Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

Nell'epidermide. L'immunoistochimica è un metodo efficace per localizzare proteine specifiche nel loro compartimento di espressione. In questo video, dimostriamo un metodo affidabile per la localizzazione immunoistochimica di proteine nell'epidermide, che utilizziamo regolarmente nel nostro laboratorio.

Ciao, sono Tammy del laboratorio del Dottor Turin, qui nell'edificio basso dell'Ottawa Health Research Institute, nel programma di malattie croniche. Oggi vi mostreremo un procedimento di immunohistochimica con anticorpi fluorescenti su sezioni di tessuto di epidermide murina inclusa in paraffina. Nel nostro laboratorio, abbiamo ottimizzato i protocolli per la localizzazione immunoistochimica di marcatori della differenziazione epidermica utilizzando tessuto fissato con BO'S.

Come parte dell'ottimizzazione, manteniamo la pelle piatta stendendola su un tovagliolo di carta prima della fissazione. Questa procedura comprende la dissezione, la fissazione dell'epidermide, la disidratazione, l'inclusione in paraffina, il taglio dei sezioni, la dewaxing, la reidratazione, lo smascheramento dell'antigene, l'etichettatura con anticorpi e, infine, il montaggio e la visualizzazione mediante fluorescenza in epifluorescenza. Cominciamo dunque.

Quando si utilizzano topi neonati, non è necessario rasare la pelle della schiena. Tuttavia, quando si lavora con topi più anziani che hanno il pelo, è necessario rasare la pelle della schiena in modo che non intralci il taglio delle sezioni. Durante la dissezione, è importante fare molta attenzione a non inserire la pinzetta nelle aree della pelle che si intendono utilizzare per il saggio.

Quello che facciamo è posizionare semplicemente la pinzetta lungo il bordo del punto in cui andremo a tagliare, quindi sollevare con molta attenzione e tagliare l'epidermide, ricordandosi di non toccare la zona che si desidera utilizzare per l'esperimento. Quando fissiamo la pelle, non vogliamo che si arrotoli e finisca nel tubo; vogliamo che rimanga ben piatta.

Quello che facciamo per agevolare questa operazione è appoggiare la pelle su un tovagliolo di carta in modo che rimanga piatta durante la fissazione. Ora che abbiamo la pelle ben distesa sul tovagliolo di carta, tagliamo i bordi o li rifiniamo per rimuovere le parti che potrebbero essere state danneggiate con la pinza. Successivamente, si taglia la pelle in piccoli pezzi di circa due millimetri per due millimetri.

Ora il tessuto verrà fissato. Dopo aver tagliato la pelle in pezzi di dimensioni gestibili, immergerla nella soluzione boin. Chiudere i tubi con tappo, avvolgere i tubi con perfil e posizionarli su un rocker.

Per un'incubazione notturna, è importante incubare nella soluzione boin solo per 16-18 ore. Periodi di fissazione più brevi o più lunghi danneggeranno il tessuto. L'incubazione è terminata.

Si risciacqua il tessuto con PBS e successivamente con una serie di lavaggi di etanolo utilizzando alcol al 30%, 50% e 70%. Si può notare che il BO è di colore giallo e che, durante i lavaggi, man mano che il BO viene diluito, il colore del lavaggio diventa sempre meno giallo. Si effettuano due lavaggi, ciascuno della durata di 30 minuti.

Dopo l'ultimo lavaggio in etanolo, i campioni vengono posti in etanolo fresco al 70% e possono essere conservati a quattro gradi Celsius fino all'ulteriore elaborazione, con alcune aperture di paraffina. L'inclusione. L'uso eccessivo di tessuti congelati comporta che l'integrità del tessuto è superiore e i campioni possono essere conservati per lunghi periodi di tempo. In generale, le strutture centrali producono risultati più riproducibili.

Tuttavia, se si dispone della struttura adeguata e di un operatore specializzato con le competenze necessarie, è possibile eseguire i tagli in sede. Imparare a realizzare sezioni di buona qualità è un'arte a sé stante. Per questo motivo, ricorriamo a una struttura centrale.

Dopo aver ricevuto levetelle dal laboratorio centrale, si può notare che il paraffina è presente sulle vetture. In forma di sottile film, le vetture vengono posizionate su un supporto avvolto con carta d'alluminio, proprio come una patata al forno, e incubate per cinque minuti a 55 gradi. Al termine dell'incubazione, svolgere rapidamente le vetture e immergerle in toluene per tre lavaggi di cinque minuti ciascuno.

È molto importante ricordare che questi lavaggi di cinque minuti devono essere accuratamente temporizzati, poiché un'incubazione troppo lunga non sarà favorevole ai campioni. Dopo i tre lavaggi e il toluene, eseguire un rapido risciacquo in etanolo al cento per cento. Poiché etanolo e toluene formano un precipitato che interferirebbe con l'esperimento, questo passaggio è fondamentale da ricordare.

Successivamente, i campioni vengono reidratati incubando le preparazioni: cinque minuti in etanolo al 95%, cinque minuti in etanolo al 70%, quindi due volte cinque minuti in acqua. A questo punto, i tessuti possono essere sottoposti a colorazione con ematossilina ed eosina (h e e). Utilizziamo anche la struttura centrale per questo scopo.

Per la svelatura dell'antigene, versare 500 ml di tampone citrato al 1x in un becher di plastica da un litro e immergervi i vetrini. Ricordarsi di rimuovere la manopola metallica e posizionare il becher nel forno a microonde. Riscaldare a potenza massima per due volte cinque minuti.

Ricordarsi di aprire la porta per raffreddare il forno a microonde tra le due incubazioni. Al termine della cottura a microonde, rimuovere i vetrini dal tampone citrato bollente e posizionarli in una vaschetta per colorazione contenente acqua tiepida. Utilizziamo semplicemente acqua del rubinetto tiepida e lo scopo di questo passaggio è quello di raffreddare gradualmente i vetrini dall'ebollizione fino alla temperatura ambiente.

Ora è possibile lavare i vetrini tre volte per cinque minuti in PBS e siamo pronti per iniziare l'immunohistochimica. La prima cosa da fare per iniziare la colorazione immunoistochimica è asciugare la zona intorno ai nostri campioni con un pezzo di carta da filtro. Per prevenire la cross-contaminazione degli anticorpi, delimitiamo l'area intorno ai nostri campioni con un bloccante liquido.

Preparare una camera umidificata posizionando un filtro di carta in una piastra di Petri. Inumidirlo con acqua, rimuovere l'acqua in eccesso e inserire i vetrini. Il motivo per cui si utilizza una camera umidificata è garantire che durante i periodi di incubazione i vetrini non si secchino.

È molto importante che i vetrini non si asciughino, poiché l'essiccazione aumenterà il fondo. I vetrini vengono bloccati in questo momento con il buffer di incubazione per 30 minuti. Dopo il bloccaggio, trasferire i vetrini nuovamente nel porta-vetrini e incubarli nel buffer di lavaggio.

Rimuovere il tampone in eccesso proprio come fatto in precedenza. Riposizionare il vetrino nella camera umidificata e incubare con l'anticorpo primario per un'ora, a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione di un'ora, riposizionare i vetrini nel portavetrini e lavarli con la soluzione di lavaggio per tre volte da 10 minuti ciascuna. Dopo i lavaggi, rimuovere l'eccesso di soluzione di lavaggio intorno al campione utilizzando carta da filtro. Riposizionare nuovamente i vetrini nella camera umidificata e incubare per un'ora a temperatura ambiente con l'anticorpo secondario; dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare con tre cambi di soluzione di lavaggio, per 15 minuti ciascuno.

Successivamente, eseguiamo un lavaggio per tre volte di cinque minuti ciascuno in PBS, rimuovendo tutti i liquidi in eccesso intorno al campione e asciugando il PBS dal retro del vetrino prima di applicare il coprioggetto sul vetrino. Utilizziamo un sistema mobile con DAB al 2,5%.

Per ridurre lo sbiadimento, aggiungere 80 microlitri goccia a goccia sui vetrini, avendo cura di non introdurre bolle d'aria. Quindi abbassare lentamente un'ampolla di copertura.

Avendo cura di non lasciare bolle d'aria. Le bolle sono un problema perché spesso si posizionano proprio sul campione, esattamente nel punto in cui si desidera scattare le immagini dopo che il preparato è asciutto. Ora siete pronti per esaminare i vostri vetrini.

Ecco un esempio di colorazione riuscita utilizzando un filtro FITC. Con un obiettivo 20x, si osserva la claudina sei associata a tutti gli strati basali superiori dell'epidermide. Il nostro laboratorio è molto interessato all'espressione e alla localizzazione delle claudine nell'epidermide.

Per quanto riguarda le giunzioni strette e la formazione della barriera alla permeabilità epidermica, vi abbiamo appena mostrato come eseguire un'immunoistochimica su pelle di topo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che si desidera che le sezioni di tessuto siano piatte e che si deve assicurare che i vetrini non si secchino tra un'incubazione e l'altra. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.