Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

Nell'epidermide. L'immunoistochimica è un mezzo efficace per localizzare proteine specifiche nel loro compartimento di espressione. In questo video, dimostriamo un metodo affidabile per l'immunolocalizzazione delle proteine nell'epidermide, che utilizziamo abitualmente nel nostro laboratorio.

Ciao, sono Tammy del laboratorio del Dr.Turin qui nell'edificio basso dell'Ottawa Health Research Institute nel programma per le malattie croniche. Oggi vi mostreremo una procedura per l'immunoistochimica utilizzando anticorpi fluorescenti su sezioni di tessuto dell'epidermide di topo incluse in paraffina. Nel nostro laboratorio, abbiamo ottimizzato i protocolli per la localizzazione immuno-localizzante dei marcatori di differenziazione epidermica utilizzando il tessuto fisso di BO.

Come parte dell'ottimizzazione, manteniamo la pelle piatta stendendola su un tovagliolo di carta prima di fissarla. Questa procedura prevede la dissezione dell'epidermide, la fissazione, la disidratazione, l'inclusione della paraffina e il taglio della sezione, la decerazione, la reidratazione, l'antigene, lo smascheramento, la marcatura degli anticorpi e, infine, il montaggio e la visualizzazione con epifluorescenza. Quindi iniziamo.

Quando si utilizzano topi neonati, non è necessario radere la pelle della schiena. Tuttavia, quando hai topi più anziani che hanno la pelliccia, devi radere via la pelle posteriore in modo che non intralci il taglio delle sezioni. Quando si esegue la dissezione, è necessario fare molta attenzione a non mettere il forcipe nelle aree della pelle che si desidera utilizzare per il test.

Quindi quello che facciamo è mettere la pinza attorno al bordo del punto in cui andremo a tagliare, e poi si solleva con molta attenzione, si taglia l'epidermide, ricordando di non toccare l'area che si desidera utilizzare per l'esperimento. Quando stiamo fissando la pelle, non vogliamo che la pelle si arrotoli e rimanga nel tubo. Vogliamo che sia bello e piatto.

Quindi quello che facciamo per aiutare questo è stendere la pelle su un tovagliolo di carta in modo che rimanga piatta mentre viene fissata. Quindi, ora che abbiamo la pelle bella e piatta sul tovagliolo di carta, quello che facciamo è tagliare i bordi o tagliarli per rimuovere le parti che potremmo aver danneggiato con la pinza. E poi si taglia la pelle in pezzi molto piccoli di circa due millimetri per due millimetri.

Ora il tessuto sta per essere riparato. Dopo aver tagliato la pelle in pezzi maneggevoli, la si immerge nella soluzione di boin. Tappare i tubi, avvolgerli con perfil e metterli su un bilanciere.

Per un'incubazione notturna, è importante incubare nella soluzione di boin solo da 16 a 18 ore. Periodi di fissazione più brevi o più lunghi danneggeranno la volontà dei tessuti. L'incubazione è terminata.

Si risciacqua il fazzoletto con PBS e poi si passa attraverso una serie di lavaggi con etanolo utilizzando il 30%, 50% e 70% di alcol. Si può vedere che il BO è di colore giallo e che man mano che si fanno i lavaggi, man mano che i doni vengono diluiti, il colore del lavaggio diventa sempre meno giallo. Ti lavi due volte per 30 minuti ogni volta.

Dopo l'ultimo lavaggio in etanolo, i campioni vengono posti in un etanolo fresco al 70% e possono essere conservati a quattro gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione di alcuni sfiati di paraffina. Incorporamento. L'uso eccessivo di tessuti congelati significa che l'integrità dei tessuti è superiore e i campioni possono essere conservati per lunghi periodi di tempo. In generale, le strutture core generano risultati più riproducibili.

Tuttavia, se si dispone della struttura e di un operatore dedicato che ha l'esperienza, le sezioni possono essere tagliate internamente. Imparare a tagliare buone sezioni è piuttosto una forma d'arte. Pertanto, utilizziamo una struttura di base.

Dopo aver ricevuto i vetrini dalla struttura Core, è possibile vedere che la paraffina è presente sui vetrini. Come una pellicola sottile, i vetrini vengono posti su una griglia avvolta con un foglio di alluminio, proprio come una patata al forno e incubati per cinque minuti a 55 gradi. Al termine dell'incubazione, srotolare rapidamente i vetrini e metterli in toluene per tre lavaggi di cinque minuti.

È molto importante ricordare che queste lavatrici di cinque minuti dovrebbero essere ben sincronizzate, incubare troppo a lungo e il toluene non sarà buono per i tuoi campioni. Dopo i tre lavaggi e il toluene, fai un rapido risciacquo con etanolo al cento per cento. Poiché l'etanolo e il toluene formano un precipitato che interferirà con l'esperimento, questo è un passaggio molto importante da ricordare.

Successivamente, i campioni vengono reidratati mediante vetrini di incubazione, cinque minuti in etanolo al 95%, cinque minuti in etanolo al 70%, quindi due volte cinque minuti in acqua. A questo punto, i tessuti possono essere processati per la colorazione con h ed e. A questo scopo utilizziamo anche l'impianto principale.

Per lo smascheramento dell'antigene, 500 mil di tampone citrato monouso in un becher di plastica da un litro e immergere i vetrini. Ricordati di rimuovere il manico di metallo e di mettere il bicchiere nel microonde. Microonde ad alta potenza per due volte cinque minuti.

Ricordandosi di aprire lo sportello per raffreddare il microonde tra le due incubazioni. Al termine del microonde, rimuovi i vetrini dal tampone citrato bollente e mettili in un piatto per la colorazione contenente acqua tiepida. Usiamo solo acqua calda del rubinetto e lo scopo di questo è raffreddare lentamente i vetrini dall'ebollizione alla temperatura ambiente.

Ora è possibile lavare i vetrini tre volte per cinque minuti in PBS e siamo pronti per iniziare con l'immunoistochimica. La prima cosa che dobbiamo fare per iniziare l'immunocolorazione è asciugare l'area intorno ai nostri campioni con un pezzo di carta velina. Al fine di prevenire la contaminazione incrociata degli anticorpi, delimitiamo l'area intorno ai nostri campioni con un bloccante liquido.

Preparare una camera umidificata inserendo una carta da filtro in una capsula di Petri. Immergilo con acqua, rimuovi l'acqua in eccesso e inserisci i tuoi scivoli. Il motivo per cui utilizziamo una camera umidificata è per garantire che durante i nostri periodi di incubazione i nostri vetrini non si secchino.

È molto importante che le diapositive non si asciughino perché il disegno aumenterà lo sfondo. I vetrini vengono bloccati in questo momento con un tampone di incubazione per 30 minuti. Dopo il blocco, trasferire nuovamente i vetrini nel rack per vetrini e incubarli nel tampone di lavaggio.

Rimuovi il buffer in eccesso proprio come hai fatto prima. Rimettere il vetrino nella camera umidificata e incubare con l'anticorpo primario per un'ora. A temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione di un'ora, rimettere i vetrini nello scaffale per vetrini e lavarli con un tampone di lavaggio per tre volte 10 minuti. Dopo i lavaggi, rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso intorno al campione con una carta velina. Rimettere i vetrini nella camera umidificata e incubare per un'ora a temperatura ambiente con l'anticorpo secondario dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare in tre cambi di tampone di lavaggio da 15 minuti ciascuno.

Successivamente, ci laviamo tre volte cinque minuti. Nel PBS, rimuovere i liquidi in eccesso che circondano il campione e rimuovere il PBS dal retro del vetrino per montare i vetrini coprivetrino sul vetrino. Usiamo il cellulare con il 2,5% di DAB co.

Per ridurre lo sbiadimento, aggiungere 80 microlitri di goccia per goccia ai vetrini. Facendo attenzione a non introdurre bolle. Quindi, molto lentamente, abbassate su un vetrino coprioggetti.

Facendo attenzione a non lasciare bolle. Le bolle sono dannose perché spesso atterrano proprio sul tuo campione, proprio dove vuoi scattare le foto dopo che il tuo cellulare è asciutto. Ora sei pronto per andare Guarda le tue diapositive.

Ecco uno sguardo a una colorazione riuscita utilizzando un filtro FITC. In un obiettivo 20x, vediamo Clain sei associato a tutti gli strati super basali dell'epidermide. Il nostro laboratorio è molto interessato all'espressione e alla localizzazione delle claudine nell'epidermide.

Per quanto riguarda le giunzioni strette e la formazione della barriera di permeabilità epidermica, vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'immunoistochimica sulla pelle del topo. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che si desidera che le sezioni di tessuto siano piatte e che si desidera assicurarsi che i vetrini non si asciughino tra un'incubazione e l'altra. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.