Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare il programma di temporizzazione della replicazione dell'intero genoma di una cellula di scelta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della replica. Ad esempio, come cambia il programma di replicazione genomica in salute e malattia.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un modo semplice e veloce per mappare i tempi di replicazione in varie cellule e condizioni. L'uomo che scriveva la procedura fax sarebbe Dan Lehmann, un esperto di fax presso la Facoltà di Medicina. Questa procedura di solito inizia con almeno una o due volte dieci alla sesta cellula non sincronizzata a crescita rapida.

Per le cellule aderenti, aspirare e lavare ogni piastra con tre millilitri di PBS senza calcio o magnesio. Scartare il PBS e aggiungere un millilitro di tripsina-EDTA commerciale a ciascuna piastra. Incubare le cellule per cinque minuti, a 37 gradi Celsius, fino a quando non si staccano.

Aggiungere tre millilitri di terreno di coltura per neutralizzare la tripsina e raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 millilitri o in una provetta di polistirene da cinque millilitri. Mantieni le celle sul ghiaccio. Per iniziare la procedura, centrifugare le cellule a 300 x G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Aspirare e lavare le cellule con un millilitro di PBS freddo. Quindi, fai girare le cellule. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere il PBS e risospendere le cellule in 250 microlitri di PBS freddo.

Mentre si agita delicatamente il tubo, aggiungere lentamente 800 microlitri di meno 20 gradi Celsius, etanolo ad alta purezza al 100%. Questo porta alla nostra concentrazione finale di etanolo del 70-80 percento. Incubare le cellule su ghiaccio per 30 minuti.

Iniziare questa procedura centrifugando le celle fisse a 500 x G per dieci minuti a 4 gradi Celsius. Aspirare accuratamente il surnatante e lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS freddo. Centrifugare dopo ogni lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, aspirare il surnatante e risospendere ogni cellula con la seguente miscela PI. Un millilitro di PBS contenente cinque microlitri di RNAa da dieci milligrammi per millilitro e 50 microlitri di un milligrammo per millilitro di ioduro di propidio. Filtrare il campione attraverso una maglia da 35 micrometri in una provetta di polistirene da 5 millilitri.

Sigillare il tubo con parafilm. Incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Tenere i campioni al buio poiché lo ioduro di propidio è sensibile alla luce.

Le celle verranno ordinate utilizzando un fax. Usa il laser a 561 nanometri per differenziare le cellule in base alla loro intensità di ioduro di propidio. Per risultati ottimali, utilizzare l'ugello più piccolo consigliato per la dimensione specifica della cella.

Per la maggior parte delle celle, è di 85 micrometri. Usa un flusso costante e lento. Di solito fino a 300-500 eventi al secondo.

Utilizzando il gating, discriminare le cellule morte e i detriti subcellulari tracciando FCS rispetto a SSC. Dalle celle vitali, discriminare i doppietti tracciando la larghezza SSC rispetto all'altezza SSC, seguito da un grafico della larghezza FFC rispetto all'altezza FFC e un grafico della larghezza dello ioduro di propidio rispetto all'altezza dello ioduro di propidio. Per le cellule segnale vitali, disegnare un istogramma dell'intensità dell'area dello ioduro di propidio, che rappresenta il contenuto di DNA delle cellule.

Ordina le celle in condizioni di freddo in fasi G1 e S. Il gating per S dovrebbe essere largo e intromettersi nelle fasi G1 e G2. Mentre il gating G1 dovrebbe essere stretto e il più lontano possibile da S.

Per i tipi di cellule come, può essere difficile ottenere una buona distribuzione del ciclo cellulare. È molto critico assumere la fase G1 senza celle della fase S. Rimuovere i tubi con le celle ordinate dal fax.

Tenere i tubi sul ghiaccio seguendo il tipo. Dopo la selezione delle cellule, il DNA di ciascun campione viene purificato utilizzando un kit di purificazione del DNA commerciale seguendo le indicazioni del produttore. Successivamente, livellare il DNA con un ultrasuonatore focalizzato fino a raggiungere una dimensione media del picco target di 250 coppie di basi.

Verificare le dimensioni del DNA puro mediante elettroforesi. La distribuzione delle dimensioni consigliata è compresa tra 200 e 700 paia di basi con un picco di circa 250 paia di basi. Successivamente, la libreria viene preparata, sequenziata e analizzata come descritto nel protocollo di testo.

Viene mostrata una mappa del tempo di replicazione per l'intero cromosoma uno da fibroblasti embrionali di topo. Con uno sguardo più da vicino a una regione di circa 50 megabasi. I punti rappresentano il rapporto normalizzato tra S e G1 per le singole finestre, mentre la linea continua rappresenta i risultati della cubica in modo uniforme e dell'interpolazione.

Valori elevati da S a G1 corrispondono a una replica precoce, mentre valori bassi corrispondono a una replica tardiva. Le frecce rosse indicano esempi di regioni di replicazione a tempo costante e le frecce verdi indicano regioni di transizione temporale. Questa figura mostra la riproducibilità delle mappe temporali di replicazione tra triplicati di fibroblasti embrionali di topo, rispetto ai triplicati di cellule pre-B di topo nella stessa regione di 18 megabasi sul cromosoma uno di topo.

Le frecce arancioni, indicano esempi di regioni differenziali tra le linee cellulari. Una mappa di calore delle correlazioni tra i sei campioni conferma ulteriormente i risultati. Una volta padroneggiata, questa tecnica, dalla raccolta delle cellule alla generazione delle mappe, può essere completata in una settimana se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare mappe genomiche del tempo di replicazione per le cellule in crescita.