M glicina-HCl (pH 2,5). </li><li> Agitare delicatamente il composto per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Porre la colonna in una nuova provetta da 1,5 ml e centrifugare a 2000 xg per 1 min. </li><li> La soluzione eluita viene neutralizzata con 10 ml di 1 M Tris-HCl (pH 8,0); mescolare bene pipettando o utilizzando una macchina vortice. </li></ol> 5. Alchilazione e tripsinizzazione <ol><li> Aggiungere 50 ml di 100 mM NH 4 HCO 3, 10 ml di CH 3 CN, e 2 ml di ditiotreitolo alla miscela (112 microlitri volume totale). </li><li> Incubare il campione per 30 minuti a 56 ° C. </li><li> Posizionare il campione a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di 333 mM iodoacetamide al campione e incubare al buio per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 10 ml di tripsina (33 ng / mL) alla miscela e incubare durante la notte a 37 ° C. </li></ol><ol><li> A seguito di tripsinizzazione durante la notte, trasportare il prodotto finale di un MS LC-impianto / MS o ad un terzo laboratorio di spettrometria di massa per l&#39;analisi 12. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
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<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

trasfezione efficiente è essenziale per ottenere un risultato di successo con questo protocollo. Di conseguenza, si consiglia di utilizzare analisi Western Blot per determinare i livelli di proteina FLAG-tagged immunoprecipitati. Questa fase permette di verificare che la proteina di interesse è correttamente sovraespresso e, inoltre, che il PI è stato eseguito con successo. livelli di proteina FLAG-tag dovrebbero essere controllati prima della spettrometria di massa. Un campione finta dovreb...

Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo importante in molte funzioni biologiche. In quanto tali, queste interazioni sono stati implicati nella trasduzione del segnale; proteine ​​di trasporto attraverso le membrane cellulari; metabolismo cellulare; e diversi processi nucleari, tra cui la replicazione del DNA, il DNA di riparazione danni, ricombinazione, e trascrizione 1, 2, 3, 4. Identificare le proteine ​​coinvolte in queste interazioni è quindi fondamentale per far progredire la nostra comprensione di questi processi cellulari. Immunoprecipitazione (IP) è una tecnica validata utilizzato per analizzare le interazioni proteina-proteina. Per facilitare l&#39;identificazione di proteine co-immunoprecipitazione, spettrometria di massa è spesso utilizzato 5, 6, 7, 8,9. Prendendo di mira un membro noto di un complesso proteico con un anticorpo, è possibile isolare il complesso proteico e per identificare successivamente i suoi componenti sconosciuti tramite spettrometria di massa. ARIP4 (recettore androgeno-interagendo proteina 4), un coregulator trascrizionale, interagisce con le proteine dei recettori nucleari, al fine di attivare o reprimere i suoi promotori bersaglio in un modo dipendente dal contesto 9, 10. Per comprendere meglio i meccanismi regolatori trascrizionali che regolano questi fattori nucleari, si descrive un metodo completo per purificare ed identificare ARIP4 proteine ​​che interagiscono con il sistema LC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (senza EDTA) (100x)</td><td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Colonne</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

una proteina metodo di preparazione per l&#39;high-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare utilizzando lc-ms / ms analysis

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

I coregolatori trascrizionali sono vitali per l'efficiente regolazione trascrizionale della struttura della cromatina nucleare. I coregolatori svolgono una varietà di ruoli nella regolazione della trascrizione. Questi includono l'interazione diretta con fattori di trascrizione, la modificazione covalente degli istoni e di altre proteine e l'occasionale alterazione della conformazione della cromatina. Di conseguenza, stabilire metodi relativamente rapidi per identificare le proteine che interagiscono all'interno di questa rete è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi regolatori sottostanti. L'identificazione del partner di legame proteico mediata da LC-MS/MS è una tecnica convalidata utilizzata per analizzare le interazioni proteina-proteina. Immunoprecipitando un membro precedentemente identificato di un complesso proteico con un anticorpo (occasionalmente con un anticorpo per una proteina marcata), è possibile identificare le sue interazioni proteiche sconosciute tramite analisi di spettrometria di massa. Qui, presentiamo un metodo di preparazione proteica per l'identificazione ad alto rendimento mediata da LC-MS/MS di interazioni proteiche che coinvolgono cofattori nucleari e i loro partner di legame. Questo metodo consente una migliore comprensione dei meccanismi di regolazione trascrizionale dei fattori nucleari bersaglio.

Abbiamo identificato un segnale forte ARIP4, circa 160 KDa, così come quelli di un controllo di esempio finto e diverse altre proteine sconosciute (Figura 1). Analisi LC-MS / MS identificato entrambi i peptidi complessi ARIP4 ei potenziali cofattori peptide all&#39;interno della frazione di perline FLAG (Tabella 1). p62 (Sequestosome1), un noto cofattore ARIP4 11 è stato identificato nell&#39;analisi (Tabella 1), ...

Abbiamo stabilito un metodo per la purificazione di proteine ​​di interazione coregolamentazione utilizzando il sistema LC-MS / MS.

Una proteina metodo di preparazione per l&#39;high-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le proteine che interagiscono con un cofattore nucleare mediante analisi LC-MS/MS. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali relative ai meccanismi trascrizionali nel campo della regolazione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo identificare le proteine che interagiscono con un cofattore nucleare.Inoltre, questo metodo ci permette di comprendere meglio i meccanismi regolatori della trascrizione dei fattori nucleari bersaglio. Raccogliere le cellule HEK 293 che esprimono ARIP4 con tag flag 36 ore dopo la transfezione, lavando il monostrato cellulare con PBS freddo e raccogliendo le cellule con una spatola per cellule. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri e quindi centrifugare a 8000g per due minuti a quattro gradi Celsius.Aspirare il sopranatante e risospendere il pellet cellulare in un volume di tampone ad alto contenuto salino pari a cinque volte il volume del pellet. Ruotare la miscela per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti di rotazione, centrifugare il tubo a 17.700g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, trasferire i soprannatanti in un nuovo tubo da due millilitri e aggiungere il buffer di diluizione fino a raggiungere un volume pari a tre volte quello del soprannatante. Eseguire un'altra centrifugazione, quindi trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da due millilitri. Durante la centrifugazione di 10 minuti, lavare 50 microlitri di perle anti-flag con PBS.Quindi centrifugare il tubo a 2000g per un minuto a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e ripetere i passaggi di lavaggio prima con glicina cloridrato 1 molare e poi con tris cloridrato 1 molare. Successivamente lavare due volte con tampone a bassa forza ionica.Successivamente, mescolare 50 microlitri di perle lavate con estratti di cellule intere. Ruotare delicatamente la miscela per quattro ore a due-quattro gradi Celsius. Quindi utilizzare una punta smussata per trasferire il campione in una colonna microspin e lasciare gocciolare la soluzione in un tubo da 1,5 millilitri.Congelare rapidamente il flusso in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius. Successivamente, lavare le perline con il tampone a bassa forza ionica per cinque volte. Per l'eluizione, posizionare la colonna in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 2000g per un minuto per asciugare le perline.Chiudere la parte inferiore della colonna e quindi aggiungere 50 microlitri di glicina cloridrato 1 molare. Agitare delicatamente la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, posizionare la colonna in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e centrifugare a 2000g per un minuto.Neutralizzare la soluzione eluita con 10 microlitri di cloridrato di tris uno molare e mescolare accuratamente mediante pipettaggio e vortex. Aggiungere 50 microlitri di bicarbonato di ammonio 100 millimolare. 10 microlitri di acetonitrile, due microlitri di dithiotreitolo e 50 microlitri del campione neutralizzato.Incubare per 30 minuti a 56 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lasciare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi aggiungere 10 microlitri di iodoacetammide 333 millimolare al campione e incubare al buio per 30 minuti a 37 gradi C. Aggiungere 10 microlitri di tripsina alla miscela e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo trasportare il prodotto finale in un impianto LC-MS/MS o in un laboratorio di spettrometria di massa terzo per l'analisi. Questa immagine mostra la colorazione argentica di ARIP4 marcato con epitopo flag espresso in cellule HEK 293 dopo immunoprecipitazione con un anticorpo specifico per il flag e separazione mediante elettroforesi. Come controllo, è stata eseguita una purificazione fittizia su cellule HEK 293 che non esprimevano proteine esogene.Utilizzando il nostro metodo, è possibile identificare cofattori nucleari putativi attraverso il fattore trascrizionale di interesse e approfondire ulteriormente la comprensione dei meccanismi regolatori della trascrizione.

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Vi presentiamo una variante del RAPIDO (immunoprecipitazione quantitativi combinazione con smontabile), approccio che è stato introdotto in precedenza per distinguere tra vero e falso interazioni proteina-proteina. Il nostro approccio è basato...

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

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L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

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Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

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Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Per la profilazione complesso ad alta risoluzione viene presentato un versatile protocollo BN-MS crioscillante utilizzando un microtoma.

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Una proteina metodo di preparazione per lhigh-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis (Video) | JoVE Journal

Una proteina metodo di preparazione per l'high-throughput identificazione di proteine che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis

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