Name: La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Scopri la dissezione del tessuto gonadico in larve di zebrafish per analizzarne le proprietà molecolari. Questa tecnica consente di studiare la differenziazione sessuale in Danio rerio fino a 17 giorni post-fertilizzazione.

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Ringraziamo C Zhang per la cura dei pesci. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation naturali della Cina (31.171.074, 31.371.099 e 31.571.067 di GP) e dal talento Progetto Pujiang (09PJ1401900 a GP).

Esperimenti zebrafish sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Fudan University. Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo le procedure standard 20. 1. preparativi <ol><li> Coltivare 17 dpf e 25 dpf zebrafish larvale <ol><li> Trasferimento 2 maschi e 2 femmine zebrafish adulti (in buona salute, da 3 a 6 mesi di età, di laboratorio AB strain) ad un serbatoio traversata nel tardo pomeriggio prima del giorno traversata. Separare i maschi e le femmine con una barriera. La mattina seguente, rinfrescare l&#39;acqua della vasca e togliere la barriera per consentire loro di accoppiarsi. Raccogliere uova a 100 mm di Petri 1 a 2 h dopo la fecondazione. </li><li> Tenere circa 40 embrioni in un piatto 100 millimetri con 40 ml di media embrione (EM) a 28,5 ° C durante il periodo di sviluppo iniziale (4 giorni) e aggiornare la EM due volte al giorno. Trasferimento larve a 1 serbatoi L (40 larve per 300 dell&#39;acqua del sistema mL) e si nutrono con rotiferi dal vivo (fornitura completa, due volte al giorno), dopo 5 dpf.Live feed artemie, invece di dieta rotifero dopo 10 dpf. Trasferire il pesce nel sistema ricircolo dell&#39;acqua a 14 dpf 21. </li><li> Sollevare zebrafish larvale nel sistema di ricircolo dell&#39;acqua fino al 17 dpf o 25 dpf. Garantire il ciclo luce / buio è 14/10 h ed il pH valore dell&#39;acqua sistema è di circa 7.2. Misurare la lunghezza del corpo di 17 dpf (5,5 a 6,8 millimetri) e 25 dpf (da 8 a 11 mm) larve 22. </li></ol></li><li> Preparare 2% agar per la dissezione. <ol><li> Aggiungere 4 g di agar a 200 ml di acqua sterile. Scaldare la miscela in un forno a microonde fino a quando si scopre trasparente. </li><li> Raffreddare la soluzione di agar per circa 15 minuti, poi versarlo in 60 mm di diametro Petri piatti (circa 1/3 del volume della piastra). Conservare le piastre di agar solidificato a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Protocollo 1: sezionare il tessuto gonadico del 17 e 25 dpf Larve <ol><li> Aggiungere ghiaccio tritato nel serbatoio per anestetizzare 17 dpf larve. trasferire illarve anestetizzato a un 100 mm refrigerate Petri con la soluzione di 30 ml di freddo Ringer. Mantenere il pesce incubate in soluzione della refrigerate di Ringer per almeno 15 minuti per anestetizzare completamente le larve. </li><li> Trasferire le larve di una piastra di agar pre-raffreddata con un cucchiaio di plastica di piccole dimensioni. Immergere l&#39;intero corpo di pesce in 10 ml refrigerate soluzione di Ringer e delicatamente adagiarla su un fianco. </li><li> Effettuare le seguenti operazioni sotto il campo di visione stereo microscopio 25X. Bloccare il tronco di pesce con una pinzetta per la stabilizzazione. Strappare l&#39;addome longitudinalmente dall&#39;ano al cuore con un altro paio di pinzette. Rimuovere delicatamente la pelle ed i muscoli su un lato del corpo per esporre gli organi interni. </li><li> Rimuovere la massa di organi ventrali alla vescica natatoria con attenzione. Evitare di danneggiare gonade attaccato alla vescica natatoria. </li><li> Tagliare il collegamento tra la vescica natatoria e il corpo anteriore. Estrarre l&#39;intera vescica natatoria e tessuto gonadico delicatamente. NOTA: Nella maggior parte casos, il tessuto gonadico a 17 dpf contiene circostante tessuto epiteliale e protonephridium. Essi non sono facilmente separati l&#39;uno dall&#39;altro, ma a 25 dpf può essere facilmente separati. Gonade è collegato anche l&#39;ano. Una giunzione con gonadi sinistra e destra collegati tra loro alle ano sarà chiaramente visibile. </li><li> Utilizzare le pinzette per separare con attenzione il tessuto gonadico dalla vescica natatoria e ripulire i tessuti adiposi circostanti. </li><li> trasferire immediatamente il tessuto gonadico isolato ad un prechilled 1,5 mL provetta contenente una soluzione di 200 microlitri Ringer. Tenere la provetta in ghiaccio fino a quando tutti i tessuti gonadici sono separati dal larve. </li><li> Sezionare le gonadi di 25 DPF larve come descritto nei punti 2.1 - 2.7. </li></ol> 3. Protocollo 2: Analisi di espressione genica dei tessuti gonadici isolati <ol><li> Estrarre l&#39;RNA totale dai tessuti gonadici larvali. <ol><li> Trasferire i isolati tessuti gonadici ad un nuovo RNase-free 1.5 ml di tubo e rimuovere soluzione di Ringer. Aggiungere 100 microlitri soluzione di lisi. Vortice finché i tessuti sono completamente lisato. </li><li> Eseguire la procedura di estrazione dell&#39;RNA totale secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 1/10 volume di 10x DNasi I buffer e 1 ml di DNasi I per la soluzione di RNA e mescolare delicatamente. Incubare per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 1/10 del volume di reagente DNasi inattivazione alla soluzione di RNA. Incubare per 10 minuti a 70 ° C. Misurare la concentrazione di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro. Conservare a -20 ° C. </li></ol></li><li> Eseguire sintesi del DNA prima filamento <ol><li> Utilizzare un oligo (dT) Primer -linker per eseguire la sintesi del primo filamento di cDNA seguendo il protocollo del produttore. Aggiungere 1 a 2 mg di RNA per un volume totale di reazione a 20 ml. </li><li> Incubare la soluzione di reazione per 90 minuti a 45 ° C. Terminare la reazione mediante riscaldamento a 70 ° C per 5 min. </li><li> Aggiungere 1 ml RNasi H al cDNA cosìluzione per rimuovere l&#39;RNA residua. Mescolare delicatamente e centrifugare per 10 s a ~ 13.000 x g. Incubare per 20 minuti a 37 ° C. Aggiungere 20 ml di acqua priva di nucleasi. Conservare a -70 ° C. </li></ol></li><li> Eseguire fluorescente PCR quantitativa <ol><li> Eseguire qPCR su un sistema ciclatore con un colorante fluorescente. Utilizzare i seguenti PCR condizioni di ciclo: 35 cicli a 95 ° C per 15 s, Tm-5 ° C per 15 s, 68 ° C per 30 s. Utilizzare sequenze primer come segue: AMH (fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) e β-actina (fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il pesce zebra è diventato un modello potente ed è ampiamente utilizzato nello sviluppo e nella ricerca sulle malattie correlate. I metodi per l&#39;isolamento degli organi in zebrafish adulti come il cervello, il cuore, gonadi, e del rene, sono stati ben documentati 23, 24, 25. A causa delle piccole dimensioni e rimodellamento dinamica dei tessuti gonadici nella zebrafish larvale, isolamento di tessuto gonadico è un compito im...

Il principale determinante del sesso femminile nel selvaggio cromosoma zebrafish 4 è perso o modificato nel zebrafish addomesticato (vale a dire i ceppi più comuni di laboratorio) 1. Al contrario, hanno un sistema di determinazione del sesso poligenica accompagnato da fattori ambientali come la temperatura, l&#39;ipossia, la disponibilità di cibo e la densità di popolazione. I meccanismi dettagliati dello sviluppo sessuale zebrafish non sono pienamente compresi. Domande fondamentali come quando si verifica determinazione del sesso zebrafish, ciò che il segnale determinazione sessuale primaria (s) è / sono, e quali geni regolano il primo passo di trasformazione gonadi restano da risolvere 2, 3. Nel processo di sviluppo sessuale zebrafish, più tappe importanti sono state riconosciute. Nella fase iniziale di sviluppo, a partire dal 4 HPF (ore dopo la fecondazione) cellule germinali primordiali (PGC) sottoporsi specifica, migrazione cresta genitale eproliferazione. Numeri PGC e interazioni reciproche tra cellule germinali e cellule somatiche sono importanti per gonadi differenziazione 4. A 13 dpf (giorni dopo la fecondazione), le gonadi sono in fase indifferenziata. Con 17 DPF, le gonadi si sviluppano in ovaie bi-potenziali in entrambi i maschi e femmine futuri. La transizione apoptosi dipendente da ovaio al testicolo inizio alle 21 a 25 dpf e può continuare per diverse settimane. Da 35 dpf, il sesso della gonade è stata determinata e produzione di gameti sesso-specifico è in corso in entrambe le ovaie e testicoli 5, 6, 7. Fino ad oggi, sono stati proposti diversi geni candidati ei meccanismi di determinazione del sesso. Proteomica e analisi trascrittomica hanno isolato molti geni con espressione dimorfismo sessuale e questi geni sono stati utilizzati per studiare la differenziazione del sesso in zebrafish 8, </sup&gt; 9, 10. Ad esempio, in zebrafish larvale, il gene cyp19a1a è specificamente espresso nelle ovaie, ma non nel testicolo 11, 12. Inoltre, gene amh è debolmente espressa nelle cellule follicolo granulosa ovarica, ma fortemente nei testicoli cellule di Sertoli 13. Al contrario, gene vasa continuamente espresso nelle cellule germinali sia zebrafish maschile e femminile, che lo rendono adatto marcatore gonadi 14, 15. Indagare gonadici livelli di espressione genica è fondamentale per capire il meccanismo molecolare di determinazione del sesso e la differenziazione soprattutto nella fase ovaie bi-potenziale 3, 9. Tuttavia, le piccole dimensioni delle zebrafish larvale e corrispondentemente piccole gonadi complicare l&#39;isolamento di gonadal tessuti per ulteriori analisi molecolari. Precedenti studi utilizzati sezionati tutta la regione del tronco tra l&#39;opercoli e pori anale 16. Questa preparazione, anche se contenenti gonadi, costituito da più tessuti e organi. In alternativa, gli animali transgenici con espressione GFP specifico gonade come vasa: EGFP sono stati usati per l&#39;isolamento tessuto gonadico mediante fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e la cattura laser micro-dissezione 17, 18. Ma la loro applicazione diffusa è limitata. Qui, descriviamo una semplice procedura per isolare il tessuto gonadico da zebrafish larvale a 17 dpf e 25 dpf. Dimostriamo la posizione delle gonadi rispetto ad altri organi e isolare le gonadi morfologicamente intatte dai tessuti circostanti. Mostriamo ulteriormente i geni specifici gonade come vasa e cyp19a1a sono altamente espresso nelle gonadi isolate rispetto al tessuto tronco tramite PCR quantitativa (qPCR) analisi. Il presente protocollo permette l&#39;identificazione, l&#39;isolamento, la purificazione dell&#39;RNA e l&#39;amplificazione di geni specifici gonadici da zebrafish larvale, consentendo così successiva analisi molecolare del tessuto gonadica 19.

<table><tbody><tr><td>Piatto per coltura cellulare 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Per l'incubazione degli embrioni</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>Per un 1 L necessario: aggiungere 17,5 g di NaCl, 0,75 g di KCl e 2,9 g di CaCl&#183; 2H2O; aggiungere quindi 0,41 g di KH2PO4, 0,412 g di Na2HPO4 anidro e 4,9 g di MgSO4&#183; 7H2O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>Diluire 20x EM in acqua distillata</td></tr><tr><td>AGAROSIO G-10</td><td>Gene</td><td>121985</td><td>Per preparare le piastre di agar al 2%</td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Per l'isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Misuratore di vetro</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>Per preparare le piastre di agar al 2%</td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>Per riscaldare l'AGAR</td></tr><tr><td>Pinzetta DUMONT#5INOX</td><td>World Precision Instrument 500341</td><td></td><td>Per dissezione</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>Per dissezione</td></tr><tr><td>Apparecchiature per acqua pura</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer' </td><td></td><td></td><td>Per 1 L necessario: aggiungere 6,78 g di NaCl, 0,22 g di KCl, 0,26 g di CaCl2 e 1,19 g di Hepes; quindi riempire fino a 1 L; Regolare il pH a 7,2. Sterilizzare per filtrazione e conservare in un contenitore in policarbonato trasparente autoclavato.</td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Bagno in metallo</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>Modello GL-150</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M205 FA</td> Per centrifuga <td>fotomicrografica</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA su micro scala</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Per l'isolamento dell'RNA dai tessuti delle gonadi</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>Per la digestione del DNA nella soluzione di RNA</td></tr><tr><td>RevertAid Kit di sintesi del cDNA del primo filamento</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>Per la sintesi del cDNA del primo filamento</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>Per digerire l'RNA residuo nella soluzione di cDNA.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>Questo prodotto è una miscela master 2x a base di DNA polimerasi Taq per la PCR in tempo reale e&nbsp; applicabile per il saggio di intercalazione con SYBR Green I.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>Misurazione della concentrazione dell'RNA totale</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Hamburg</td><td>gene expression profiling</td></tr></tbody></table>

la dissezione del larvale zebrafish gonadica tissue

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Anche se zebrafish selvatici in possesso di un / ZW determinazione del sesso ZZ, zebrafish addomesticato hanno perso il cromosoma sessuale. Essi utilizzano un sistema di determinazione del sesso poligenica, in cui diversi geni distribuiti in tutto il genoma determinare collettivamente le identità sessuali di singoli pesci. Attualmente, i geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo delle gonadi e come funzionano rimangono sfuggente. Normalmente, isolando tessuto gonadico è il primo passo per esaminare i processi di sviluppo del sesso. Qui vi presentiamo una procedura per isolare il tessuto gonadico da 17 dpf (giorni dopo la fecondazione) e 25 dpf larve di zebrafish. Il tessuto gonadico isolato può essere successivamente esaminati dalla morfologia e l&#39;espressione genica.

Dissezioni delle gonadi sono state effettuate su AB strain zebrafish larvale. La figura 1 mostra tessuto tipico gonadi di zebrafish larvale a 17 dpf e 25 dpf. In primo luogo, la pelle ei muscoli di un lato dell&#39;addome viene tagliato per esporre gli organi interni. Dopo aver rimosso la massa degli organi interni, la vescica natatoria insieme gonade rimangono nel bagagliaio. Gonade era attaccato alla faccia ventrale vescica natatoria (freccia in <strong cl...

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare il tessuto gonadico di zebrafish larvale, che faciliterà le indagini della differenziazione sessuale zebrafish e manutenzione.

La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è isolare il tessuto gonadico da zebrafish larvali e analizzarne le proprietà molecolari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo sessuale dello zebrafish, come la conservazione dei geni nel controllo dello sviluppo delle gonadi e le basi molecolari dello sviluppo sessuale dello zebrafish. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i tessuti gonadici di larve di zebrafish già a partire da 17 giorni dopo la fecondazione possono essere dissecati per valutarne lo stato cellulare e biologico molecolare.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa delle piccole dimensioni e del rimodellamento dinamico dei tessuti gonadici nei zebrafish larvali. Per prepararsi alla dissezione gonadica, trasferire due zebrafish adulti maschi e due femmine da ciascun lato di un acquario di incrocio diviso. La mattina seguente, rinnovare l'acqua dell'acquario e rimuovere la barriera per avviare l'accoppiamento.Da uno a due ore dopo la fecondazione, raccogliere e trasferire circa quaranta uova in una piastra da 100 millimetri contenente 40 millilitri di mezzo embr

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive una procedura per l'individuazione e organi da sezionare il pesce zebra adulto.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Questo articolo descrive un approccio alla microdissect retine zebrafish con e senza epitelio pigmentato retinico collegato, da una a tre embrioni postfertilization giorni.

Microdissezione dei tessuti oculari Zebrafish embrionali

Un chiaro, metodo standardizzato per la dissezione e l'isolamento del cuore zebrafish a più stadi di sviluppo sono descritti. Tecniche di annotazione e la quantificazione vengono anche discussi.

Dissezione di cuore in larvale, Zebrafish giovanile e degli adulti, Danio rerio</em

Presentiamo un nuovo metodo di microsonda gastrica per i pesci zebra larvali che utilizza attrezzature standard per microiniezioni di embrioni e stereomicroscopia. Dimostriamo che la microsonda gastrica è una tecnica sicura ed efficiente, utile per somministrare quantità controllate di diversi materiali direttamente nella cavità intestinale delle larve di pesce zebra.

Microgavage di larve Zebrafish

Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Qui, presentiamo una serie standardizzata dei protocolli per osservare il solco superiore oculare, una struttura recentemente identificato, evolutivamente conservata nell'occhio dei vertebrati. Utilizzando larve di zebrafish, dimostriamo le tecniche necessarie per identificare i fattori che contribuiscono alla formazione e alla chiusura del solco superiore oculare.

Visualizzazione del solco superiore oculare durante l'embriogenesi Danio rerio

Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

Questo protocollo descrive la procedura per rimuovere il lobo ventrale del fegato nel pesce zebra adulto per consentire lo studio della rigenerazione epatica.

Epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto

L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Questo è un metodo comunemente usato per la dissezione delle gonadi di C. elegans seguita da crack congelato, che produce campioni della linea germinale per l'immunofluorescenza tramite colorazione anticorpale o per la semplice colorazione DAPI per visualizzare il DNA. Questo protocollo ha avuto successo per gli studenti universitari in un laboratorio di ricerca e in un'esperienza di ricerca universitaria basata sul corso.

C. elegans Dissezione delle gonadi e crack congelati per immunofluorescenza e colorazione DAPI

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Scopri la dissezione del tessuto gonadico in larve di zebrafish per analizzarne le proprietà molecolari. Questa tecnica consente di studiare la differenziazione sessuale in Danio rerio fino a 17 giorni post-fertilizzazione.

La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

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