Una proteina metodo di preparazione per l'high-throughput identificazione di proteine che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis
24 gennaio 2017
Abbiamo stabilito un metodo per la purificazione di proteine di interazione coregolamentazione utilizzando il sistema LC-MS / MS.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le proteine che interagiscono con un cofattore nucleare utilizzando l'analisi LC-MS/MS. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative ai meccanismi trascrizionali nel campo della regolazione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo identificare le proteine che interagiscono con un cofattore nucleare.
Inoltre, questo metodo ci permette di comprendere meglio i meccanismi di regolazione trascrizionale dei fattori nucleari bersaglio. Raccogliere le cellule HEK 293 che esprimono ARIP4 marcato 36 ore dopo la trasvezione lavando il foglio cellulare con PBS ghiacciato e raccogliendo le cellule con un raschietto cellulare. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri e poi centrifugare a 8000 g per due minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cella in cinque volte il volume del pellet di High Salt Buffer. Ruotare il composto per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti di rotazione, centrifugare la provetta a 17,700 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi, trasferire i surnatanti in una nuova provetta da due millilitri e aggiungere il tampone di diluizione a tre volte il volume del surnatante. Eseguire un'altra cetrifugazione e quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da due millilitri. Durante la centrifugazione di 10 minuti lavare 50 microlitri di perle anti-bandiera con PBS.
Quindi centrifugare la provetta a 2000 g per un minuto a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e ripetere le fasi di lavaggio prima con 1 molare di glicina cloridrato e poi con un molare di tris cloridrato. Quindi lavare due volte con tampone a basso contenuto di sale.
Quindi, mescola 50 microlitri di perle lavate con estratti di cellule intere. Ruotare delicatamente il composto per quattro ore a una temperatura compresa tra due e quattro gradi Celsius. Quindi utilizzare una punta smussata per trasferire il campione in una colonna di micro centrifuga e lasciare che la soluzione goccioli in una provetta da 1,5 millilitri.
Congelare a scatto il flusso in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius. Quindi, lavare le perline della bandiera con un tampone a basso contenuto di sale cinque volte. Per eluire, posizionare la colonna in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 2000 g per un minuto per asciugare le perle.
Tappare il fondo della colonna e poi aggiungere 50 microlitri di 1 molare di glicina cloridrato. Agitare delicatamente il composto per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, inserire la colonna in una nuova provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 2000 g per un minuto.
Neutralizzare la soluzione eluita con 10 microlitri di tris cloridrato monomolare e mescolare bene mediante pipettaggio e vortex. Aggiungere 50 microlitri di bicarbonato di ammonio 100 millimolare. 10 microlitri di acetonitrile, due microlitri di ditiotreitolo e 50 microlitri di campione neutralizzato.
Incubare per 30 minuti a 56 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lasciare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi aggiungere 10 microlitri di iodoacetammide da 333 millimolari al campione e incubare al buio per 30 minuti a 37 gradi C.Aggiungere 10 microlitri di tripsina alla miscela e incubare per una notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo trasporta il prodotto finale in una struttura LC-MS/MS o in un laboratorio di spettrometria di massa di terze parti per l'analisi. Questa immagine mostra la colorazione con argento dell'epitopo bandiera marcato ARIP4 espresso in cellule HEK 293 dopo precipitazione immunitaria con un anticorpo specifico bandiera e separazione mediante elettroforesi. Come controllo, è stata eseguita una finta purificazione su cellule HEK 293 che non esprimevano proteine esogene.
Utilizzando il nostro metodo, è possibile identificare cofattori nucleari putativi attraverso il loro fattore trascrizionale di interesse e migliorare ulteriormente la nostra comprensione dei meccanismi di regolazione trascrizionale.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'identificazione di proteine che interagiscono con cofattori nucleari mediante analisi LC-MS/MS. Il metodo prevede l'immunoprecipitazione di un cofattore nucleare marcato con un'etichetta flag da cellule HEK 293, seguita da spettrometria di massa per individuare interazioni proteina-proteina rilevanti per la regolazione della trascrizione. Questo approccio consente ai ricercatori di chiarire le complesse reti che regolano l'espressione genica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Proteomica
- Regolazione trascrizionale
Sfondo
- I coregolatori trascrizionali sono essenziali per una regolazione efficiente della struttura della cromatina nucleare.
- I coregolatori interagiscono con i fattori di trascrizione, modificano gli istoni e le proteine e possono alterare la conformazione della cromatina.
- Comprendere le interazioni proteina-proteina all'interno di queste reti è fondamentale per decifrare i meccanismi di regolazione genica.
- La LC-MS/MS è una tecnica validata per identificare i partner di legame proteico.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo rapido e affidabile per identificare le proteine che interagiscono con cofattori nucleari.
- Facilitare l'analisi ad alto rendimento dei complessi proteici coinvolti nella regolazione della trascrizione.
- Potenziare la comprensione dei meccanismi molecolari alla base del controllo dell'espressione genica.
Metodi Utilizzati
- Espressione di ARIP4 con tag flag in cellule HEK 293.
- Raccolta delle cellule e lisi con tampone ad alto contenuto salino.
- Immunoprecipitazione con perle anti-flag per isolare i complessi proteici.
- Lavaggio sequenziale ed eluizione delle proteine legate.
- Digestione proteica con tripsina e preparazione del campione per LC-MS/MS.
- Analisi delle interazioni proteiche mediante spettrometria di massa.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di ARIP4 con etichetta flag e delle proteine associate da cellule HEK 293.
- La colorazione argentica ha confermato la presenza delle proteine immunoprecipitate.
- Gli esperimenti di controllo hanno validato la specificità del processo di purificazione.
- LC-MS/MS ha permesso l'identificazione di potenziali fattori di trascrizione nucleari che interagiscono come partner di legame.
Conclusioni
- Il protocollo descritto identifica in modo efficace le proteine che interagiscono con cofattori nucleari.
- Questo metodo rappresenta un progresso nello studio dei meccanismi regolatori della trascrizione.
- Fornisce una base per ulteriori esplorazioni delle reti proteiche nella regolazione genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione ad alto rendimento delle interazioni tra proteine cofattori nucleari mediante LC-MS/MS è fondamentale per ridurre i rischi nella fase iniziale della scoperta e chiarire le reti di regolazione trascrizionale. Questo flusso di lavoro consente ai team biofarmaceutici di verificare ipotesi meccanicistiche e di prioritizzare bersagli sulla base di evidenze dirette di interazioni proteina-proteina. L'integrazione di un'analisi solida della mappatura dell'interactoma nella fase di scoperta supporta la previsione con maggiore affidabilità e orienta le decisioni di selezione del portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'identificazione sistematica di cofattori nucleari che si legano a proteine bersaglio per la validazione funzionale.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando le vie di regolazione trascrizionale.
- Fornisce evidenze dirette relative a reti di interazione proteica coinvolte nella regolazione genica.
- Facilita la priorizzazione di bersagli con interazioni molecolari validate.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara complessi proteici validati per analisi quantitative successive mediante LC-MS/MS.
- Standardizza l'immunoprecipitazione e la preparazione del campione per un profilo riproducibile dell'interactoma.
- Genera dati quantitativi che supportano lo sviluppo di saggi e la prontezza per lo screening.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulle interazioni proteina-proteina.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati sull'interactoma con meccanismi trascrizionali rilevanti per la malattia quando i cofattori nucleari sono implicati nella patologia.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mappando reti di proteine regolatorie.
- Fornisce informazioni per decisioni di avanzamento corrette in base al rischio, basate su approfondimenti meccanicistici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa preparazione proteica e il flusso di lavoro LC-MS/MS si collocano all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, fornendo dati fondamentali sull'interattoma per la ricerca traslazionale successiva.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la mappatura delle interazioni dei cofattori nucleari.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per lo sviluppo di saggi e lo screening di composti.
- Analisi: Permette l'identificazione e la quantificazione basate sulla spettrometria di massa di complessi proteici.
- Ricerca traslazionale: Consente l'allineamento dei dati sulle interazioni molecolari con modelli di malattia quando pertinente.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro scalabile e riutilizzabile per la mappatura dell'interactoma attraverso diversi bersagli e programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento dei complessi proteici e l'analisi LC-MS/MS per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e l'efficienza del capitale basando il progresso sui dati di interazione diretta.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio basata su meccanismi molecolari validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immunoprecipitazione, nella chimica delle proteine e nelle analisi LC-MS/MS.
- Necessita dell'accesso a strumentazione di spettrometria di massa e a infrastrutture analitiche.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale delle procedure di preparazione dei campioni e dei protocolli di analisi dati.
- Adattabile a diversi cofattori nucleari e sistemi proteici marcati, previa ottimizzazione del protocollo.
- Dipende dalla specificità e dalla qualità dell'anticorpo per un'immunoprecipitazione affidabile.
