Name: Ultrasuono-guida di iniezione intracardiaca di cellule staminali mesenchimali umane per aumentare Homing allintestino per lutilizzo in modelli murini di malattie intestinali infiammatorie sperimentali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Scopri l'iniezione intracardiaca guidata da ultrasuoni di cellule staminali mesenchimali umane nei topi per aumentare l'homing all'intestino infiammato. Questa tecnica migliora il successo della somministrazione con minima mortalità.

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Maneesh Dave è supportato dal dipartimento della difesa grant PR141774 e il Crohn e la colite Foundation di America Career Development Award. Il laboratorio di Fabio Cominelli è supportato da NIH concede DK042191 (F.C.), DK055812 (F.C.), DK091222 (F.C.) e DK07948 (F.C.). Il laboratorio di Arnold Caplan è sostenuto in parte da David L. ed E. Virginia Baldwin Foundation. Le agenzie di finanziamento non avevano alcun ruolo nell'analisi di studio di scrittura del manoscritto. Suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori.

tutti i topi esperimenti e procedure nello studio sono state approvate dalla Case Western Reserve University &#39; s istituzionale Animal Care e Comitato di uso. Le procedure sono state condotte in collaborazione per la valutazione e accreditamento di cura degli animali di laboratorio (AAALAC) accreditato presso la struttura. Il BM è stato aspirato nell'ambito di un protocollo approvato Università ospedali Institutional Review Board presso l'impianto di nucleo delle cellule staminali presso Case Western Reserve University dopo consenso informato.
 1. cultura e trasduzione del midollo osseo umano-derivato di cellule staminali mesenchimali (hMSCs) Nota: l'isolamento delle hMSCs è descritto in dettaglio in precedenti pubblicazioni 15 , 20.
<ol><li>Cultura isolato hMSCs in Dulbecco &#39; medium di glucosio (DMEM-LG) s per volta Eagle medio-bassa supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS). Le cellule a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2 in T175 boccette con 25 mL di terreno di crescita della coltura. Sostituire il mezzo ogni 3-4 giorni. Il giorno 14, eseguire il passaggio primario delle hMSCs.
	<ol><li>Quando le cellule raggiunge 80% confluenza, rimuovere completamente il vecchio mezzo e lavare delicatamente le cellule con 5 mL di soluzione fisiologica sterile tampone fosfato (PBS; per matracci di cultura del tessuto-75cm).</li>
		<li>Rimuovere il PBS dalla beuta e aggiungere 4 mL di acido di 0,25% tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA). Posto il pallone indietro nell'incubatore a 37 ° C per 5-10 minuti mantenere il tempo di esposizione più breve possibile.</li>
		<li>Quando la maggior parte delle cellule è diventati ben arrotondata o staccato dalla piastra di coltura, arrestare la reazione aggiungendo un volume di siero di vitello pari alla metà del volume di tripsina.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta per centrifuga dimensioni del caso. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti e poi rimuovere con attenzione il sovranatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 5 mL di terreno (DMEM-LG + 10% FBS) e contare le celle con un emocitometro. 
		Nota: A questo punto, le cellule possono essere una subcoltura o trasdotte con tripla reporter.</li>
	</ol></li> <li>Eseguire la trasduzione delle hMSCs con tripla reporter.
	<ol><li>Seme 1.5 x 10 6 cellule nel una T175 boccetta. Coltura le cellule in 25 mL di medium di crescita a 37 ° C, 95%, umidità e 5% CO 2. Attendere 24 ore per le cellule di allegare.</li>
		<li>Fare un virus cocktail in provette da 15 mL, come descritto nel riferimento 18.
		Bagno <ol><li>lentivirus di disgelo a 37 ° C in acqua. Aggiungere 160 µ l di una soluzione di solfato di proteamine 5 mg/mL in Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) a 8 mL di terreno di coltura (DMEM-LG + 10% FBS) per una concentrazione finale di 100 µ g/mL. Vortexare per 3 s. Aggiungi una molteplicità di virus dell'infezione (MOI) di 5 (1a volta scongelato) .</li>
		</ol></li> <li>Rimuovere il mezzo nel matraccio di cultura cellulare (punto 1.2.1) e aggiungere il cocktail di virus alle cellule. Incubare per 10 h a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Aggiungere 4 mL di solfato di proteamine 100 µ g/mL in 4 mL di DMEM-LG + 10% FBS e incubare per un ulteriore 14 h.</li>
	<li>Interrompere la trasduzione dopo 24 h sostituendo con 25 mL di medium (DMEM-LG + 10% FBS).</li>
	<li>Conferma efficienza di trasduzione valutando mRFP espressione di flusso cytometry 18. 
	Nota: Qui, hMSCs che erano trasdotte con oltre il 65% sono stati usati efficienza.</li>
	<li>Espandere le cellule sostituendo con 25 mL di terreno nuovo (DMEM-LG + 10% FBS) due volte a settimana. Coltura le cellule a 37 ° C, 95%, umidità e 5% CO 2. Cellule del passaggio dopo raggiungono la confluenza di 80%.</li>
	<li>Una volta raggiunto il numero di celle desiderato, eseguire trypsinization per fasi 1.1.2 - 1.1.4.</li>
	<li>Contare le celle e sospenderle in PBS sterile (1x) della concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule/75 µ l. mantenere le cellule sul ghiaccio per il trasporto alla macchina ad ultrasuoni. Per esperimenti, utilizzare hMSCs dai numeri di passaggio 2-5.</li>
</ol> 2. Ultrasuono-guida iniezione intracardiaca di hMSCs nel ventricolo di sinistra Nota: uso SAMP1/YitFc con topi piccolo-intestinale stabiliti della AKR/J di infiammazione e genere-abbinato e di età per gli esperimenti. Mantenere i topi SAMP e AKR esenti da patogeni in specifiche condizioni, dar loro da mangiare cibo del laboratorio standard e tenerli su cicli di luce/buio di 12 h. Qui, le iniezioni cardiache ultrasuono-guida sono state effettuate in una sala dedicata ecografia cardiaca esenti da patogeni che si trova nella struttura di ricerca animale CWRU che era disinfettata con un disinfettante e risciacquata con alcool al 70%. Personale di ricerca del laboratorio devono indossare indumenti protettivi, inclusi abiti, maschere per il viso con occhio scudi e guanti sterili durante le iniezioni intracardiache. Il calore del corpo del mouse deve essere mantenuto per tutta la durata della procedura.
<ol><li>Ha istituito il sistema di imaging prima anestetizzando il mouse a ultrasuoni. Per questo protocollo, è necessario utilizzare la macchina di ultrasuono progettata per ecocardiogramma del mouse.
	<ol><li>Accendere il potere e inizializzare il trasduttore (30 MHz) per impostare il nuovo studio.</li>
	</ol></li> <li>Anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando 3-4% isoflurane in ossigeno 100% ad una velocità di 0,2 - 0,5 L/min. mantenere l'animale per l'intera procedura con isoflurano 2% a 100% ossigeno tramite un cono di naso. Confermare amputate corretto prima di eseguire la formazione immagine pizzicando la punta, rotolamento il mouse e osservando l'assenza di movimento. 
	Nota: Unguento oftalmico deve essere applicato agli occhi dopo l'induzione dell'anestesia per evitare l'essiccazione corneale. Trasferire i topi anestetizzati per le macchine di formazione immagine (cioè, sistema di imaging bioluminescenza ed ecografia), dove riceveranno una dose di mantenimento di anestetica isoflurane. Determinare l'anestesia ora di inizio e la profondità dell'anestesia osservando una mancanza di reazione a pizzichi sulla coda e piedi pad ogni 10 min per tutta la durata dell'anestesia.</li>
	<li>Impostare la temperatura del gel di ultrasuono e tabella imaging a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere completamente la pelliccia sopra la zona del torace del mouse anestetizzato usando la crema depilatoria.</li>
	<li>Posizionare il mouse sul tavolo imaging in posizione supina e sicuro sia degli arti superiori e inferiori con nastro adesivo per evitare il movimento del corpo durante la procedura. Utilizzare un monitor di elettrocardiogramma durante la procedura per tutti i topi.</li>
	<li>Pulire la pelle della zona torace usando un tampone di iodio di povidone 10% seguito da un tampone di etanolo 70%. Applicare uno spesso strato di gel per la zona del torace del mouse.</li>
	<li>Montare il trasduttore nel supporto e regolare la sua posizione fino a quando il ventricolo sinistro è chiaramente visibile il campo visivo.</li>
	<li>Carico 150 µ l della sospensione di cellule trasdotte hMSC (2 x 10 6 hMSCs in 150 µ l di PBS sterile) in una siringa da 1 mL con un 28-G dell'ago e fissare la siringa di supporto adeguato. Per visualizzare il pulsante sangue, mantenere una colonna d'aria nella siringa. Per evitare grumi, sospendere le cellule prima dell'iniezione.</li>
	<li>Avanzare la siringa verso il torace del mouse, regolare la traiettoria dell'ago utilizzando la guida ecografica e immettere il ventricolo sinistro.</li>
	<li>Seguendo la Guida di formazione immagine di ultrasuono, penetrare l'ago della siringa attraverso lo spazio intercostale e nel ventricolo di sinistra del mouse. 
	Nota: La punta dell'ago della siringa deve essere chiaramente visibile nel ventricolo sinistro sull'immagine ultrasonographic. Posizionamento corretto dovrebbe essere ulteriormente confermato dal deflusso di sangue arterioso fresco nella siringa. Questi sono segni di un esito positivo inserimento.</li>
	<li>Iniettare la sospensione cellulare hMSC molto lentamente in 2 minuti, l'applicazione pre dolcessure.</li>
	<li>Dopo l'iniezione di cellule sospese, delicatamente ritirare l'ago, pulire il gel per ultrasuoni e rilasciare il mouse dai vincoli nastro.</li>
	<li>Metti l'animale in una gabbia nuova, pulita con un pad preriscaldato. 
	Nota: Dopo il completamento della procedura, un ambiente caldo dovrebbe essere fornito ai topi fino al recupero. Sovra-riscaldamento dovrebbe essere evitato, poiché vasodilatazione periferica compromette il recupero. I topi dovrebbero essere strettamente monitorati e mantenuti isolati da altri topi fino al loro completo recupero, indicato dalla loro capacità di mantenere decubito sternale.</li>
	<li>Monitorare l'animale fino al raggiungimento di completo recupero dall'anestesia e tutti i giorni fino alla fine dell'esperimento.</li>
</ol> 3. Imaging di bioluminescenza (BLI) di hMSCs <ol><li>immagine topi 24 h dopo l'iniezione intracardiaca nella bioluminescenza sistema di imaging. Avviare lo in vivo imaging software. Inizializzare il sistema di imaging e aprire un nuovo studio.
	<ol><li>Nel pannello di controllo, impostare i parametri di imaging facendo &#34; sequenza setup. &#34; In modalità di imaging, selezionare &#34; luminescenza &#34; e &#34; fotografia. &#34; impostare i tempi di esposizione da 0,5 s per 10 min. impostare il binning &#34; medio &#34; e la F / stop a &#34; 1. &#34; impostare il filtro di eccitazione &#34; blocco &#34; e il filtro di emissione a &#34; Apri. &#34; impostato il campo visivo &#34; C &#34; per due topi. Aggiungere il programma di installazione di sequenza guidata immagine facendo clic su pannello di controllo di acquisizione.</li>
	</ol></li> <li>Accendere la pompa di ossigeno e impostare l'isoflurano al 2,5% nella camera di induzione e il cono di naso all'interno della macchina.</li>
	<li>Iniettare il mouse i.p. con 300 µ l di D-luciferina (12,5 mg/mL).</li>
	<li>Posizionare il mouse nella camera di induzione di anestesia.
	<ol><li>Dopo 2-3 min, trasferire il mouse lo in vivo imaging camera, con la sua testa nel cono di naso sul collettore di anestesia. Applicare l'unguento ottico per proteggere gli occhi durante la formazione immagine. Per realizzare l'immagine più mouse, utilizzare deflettore luce nera per impedire la riflessione della luce sui topi adiacenti.</li>
	</ol></li> <li>Scegliere la &#34; acquisire &#34; pulsante per avviare l'acquisizione di immagini 10 min dopo l'iniezione di D-luciferina.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3,3-3,5 per realizzare l'immagine più topi.</li>
	<li>Dopo l'in vivo acquisizione dell'immagine, eutanasia i topi da inalazione di CO 2 seguita da dislocazione cervicale, per confermare la morte. Eseguire l'analisi ex vivo.
	<ol><li>Se viene eseguita l'analisi ex vivo dopo 20 min, ripetere l'iniezione di luciferina (punto 3.3) prima di sacrificare i topi; il segnale BLI può diminuire 20 min dopo l'iniezione di luciferina.</li>
	</ol></li> <li>Sezionare i topi per rimuovere tutto il tratto gastrointestinale (cioè, dallo stomaco al retto), linfonodo mesenterico (MLN), polmoni, milza e fegato. Metterli in capsule di Petri con pinze e le forbici 2 , 4.</li>
	<li>Porre la capsula di petri contenente gli organi espiantati nella camera di imaging e di acquisire immagini BLI per passaggi 3.1-3.6.</li>
	<li>Dopo l'acquisizione di immagini, trasferire gli organi espiantati per stampi di campione contenente composti di temperatura di taglio ottimale (OCT). Per congelatore gli stampi a-80 ° C utilizzando ghiaccio secco. Eseguire immunoistochimica utilizzando anticorpi anti-luciferasi sulle sezioni congelate per confermare la presenza di hMSCs 16.</li>
	<li>Per la quantificazione dell'intensità della luce, utilizzare l'area di strumento di interesse (ROI) a strumento tavolozza 16 , 19. Selezionate la cornice ROI e spostarlo in regione di interesse sull'immagine. Fare clic su &#34; misurazione del ROI &#34; e salvare i dati nel formato di file SEQ. Esportare i dati come un file. txt e utilizzare software statistico per eseguire prove di statistiche base per quantificazione 16.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo studio descrive una nuova tecnica per l'iniezione intracardiaco ultrasuono-guida di hMSCs in un modello murino di piccolo intestino di CD sperimentale. Questa tecnica è molto alto tasso di sopravvivenza e di successo, come la traiettoria dell'ago può essere regolata in base in tempo reale immagini ad alta risoluzione del ventricolo sinistro del mouse, fornito dall'ecografia. Il vantaggio di consegna per il ventricolo sinistro è che hMSCs vengono poi distribuiti intra-arterialmente e bypassare la circolazione venos...

Morbo di Crohn (CD) è una comune malattia infiammatoria cronica del piccolo e grande intestino ed è pensato per derivare da un'inadeguata risposta del sistema immunitario dell'ospite a microbi intestinali7,8. Recenti studi hanno dimostrato che cellule staminali mesenchimali (MSCs) sia murine ed umane possono sopprimere l'infiammazione in modelli murini di infiammazione intestinale1,3,4,5. Non ci sono più studi clinici in corso che utilizzano MSCs umane derivate da midollo osseo o tessuto adiposo per il trattamento di pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), che include CD9. Due percorsi per la terapia di MSC sono stati utilizzati in questi studi clinici: uno riguarda l'infusione sistemica (cioè, per via endovenosa) di MSCs per IBD luminal (incluso CD) e l'altro prevede l'applicazione localizzata/iniezione di cellule staminali in fistola tratto di pazienti con CD perianale. In una recente meta-analisi della terapia MSC per IBD, sistemico (cioè, per via endovenosa) terapia MSC per IBD luminal (incluso CD) era efficace in fino a 40% (IC 95%: 7-79%) dei pazienti, mentre l'efficacia era molto più alto, al 61% (95% CI: 36-85%), quando MSCs sono stati iniettati localmente nel malato CD fistola9. Uno studio multicentrico di fase recente III randomizzato controllato verso placebo di cellule staminali allogeniche adipose iniettato direttamente nella fistola perianale di CD pazienti hanno mostrato statisticamente significativa prova clinica e radiologica delle fistole perianali, guarigione, che confermano i risultati delle meta-analisi10. Le ragioni per la bassa efficacia della terapia MSC data per via endovenosa per CD luminal è stato adeguatamente studiato, ma uno dei motivi potrebbe essere l'homing inadeguata delle MSCs al sito di infiammazione. Murino in modelli di infiammazione colica hanno dimostrato che solo una piccola percentuale di cellule staminali mesenchimali (1-5%) iniettato per via endovenosa raggiungono il colon infiammato; MSCs rimanenti vengono filtrati dai polmoni (effetto di primo passaggio)1,2 ,5,11,12. Più studi di ricerca murino quindi usato la via intraperitoneale (i.p.) per la somministrazione di MSC in modelli animali di colite4. Tuttavia, essi hanno anche dimostrato che solo una piccola frazione delle cellule di raggiungere e attecchire il colon e che l'efficacia è collegata alla secrezione di fattori paracrini solubili, come proteina di fattore di necrosi tumorale-inducible gene 6 (TSG-6)2. Il meccanismo MSC di immunosoppressione e guarigione comporta un approccio multipronged che coinvolge paracrina; fattori di prossimità-indipendente delle cellule, come STG-6; e fattori di prossimità-dipendente, cellulare come programmato la morte-legante 1 (PD-L1); o Jagged 1. Localizzazione di MSC al sito di infiammazione può pertanto efficacia aumentata9,13. Infatti, un recente studio ha mostrato che MSCs impiantati direttamente presso il sito della lesione colica provocato la guarigione secernendo promuovere l'angiogenesi endoteliali fattore di crescita vascolare (VEGF). D'altra parte, un effetto di guarigione minimo è stato notato dopo iniezione endovenosa5. Per aumentare la loro localizzazione al sito di infiammazione (cioè, il piccolo intestino in topi SAMP), è stata sviluppata questa tecnica di iniezione intracardiaca ultrasuono-guida per l'amministrazione di MSC nel ventricolo sinistro. Immagine-guida iniezione assicura un'iniezione precisa, che conduce ad un più alto tasso di successo e diminuita morbilità e mortalità. Inoltre, l'iniezione di cellule staminali mesenchimali nel ventricolo di sinistra li recapita alla circolazione arteriosa, dove si possono raggiungere il piccolo intestino infiammato prima di diventare intrappolati nei polmoni.
In questo studio, MSCs derivate da midollo osseo umano (hMSCs) sono stati usati per l'iniezione nel modello murino di SAMP-1/YitFc (SAMP) di CD14. SAMP è un modello murino spontaneo ben caratterizzato di infiammazione cronica che si sviluppa l'infiammazione di piccolo intestino con quasi 100% penetranza14. L'infiammazione si sviluppa in risposta alla microflora in assenza di qualsiasi manipolazione chimica, immunologici o genetici e umana CD11è molto simile. Pari età e del sesso senza infiammazione AKR/J (AKR) topi, topi di controllo parentale di SAMP, sono stati usati in questo studio.
Il hMSCs sono stati isolati e ampliato in laboratorio da campioni di midollo osseo (BM) ottenuti da donatori normali, non identificati dopo consenso informato utilizzando validati e pubblicati in precedenza protocolli15,16. Dopo isolamento ed espansione, la capacità MSC in osteogenica, adipogenico, differenziazione chondrogenic è stata valutata in laboratorio da più saggi15. L'analisi funzionale osteogenico è stato effettuato impiantando cubi in ceramica di idrossiapatite/tricalcio fosfato matrice contenente hMSCs sottocute in immunocompromised di topi SCID CB17-Prkdc17. Il dosaggio di cubo dimostra osteogenesi e Condrogenesi potenziali ed è considerato la prova definitiva per la valutazione individuale MSC preparazioni17. Per visualizzare hMSCs in vivo dopo l'iniezione, è stato utilizzato lentivirus trasduce hMSCs con costruzione di gene reporter triple che consiste di luciferasi di lucciola (fl), la proteina fluorescente rossa monomerica (mRFP) e chinasi della timidina virale di simplex di erpete (ttk ), guidato da un modificate myeloproliferative sarcoma virus (mnd) promotore18. La luciferasi di lucciola al reporter triple sono un enzima che luciferina iniettato copritrici a ossiluciferina in hMSCs e produce luce fotoni/bianco. Questo è rilevato dalla telecamera sensibile charge coupled device (CCD) (bioluminescenza) in un in vivo optical imaging sistema, consentendo la visualizzazione di live hMSCs in topi. Bioluminescenza imaging (BLI) è una tecnica sensibile che può essere utilizzata in serie per tenere traccia delle cellule e per l'analisi ex vivo . L'uso di un promotore forte mnd spinge l'espressione continua della costruzione di gene reporter triple fusion e consente l'imaging delle hMSCs iniettato per più di 16 settimane19. Il hMSCs sono difficili da trasdurre e hanno un'efficienza di trasduzione basso. Utilizzando un protocollo ottimizzato, è stata migliorata l'efficienza di trasduzione hMSCs e l'espressione del transgene è stata rafforzata18. Utilizzando mRFP espressione (uno dei geni reporter triple) in citometria a flusso, è stata dimostrata la capacità di trasdurre hMSCs con un'alta efficienza di fino a 83%. In vivo cubo dosaggi e saggi di differenziazione ha dimostrato la capacità di differenziarsi in condrociti, adipociti e osteociti17il hMSCs trasdotte.

<table><tbody><tr><td>DMEM-LG&nbsp; &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31600-091</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Proteamina solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Goldbio</td><td>luck-500</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale Bobine</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per posate in tessuto da 175 cm</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per posate in tessuto da 75 cm</td><td>Corning</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Crysalgen</td><td>23-2265</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. compound</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold Standard</td><td>Tissue-Tek&nbsp;</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di confezionamento dell'espressione dell'HIV Lenti-Pac</td><td>GeneCopoeia</td><td>HPK-LvTR-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Ioni tamponi Medline</td><td></td><td>MDS093901</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;</td><td>Piramal Helathcare&nbsp;</td><td>NDC 66794 013 25</td><td></td></tr><tr><td>Pinze&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione (Wagner)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Unguento veterinario Puralube</td><td>Puralube</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Gel per trasmissione di ultrasuoni Aquasonic 100</td><td>Parker laboratories</td><td>01 08</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Topi</td> <td>SAMPCentro centrale di</td><td></td><td></td>ricerca sulle malattie digestive di Cleveland</tr><tr><td>Topi AKR</td> Centro centrale <td></td><td></td>di <td>ricerca sulle malattie digestive di Cleveland</td></tr><tr><td>Sistema di imaging Vevo 770</td><td> Visual Sonics, Toronto, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sistema della serie di spettro IVIS&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di immagine vivente</td><td>CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triplo reporter</td><td>gentilmente fornito dal Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citazione 19)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ultrasuono-guida di iniezione intracardiaca di cellule staminali mesenchimali umane per aumentare homing all'intestino per l'utilizzo in modelli murini di malattie intestinali infiammatorie sperimentali

Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases

Morbo di Crohn (CD) è una comune malattia infiammatoria cronica del piccolo e grande intestino. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) murine ed umane hanno potenziale immunosopressivo e sono state indicate per sopprimere l'infiammazione in modelli murini di infiammazione intestinale, anche se la via di somministrazione può limitare loro homing ed efficacia 1 , 3 , 4 , 5. l'applicazione locale di MSCs per modelli di lesione colica ha mostrato una maggiore efficacia al miglioramento dell'infiammazione del colon. Tuttavia, c'è scarsità di dati sulle tecniche per migliorare la localizzazione di MSCs derivate da midollo osseo umano (hMSCs) all'intestino tenue, il sito di infiammazione nel modello SAMP-1/YitFc (SAMP) del morbo di Crohn sperimentale. Questo lavoro descrive una nuova tecnica per l'iniezione intracardiaco ultrasuono-guida di hMSCs in topi SAMP, un modello ben caratterizzato spontaneo di infiammazione intestinale cronica. Sesso ed età-abbinato, senza infiammazione AKR/J (AKR) topi sono stati usati come controlli. Per analizzare la biodistribuzione e la localizzazione, hMSCs erano trasdotte con un lentivirus contenente un reporter triplo. Il reporter triplo consisteva di luciferasi di lucciola (fl), per l'imaging bioluminescenti; proteina fluorescente rossa monomerica (mrfp), per l'ordinamento delle cellule; e troncato herpes simplex virus timidina chinasi (ttk), per l'imaging di tomografia a emissione di positroni (PET). I risultati di questo studio mostrano che 24 h dopo la somministrazione intracardiaca, hMSCs localizzare nell'intestino tenue dei topi SAMP al contrario di topi AKR senza infiammazione. Questo romanzo, iniezione ultrasuono-guida di hMSCs nel ventricolo sinistro dei topi SAMP garantisce un alto tasso di successo di consegna cella, consentendo il rapido recupero dei topi con la mortalità e la morbosità minima. Questa tecnica potrebbe essere un metodo utile per la localizzazione avanzata delle MSC in altri modelli di infiammazione piccolo-intestinale, quali TNFΔRE6. Gli studi futuri determinerà se la maggiore localizzazione di hMSCs di consegna intra-arteriosa può portare a una maggiore efficacia terapeutica.

La figura 1 Mostra che hMSCs può essere trasdotte con il reporter triplo ad alta efficienza, preservando la loro proprietà di cellule staminali. Trasdotte hMSCs possono essere visualizzate in tempo reale da BLI (Figura 1, Figura 3). Questo romanzo, iniezione ultrasuono-guida di hMSCs ventricolo sinistro dei topi SAMP garantisce un tasso di successo molto alta dell'iniezione, consentendo il rapido rec...

Murino in modelli di infiammazione colica hanno dimostrato che una piccola percentuale (1-5%) di cellule staminali mesenchimali (MSC) iniettato per via endovenosa o intraperitonealmente ospita il colon infiammato1,2. Questo studio indica che le iniezioni intracardiache ultrasuono-guida di MSCs provocare maggiore localizzazione all'intestino.

Ultrasuono-guida di iniezione intracardiaca di cellule staminali mesenchimali umane per aumentare Homing all'intestino per l'utilizzo in modelli murini di malattie intestinali infiammatorie sperimentali

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un'iniezione intracardiaca ecoguidata di cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano, o HMSC, in un modello murino di morbo di Crohn sperimentale, al fine di osservare il reclutamento delle HMSC a livello intestinale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie infiammatorie intestinali, in particolare riguardo alla necessità di aumentare la localizzazione delle HMSC nell'intestino tenue durante l'infiammazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'elevata percentuale di successo nel rilascio delle HMSC con minima mobilità del topo e ridotta mortalità.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo possono incontrare difficoltà a causa delle numerose variabili che possono influenzare l'esito della procedura, richiedendo una profonda comprensione da parte del tirocinante della biologia delle cellule staminali mesenchimali umane. Le procedure saranno dimostrate da Paola Menghini, una ricercatrice post dottorato del nostro laboratorio.In un impianto libero da patogeni specifici, impostare il protocollo del sistema di imaging ecocardiografico a ultrasuoni per topi e inizializzare la sonda da 30 megahertz. Successivamente, verificare il livello appropriato di sedazione mediante pizzicamento del dito del piede e applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Utilizzare una crema depilatoria per rimuovere il pelo sul torace e posizionare l'animale supino sul tavolo di imaging a 37 gradi Celsius.Fissare gli arti con del nastro per impedire movimenti durante la procedura e disinfettare la cute esposta del torace con iodopovidone al 10% ed etanolo al 70%. Applicare uno strato spesso di gel ecografico a 37 gradi Celsius sulla cute e montare la sonda nel supporto, regolando la posizione della sonda fino a quando il ventricolo sinistro risulti chiaramente visibile nel campo visivo. Successivamente, sospendere delicatamente 2 x 10 alla sesta cellule staminali mesenchimali umane transdotte in 150 microlitri di PBS sterile per ottenere una sospensione cellulare omogenea e caricare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di ago da 28 gauge.Iniettare meno di 150 microlitri di sospensione cellulare per topo per evitare un sovraccarico di volume e la morte. Fissare la siringa in un supporto per siringa. Successivamente, avanzare la siringa verso il torace del topo utilizzando la guida ecografica per regolare la traiettoria dell'ago secondo necessità e penetrare con la punta dell'ago attraverso lo spazio intercostale nel ventricolo sinistro.Una visualizzazione adeguata dell'ago nell'immagine ecografica è fondamentale per garantire una traiettoria corretta e l'inserimento dell'ago nel ventricolo sinistro, un'iniezione di successo e per evitare l'attenuazione cardiaca e la morte. La punta deve essere chiaramente visibile all'interno del ventricolo sinistro e il posizionamento corretto può essere ulteriormente confermato dal flusso di sangue arterioso fresco che entra nella siringa. Applicare una pressione delicata sul pistone per iniettare lentamente la sospensione di HMSC per un periodo di due minuti.Dopo aver iniettato tutte le cellule, ritirare delicatamente l'ago e posizionare l'animale in una gabbia pulita su un tappetino preriscaldato, monitorandolo fino al completo recupero. A 24 ore dall'iniezione, avviare il sistema di imaging bioluminescente e aprire un nuovo studio nel software di imaging in vivo. Per impostare i parametri di imaging nel pannello di controllo, fare clic sulla configurazione della sequenza.In modalità di imaging, selezionare luminescenza e fotografia. Impostare i tempi di esposizione da 0,5 secondi a 10 minuti, la sensibilità su medio e il diaframma su uno. Impostare il filtro di eccitazione su blocco, il filtro di emissione su aperto e il campo visivo in modo da visualizzare due topi.Quindi fare clic sul pannello di controllo dell'acquisizione per aggiungere l'insieme di sequenze alla procedura guidata per l'immagine. Successivamente, iniettare il primo topo con 300 microlitri di D-luciferina. Applicare un unguento sugli occhi degli animali e trasferire il topo nella camera di imaging in vivo.Dieci minuti dopo l'iniezione di d-luciferina, fare clic su acquisisci per iniziare l'acquisizione dell'immagine. Dopo aver effettuato l'immagine di tutti i topi, prelevare l'intero tratto gastrointestinale, i linfonodi mesenterici, i polmoni, la milza e il fegato da ciascun animale. Successivamente, acquisire l'immagine degli organi come appena dimostrato, per l'immagine di bioluminescenza dell'intero animale.Gli HMSC possono essere trasdotti con il reporter triplo con un'alta efficienza, preservando le proprietà delle cellule staminali e permettendone la visualizzazione in tempo reale mediante imaging bioluminescente. L'analisi ex vivo delle cellule staminali somministrate per via intracardiaca conferma che questa via di somministrazione facilita l'omming degli HMSC verso l'intestino tenue infiammato nei topi affetti da malattia di Crohn sperimentale. Tuttavia, gli HMSC iniettati in animali di controllo, privi di infiammazione, non si accumulano nell'intestino tenue.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di 15 minuti per topo, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare l'immagine ecografica per regolare la traiettoria dell'ago. Una tecnica inadeguata e una traiettoria errata possono portare a tamponamento cardiaco causato da effusione pericardica emorragica e alla morte.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'istologia e la microscopia 3D per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se un aumento dell'omissione delle HMSC nell'intestino tenue ne potenzi l'efficacia terapeutica. Questa tecnica permetterà ai ricercatori nel campo dell'IBD sperimentale di esplorare tutti i loro modelli murini, come la traiettoria del TNF, che possono essere iniettati con HMSC per migliorare l'omissione nell'intestino tenue. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'iniezione intracardiaca guidata da ultrasuoni di HMSC nei topi e di come utilizzare l'imaging bioluminescente per analizzare una distribuzione e un'omissione inadeguate.Non dimenticare che lavorare con MSC umane può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di guanti e di una maschera facciale con schermo protettivo durante l'esecuzione di questa procedura.

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Ultrasuono-guida di iniezione intracardiaca di cellule staminali mesenchimali umane per aumentare Homing allintestino per lutilizzo in modelli murini di malattie intestinali infiammatorie sperimentali (Video) | JoVE Journal

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