Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX
27 giugno 2017
Questo studio descrive metodi per la coespressione mediata da T7 di geni multipli da un singolo plasmide in Escherichia coli usando il sistema plasmid pMGX.
L'obiettivo generale di questa procedura è costruire operoni sintetici multigenici sotto il controllo di una RNA polimerasi T7 inducibile per esprimere contemporaneamente più proteine. Questo metodo può aiutare i ricercatori in biologia sintetica e biochimica, consentendo loro di costruire percorsi multienzimatici o studiare complessi proteici che dipendono dall'espressione concomitante di più approcci. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette l'espressione simultanea di più geni in Escherichia coli da un singolo plasmide.
Il procedimento sarà dimostrato da Mohamed Hassan, studente di dottorato, e da Angela Thompson, studentessa in programma cooperativo. Dopo aver ottenuto e amplificato i geni di interesse seguendo il protocollo descritto nel testo, preparare le reazioni di digestione per il primo gene di interesse e per il vettore pMGX. Utilizzare una reazione da 40 microlitri contenente da 0,5 a 1,5 microgrammi di DNA con l'enzima indel.
Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente aggiungere EcoRI e lasciare procedere la digestione per un'ulteriore ora. NdeI viene aggiunto prima di EcoRI per garantire una digestione efficace.
NdeI è sensibile alla lunghezza di DNA a doppio filamento su entrambi i lati del sito di restrizione. Aggiungerlo per primo garantisce che tagli il plasmide circolare completo. Caricare le reazioni di digestione su un gel di agarosio allo 0,7% ed eseguire l'elettroforesi dei campioni a 100 volt per 55 minuti.
Quindi, con un bisturi o una lametta puliti, escindere le bande del vettore e dell'inserto e posizionare i frammenti di gel escissi in provette da 1,5 millilitri. Utilizzare un kit di estrazione da gel seguendo il protocollo indicato per purificare il DNA. Preparare una reazione di ligazione da 20 microlitri contenente da 0,15 a 0,5 microgrammi di DNA del vettore, la quantità appropriata di inserto in base alle dimensioni del gene e un microlitro di T4 DNA ligasi.
In condizioni asettiche, scongelare sul ghiaccio aliquote da 100 microlitri di cellule di E. coli XL1-Blue chimicamente competenti per cinque minuti. Quindi aggiungere cinque microlitri delle reazioni di ligazione contenenti un gene di interesse alle cellule. Incubare le trasformazioni sul ghiaccio per 30 minuti.
Successivamente, sottoporre le cellule a uno shock termico di 45 secondi in un bagno a 42 gradi Celsius. Poi, posizionare le trasformazioni sul ghiaccio e aggiungere 200 microlitri di mezzo LB freddo. Lasciare le cellule in incubazione per due minuti.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius a 220 rotazioni al minuto per un'ora e distribuire 100 microlitri su piastre di agar LB contenenti un marcatore selettivo appropriato. Per analizzare le colonie alla ricerca di possibili trasformanti, confrontare il numero di colonie presenti sulla piastra di controllo negativo rispetto a quelle delle piastre di ligazione. È auspicabile un rapporto tra i conteggi delle colonie di uno a due.
Selezionare da quattro a otto colonie singole da ciascuna reazione di ligazione per inoculare 4 millilitri di LB con l'antibiotico appropriato. Incubare le colture a 37 °C e 220 rotazioni al minuto per tutta la notte. Utilizzando il kit per l'isolamento del DNA plasmidico, purificare il DNA plasmidico seguendo il protocollo indicato e preparare reazioni di digestione da 20 microlitri con 150-500 nanogrammi di DNA, usando un microlitro ciascuno di NdeI ed EcoRI.
Incubare le reazioni di digestione a 37 gradi Celsius per due ore. Per inserire il gene due nel vettore pMGX contenente il gene uno, preparare una reazione di digestione da 40 microlitri contenente da 0,5 a 1,5 microgrammi di DNA vettoriale contenente il primo gene di interesse e un microlitro di AVR2. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 1,5 ore prima di aggiungere 1,5 microlitri di fosfatasi intestinale di vitello.
Incubare per ulteriori 30 minuti. Successivamente, preparare una reazione di digestione in un volume di 40 microlitri contenente da 0,5 a 1,5 microgrammi del vettore pMGX che contiene il secondo gene di interesse. Utilizzando un microlitro di AVR2 e xpol.
Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per due ore. Eseguire l'elettroforesi dei digesti di restrizione su gel di agarosio allo 0,7%. Utilizzare una gomma da scalpelletto pulita per escindere le bande dell'inserto e del vettore come dimostrato in precedenza.
Dopo aver estratto il DNA plasmidico e quantificato il campione secondo il protocollo descritto, impostare una reazione di ligazione utilizzando un rapporto inserto:vettore di 3:1 tra il gene 2 e pMGX-yfg1. Includere un controllo negativo utilizzando solo pMGX-yfg1. Trasformare cinque microlitri di ogni reazione in cellule XL1-Blue come mostrato in precedenza.
Confrontare quindi il numero di colonie sulle piastre di controllo negativo e di ligazione. Se sono presenti un elevato numero di colonie sulla piastra di controllo negativo, verificare il trattamento con CIP. Selezionare da quattro a otto colonie singole dalla reazione di ligazione e utilizzare ciascuna colonia per inoculare quattro microlitri di LB aggiunti dell'antibiotico appropriato.
Coltivare a 37 gradi Celsius e 220 rotazioni al minuto per tutta la notte. Dopo aver isolato e quantificato il DNA plasmidico come in precedenza, verificare l'inserzione efficace del secondo gene impostando una reazione di digestione contenente da 150 a 500 nanogrammi di DNA e un microlitro di EcoRI. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per due ore.
Per scopi di screening si consiglia EcoRI, ma in alcuni casi EcoRI può generare due o più inserti di dimensioni simili, difficili da distinguere su un gel. Per garantire il successo, si dovrebbe utilizzare un enzima di digestione restrittiva alternativo, come NdeI. Separare le reazioni di digestione su un gel di agarosio, cercando una banda corrispondente alle dimensioni del gene inserito 2.
Clonare ulteriori geni nel plasmide seguendo il protocollo descritto nel testo. Per generare il plasmide policistronico, i cinque geni sono stati inizialmente clonati in un plasmide adatto, pMGX A. Questa figura mostra pCR-Blunt-yfg1 e pCR-Blunt-yfg2 nel plasmide pMGX A, nonché pMGX A digerito con indel ed EcoRI. Per clonare i primi due geni in pMGX A, il plasmide è stato digerito con indel ed EcoRI.
Dopo il clonaggio, i vettori pMGX-yfg1 e pMGX-yfg2 sono stati digeriti con AVR2 e xpol per confermare l'ottenimento di cloni positivi. Questa figura mostra il vettore pMGXyfg1 digerito con AVR2 e il vettore pMGX-yfg2 digerito con AVR2 e xpol per isolare il gene di interesse due. L'inserto risultante è stato clonato in pMGX-yfg1 per creare il vettore pMGX-yfg1 due.
Come mostrato qui, la digestione di pMGX-yfg1 due con EcoRI ha confermato il corretto clonaggio del gene di interesse numero due all'interno di pMGX-yfg1. Questa immagine del gel illustra la differenza tra plasmidi digeriti che presentavano l'inserzione in orientamento corretto o in orientamento inverso. Un inserzione in orientamento inverso avrebbe due siti EcoRI in prossimità, rendendo i frammenti risultanti di 50 paia di basi non rilevabili sul gel e il vettore più grande.
Infine, dopo aver generato un vettore di espressione policistronico a cinque geni, un'analisi mediante western blot delle proteine espresse conferma che tutte e cinque le proteine sono state espresse da un singolo vettore. Si noti che la proteina prodotta da yfg5 ha le stesse dimensioni di yfg1 e non viene separata sul gel. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre o quattro giorni per ogni gene inserito nel vettore pMGX, se eseguita correttamente.
Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di trattare e linearizzare il vettore con una fosfatasi come la fosfatasi dell'intestino bovino al fine di defosforilare i cinque estremi del vettore. Dopo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori esperimenti, come l'espressione multigenica in vivo, per caratterizzare e sfruttare i percorsi biosintetici nella produzione di composti naturali o per studiare complessi proteina-proteina. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia sintetica per produrre carboidrati complessi ed E.Coli geneticamente modificati.
Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come implementare il sistema di espressione multigenica in E.coli.
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Panoramica
Questo studio descrive metodi per la co-espressione mediata da T7 di più geni da un singolo plasmide in Escherichia coli, utilizzando il sistema plasmidico pMGX. La tecnica consente ai ricercatori di costruire operoni sintetici multigenici per l'espressione simultanea di proteine.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Sintetica
- Chimica Biologica
- Ingegneria Genetica
Sfondo
- Il sistema della RNA polimerasi T7 è ampiamente utilizzato per l'espressione genica.
- La co-espressione di più proteine è fondamentale per lo studio dei complessi proteici.
- Escherichia coli funge da ospite comune per l'espressione proteica.
- L'uso di un singolo plasmide per geni multipli semplifica il processo di clonaggio.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per esprimere contemporaneamente più geni.
- Facilitare la costruzione di vie multienzimatiche.
- Potenziare lo studio delle interazioni e dei complessi proteici.
Metodi Utilizzati
- Amplificazione dei geni di interesse.
- Preparazione delle reazioni di digestione per i geni e il plasmide pMGX.
- Utilizzo di enzimi indel per la manipolazione del DNA.
- Dimostrazione della procedura da parte dei membri del laboratorio.
Risultati principali
- Co-espressione riuscita di geni multipli in E. coli.
- Dimostrazione dell'efficienza del metodo nella produzione di proteine.
- Potenziali applicazioni in biologia sintetica e biochimica.
- Illustrazione del processo mediante una dimostrazione di laboratorio dettagliata.
Conclusioni
- Il metodo di co-espressione mediato da T7 è efficace per l'espressione di più geni.
- Questa tecnica può favorire la ricerca sui complessi proteici.
- Studi futuri potrebbero esplorare ulteriori applicazioni in biologia sintetica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'espressione concomitante efficiente di molteplici proteine è fondamentale per la biologia sintetica, l'ingegneria di percorsi metabolici e lo studio dei complessi proteici nella ricerca biofarmaceutica&D. Il sistema pMGX mediato da polimerasi T7 a espressione inducibile consente l'espressione simultanea di diversi geni da un singolo plasmide in E. coli, semplificando l'assemblaggio e la validazione funzionale di complessi moduli biosintetici. Questa capacità consente una prototipazione rapida e una riduzione dei rischi associati a sistemi biologici multicomponente in fasi critiche di scoperta e precliniche.
Applicazioni Strategiche nella R&D di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi di percorsi multigenici e di interazioni proteina-proteina in un sistema controllato.
- Facilita la riduzione dei rischi biologici consentendo la validazione funzionale di operoni sintetici complessi.
- Supporta la previsione attendibile negli studi di assemblaggio del percorso e di interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi validati di espressione multiproteica per flussi di lavoro di screening successivi.
- Migliora la riproducibilità dei saggi standardizzando la co-espressione da un singolo vettore.
- Consente piattaforme scalabili e riutilizzabili per la valutazione di varianti di percorsi metabolici o complessi proteici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea con le strategie traslazionali dei biomarcatori consentendo l'espressione di moduli multi-proteici rilevanti per la malattia.
- Permette una continuità dalla progettazione del percorso sintetico alla validazione preclinica in sistemi microbici.
- Riduce il rischio nello sviluppo di percorsi ingegnerizzati per applicazioni terapeutiche o produttive.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema pMGX si integra nel percorso di scoperta, dalla progettazione iniziale di biologia sintetica fino all'identificazione del percorso guida e alla validazione preclinica in E. coli.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici consentendo l'assemblaggio rapido ed espressione di costrutti multigenici.
- Screening: Fornisce sistemi multiproteici pronti per saggi, riproducibili, per studi funzionali e sulle interazioni.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi sull'espressione proteica, confermati da western blot e analisi di restrizione, per confrontare configurazioni di percorsi metabolici.
- Ricerca traslazionale: Facilita la continuità preclinica per moduli biosintetici ingegnerizzati rilevanti per obiettivi terapeutici o produttivi.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare e standardizzata adattabile a svariati progetti di biologia sintetica e ingegneria proteica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi di percorsi multigenici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per l'espressione di più proteine.
- Valore strategico: Permette decisioni di avanzamento o interruzione più informate e un progresso efficiente in termini di capitale di sistemi biologici complessi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione basate su una valutazione del rischio di iniziative di biologia sintetica e ingegneria proteica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in clonaggio molecolare, digestione con enzimi di restrizione e trasformazione microbica.
- Necessita dell'accesso a strumentazione standard di biologia molecolare e strumenti analitici come elettroforesi su gel e western blotting.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro dei protocolli di clonaggio e screening per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a diversi insiemi genici e progetti di percorsi metabolici all'interno di sistemi di espressione in E. coli.
- Dipende da una accurata selezione degli enzimi e dalla preparazione del vettore per assicurare l'orientamento e l'espressione corretti del gene.
