Isolamento rapido di BMPR-IB + derivate da tessuto adiposo cellule stromali per l'uso in un cranica difetto di guarigione Modello

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare popolazioni cellulari specifiche di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo e testarne l'attività osteogenica mediante un saggio in vivo. Il metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia rigenerativa craniofacciale, ad esempio in che modo le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo possano essere impiegate per generare tessuto osseo completamente funzionale in difetti ossei danneggiati. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che le cellule vengono rapidamente isolate da tessuto umano fresco, evitando così il tempo necessario per la coltura cellulare, che è noto alterare l'espressione genica e dei marcatori cellulari.

Le implicazioni di questa tecnica riguardano i pazienti con ampi difetti ossei, causati da cancro, trauma o infezione. In futuro potrebbe essere possibile isolare popolazioni cellulari di ASC e utilizzarle in modo rigenerativo. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, poiché la creazione del difetto calvarico è difficile da apprendere, principalmente perché il difetto viene realizzato su un cranio a forma di volta e perché è molto vicino alla dura madre.

Per questo protocollo, procurarsi del tessuto adiposo sottocutaneo proveniente dall'addome, dai fianchi o dalle cosce di un donatore umano sano, raccolto e conservato in un contenitore di aspirazione in plastica. Aggiungere al tessuto adiposo un volume uguale di PBS sterile e mescolare con agitazione delicata per 30 secondi. Lasciare sedimentare lo strato acquoso, quindi rimuoverlo utilizzando una pipetta di plastica da 10 millilitri.

Quindi, travasare il grasso in un contenitore di plastica di grandi dimensioni e aggiungere un volume uguale di miscela digestiva. Pulire il contenitore sigillato del grasso con etanolo al 70%, quindi sigillarlo con paraffina. Successivamente, agitare il contenitore a 180 rotazioni al minuto, in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, neutralizzare la digestione raddoppiando il volume della reazione con il mezzo standard. Centrifugare le cellule, rimuovere con attenzione il soprannatante e risospendere ogni pellet in 5 millilitri di mezzo standard. Quindi, filtrare tutte le sospensioni attraverso un filtro da 100 micron in un contenitore conico da 50 millilitri.

Centrifugare il filtrato a quattro gradi Celsius per 15 minuti a 300 G. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di buffer di lisi dei globuli rossi a temperatura ambiente. Una volta ottenuta una sospensione, lasciare agire per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire la lisi. Successivamente, centrifugare il tubo a temperatura ambiente per 15 minuti e completare i passaggi di separazione come indicato nel protocollo scritto.

Un'adeguata separazione cellulare è fondamentale per questo protocollo. In primo luogo, risospendere le cellule nel buffer FACS a un milione di cellule per 100 microlitri, mantenendole sul ghiaccio. Successivamente, trasferire almeno 10 milioni di cellule in un tubo da centrifuga in plastica posto sul ghiaccio e contrassegnato come BMPR-1B.

Trasferire un milione di cellule in un tubo su ghiaccio etichettato come non colorato e aggiungere un millilitro di buffer FACS. Etichettare le cellule rimanenti come non ordinate. Successivamente, aggiungere l'anticorpo al tubo BMPR-1B e mescolare con una leggera pipettatura per omogeneizzare.

Lasciare incubare questa miscela per il tempo indicato dal produttore. Quindi, centrifugare le cellule per l'ordinamento mediante FACS e risospendere con attenzione in un millilitro di tampone FACS. Successivamente, ripetere l'operazione e risospendere le cellule a un milione di cellule per millilitro.

Ora, filtrare tutte e tre le popolazioni cellulari attraverso filtri cellulari da 40 micron in provette FACS di vetro. Utilizzare 500 microlitri di buffer FACS per risciacquare le ultime cellule dai filtri. Preparare ora due provette di raccolta, per le popolazioni positive e negative all'anticorpo.

Caricare ciascuna con due millilitri di mezzo standard per colture cellulari, al citofluorimetro; eseguire prima le cellule non colorate e utilizzare i risultati per definire una finestra negativa per il marcatore fluorescente. Successivamente, utilizzando un ugello da 100 micron, separare le cellule colorate nei rispettivi tubi contenenti mezzo standard. Se possibile, mantenere questi tubi refrigerati a quattro gradi Celsius durante la separazione.

Procedere caricando le cellule nello scaffold come descritto nel protocollo testuale. Dopo aver anestetizzato l'animale, rimuovere i peli dalla zona chirurgica e detergere la pelle esposta con soluzione di povidone iodio seguita da etanolo al 70%, per tre volte. Quindi, coprire l'animale con un drappo, lasciando esposta la zona chirurgica.

Ora, utilizzando un bisturi con lama da 15, effettuare un'incisione sagittale mediana che si estenda sulla maggior parte del cranio dorsale. Successivamente, con pinze a denti fini, ritrarre la pelle sul lato destro dell'incisione per esporre l'osso parietale destro. Preparare il trapano con una punta da trapano a corona sterilizzata da quattro millimetri rivestita di diamante.

Quindi, praticare un difetto attraverso l'osso parietale, senza estendere il difetto oltre l'osso, lasciando intatto lo strato del dura madre. Ora, posizionare un'impalcatura contenente cellule o soluzione di controllo nel difetto e chiudere l'incisione cutanea con sutura continua in nylon. Successivamente, procedere con le procedure di cura del topo post-operatorio come indicato nel protocollo testuale.

Le scansioni micro-CT del difetto cranico eseguite il giorno dell'intervento mostrano chiaramente il nuovo difetto. Scansioni ripetute in momenti successivi mostrano che i difetti inoculati con cellule positive per BMPR-1B si richiudono più rapidamente rispetto a quelli trattati con cellule negative per BMPR-1B o cellule non ordinate. Quando la guarigione viene quantificata come percentuale di chiusura completa della ferita, la differenza risulta facilmente apprezzabile.

Successivamente, porzioni dei crani contenenti i difetti sono state decalcificate e colorate per identificare il nuovo tessuto osseo rigenerato e il controllo mediante la pentacromia di Movat, che distingue la cartilagine dall'osso e tutte le fasi intermedie di maturazione. Rispetto alle cellule non ordinate, le cellule positive per BMPR-1B hanno avuto un forte impatto sul processo rigenerativo, in particolare lungo i margini del difetto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del potenziale clinico di questo esperimento, nell'isolamento di ASC specifiche del paziente e nel loro utilizzo per la riparazione di difetti ossei.

Da questo esperimento possono derivare molte analisi successive per rispondere a ulteriori domande sulla guarigione dell'osteologia, come la FACS per l'isolamento di ASCs con diversi orientamenti di linea cellulare, la micro-TC per analizzare come diversi tipi cellulari e tessuti guariscano nel tempo, e il modello di difetto cranico in questo esperimento per generare idee per ulteriori studi sulla guarigione dell'osteologia. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani può essere estremamente pericoloso. Assicurati di adottare le opportune precauzioni, tra cui indossare guanti, utilizzare protezioni per gli occhi e smaltire correttamente tutti i rifiuti pericolosi.