Una proteina metodo di preparazione per l'high-throughput identificazione di proteine che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis
January 24th, 2017
Abbiamo stabilito un metodo per la purificazione di proteine di interazione coregolamentazione utilizzando il sistema LC-MS / MS.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le proteine che interagiscono con un cofattore nucleare utilizzando l'analisi LC-MS/MS. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative ai meccanismi trascrizionali nel campo della regolazione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo identificare le proteine che interagiscono con un cofattore nucleare.
Inoltre, questo metodo ci permette di comprendere meglio i meccanismi di regolazione trascrizionale dei fattori nucleari bersaglio. Raccogliere le cellule HEK 293 che esprimono ARIP4 marcato 36 ore dopo la trasvezione lavando il foglio cellulare con PBS ghiacciato e raccogliendo le cellule con un raschietto cellulare. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri e poi centrifugare a 8000 g per due minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cella in cinque volte il volume del pellet di High Salt Buffer. Ruotare il composto per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti di rotazione, centrifugare la provetta a 17,700 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi, trasferire i surnatanti in una nuova provetta da due millilitri e aggiungere il tampone di diluizione a tre volte il volume del surnatante. Eseguire un'altra cetrifugazione e quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da due millilitri. Durante la centrifugazione di 10 minuti lavare 50 microlitri di perle anti-bandiera con PBS.
Quindi centrifugare la provetta a 2000 g per un minuto a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e ripetere le fasi di lavaggio prima con 1 molare di glicina cloridrato e poi con un molare di tris cloridrato. Quindi lavare due volte con tampone a basso contenuto di sale.
Quindi, mescola 50 microlitri di perle lavate con estratti di cellule intere. Ruotare delicatamente il composto per quattro ore a una temperatura compresa tra due e quattro gradi Celsius. Quindi utilizzare una punta smussata per trasferire il campione in una colonna di micro centrifuga e lasciare che la soluzione goccioli in una provetta da 1,5 millilitri.
Congelare a scatto il flusso in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius. Quindi, lavare le perline della bandiera con un tampone a basso contenuto di sale cinque volte. Per eluire, posizionare la colonna in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 2000 g per un minuto per asciugare le perle.
Tappare il fondo della colonna e poi aggiungere 50 microlitri di 1 molare di glicina cloridrato. Agitare delicatamente il composto per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, inserire la colonna in una nuova provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 2000 g per un minuto.
Neutralizzare la soluzione eluita con 10 microlitri di tris cloridrato monomolare e mescolare bene mediante pipettaggio e vortex. Aggiungere 50 microlitri di bicarbonato di ammonio 100 millimolare. 10 microlitri di acetonitrile, due microlitri di ditiotreitolo e 50 microlitri di campione neutralizzato.
Incubare per 30 minuti a 56 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lasciare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi aggiungere 10 microlitri di iodoacetammide da 333 millimolari al campione e incubare al buio per 30 minuti a 37 gradi C.Aggiungere 10 microlitri di tripsina alla miscela e incubare per una notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo trasporta il prodotto finale in una struttura LC-MS/MS o in un laboratorio di spettrometria di massa di terze parti per l'analisi. Questa immagine mostra la colorazione con argento dell'epitopo bandiera marcato ARIP4 espresso in cellule HEK 293 dopo precipitazione immunitaria con un anticorpo specifico bandiera e separazione mediante elettroforesi. Come controllo, è stata eseguita una finta purificazione su cellule HEK 293 che non esprimevano proteine esogene.
Utilizzando il nostro metodo, è possibile identificare cofattori nucleari putativi attraverso il loro fattore trascrizionale di interesse e migliorare ulteriormente la nostra comprensione dei meccanismi di regolazione trascrizionale.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per purificare le proteine di interazione coregolatori utilizzando l'analisi LC-MS/MS. La tecnica mira a identificare le proteine che interagiscono con un cofattore nucleare, migliorando la nostra comprensione dei meccanismi di regolazione trascrizionale.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biochimica
- Regolazione genica
Sfondo
- Comprendere i meccanismi trascrizionali è cruciale nella regolazione genica.
- Identificare le interazioni proteiche può rivelare intuizioni sui processi cellulari.
- LC-MS/MS è uno strumento potente per analizzare le interazioni proteiche.
- Questo metodo si concentra sui cofattori nucleari e i loro ruoli regolatori.
Obiettivo dello studio
- Identificare le proteine che interagiscono con un cofattore nucleare.
- Chiarire i meccanismi di regolazione trascrizionale.
- Fornire un metodo affidabile per la purificazione delle proteine.
Metodi utilizzati
- Raccolta di cellule HEK 293 che esprimono ARIP4 con flag tag.
- Lavaggio delle cellule con PBS ghiacciato.
- Raccolta delle cellule utilizzando un raschietto per cellule.
- Centrifuga delle cellule a 8000g per due minuti a 4°C.
Risultati principali
- Identificazione riuscita di proteine che interagiscono con cofattori nucleari.
- Migliore comprensione dei meccanismi trascrizionali.
- Dimostrazione dell'efficacia del metodo LC-MS/MS.
- Possibili applicazioni nella ricerca sulla regolazione genica.
Conclusioni
- Il metodo fornisce uno strumento prezioso per studiare le interazioni proteiche.
- Contribuisce alla più ampia comprensione della regolazione genica.
- Studi futuri possono basarsi su questa tecnica per ulteriori intuizioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
