Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare simultaneamente più potenziali siti di fosforilazione e di identificare i siti per la successiva validazione da parte di mutanti del sito di fosforilazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica e della biologia cellulare sul ruolo delle modifiche post-traduzionali nella segnalazione cellulare. Questa tecnica consente uno screening preliminare facile ed economico per i siti di fosforilazione e la proteina di interesse.

L'implicazione di questa tecnica si estendeva alla diagnosi e alla terapia di malattie tra cui l'infiammazione e il cancro perché la fosforilazione è un importante evento biochimico nelle vie di segnalazione nelle malattie umane. Ad aiutare la dimostrazione sarebbe Sol-Bi Shin, uno studente laureato del mio laboratorio che mentre esegue la mutagenesi sito-diretta. Per prima cosa, combina 50 nanogrammi di plasma pGEX JST NRF2, 125 nanogrammi di primer diretto, 125 nanogrammi di primer inverso, un microlitro di DNTP, mescola 2,5 unità di DNA polimerasi PFU e 10 tamponi di reazione su ghiaccio.

Aggiungere acqua distillata sterile per portare il volume a 50 microlitri. Eseguire la PCR per incorporare il filamento mutante e quindi raffreddare il campione su ghiaccio per due minuti. Aggiungere un microlitro di enzima di restrizione DPNI al campione raffreddato.

Miscelare il campione con un pipettaggio delicato e centrifugare il campione per un minuto a 13.000 volte G.Incubare il campione a 37 gradi Celsius per due ore per digerire il DNA parentale a doppio filamento. Quindi gettare sul ghiaccio le cellule di E.coli supercompetenti con mutazioni endA1 e RACA1. Aggiungere 50 microlitri della miscela di reazione alle celle refrigerate e incubare su ghiaccio per 30 minuti.

Nel frattempo, preriscaldare un blocco riscaldante a 42 gradi Celsius. Una volta completata l'incubazione, scaldare la miscela a 42 gradi Celsius per 90 secondi e poi raffreddare la miscela con ghiaccio per due minuti. Aggiungere il brodo di lisogenesi preriscaldato alle cellule trasformate.

Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora agitando a 180 giri/min. Quindi stendere le cellule su piastre di agar di ampicillina LB e incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius. Trasferire una singola colonia in cinque millilitri di brodo di lisogenesi con ampicillina.

Incubare i campioni per una notte a 37 gradi Celsius agitando a 180 giri/min. Estrarre il DNA del campione utilizzando un mini kit di preparazione standard per l'analisi della sequenza del DNA. Eseguire almeno 200 nanogrammi di costrutto HDNA in un analizzatore di DNA per verificare la sequenza mutante.

Esprimere e purificare la proteina NRF2 mutante convalidata. Determinare la quantità di NRF2 mutato prodotta prima di procedere con il saggio della chinasi. Per iniziare il saggio di competizione peptidica, preparare una soluzione tampone chinasi 5X con una concentrazione di adenosina monofosfato di 500 micromolari.

Quindi scongelare campioni congelati di AMPK wild type umano NRF2 e tre oliogopeptidi che imitano i siti di fosforilazione AMPK di NRF2. Per ogni peptide, mentre è in ghiaccio, combinare 0,43 milligrammi di peptide con 0,15 microgrammi di AMPK, 0,4 microgrammi di NRF2 e sei microlitri di tampone chinasi 5X. Aggiungere acqua distillata sterile per ottenere un volume finale di 30 microlitri.

Quindi, in un'area schermata, impostare un blocco riscaldante a 30 gradi Celsius. Aggiungere una microcurie di gamma 32P ATP a ciascuna provetta, mescolando accuratamente ogni soluzione pipettando su e giù. Incubare le miscele di reazione a 30 gradi Celsius per 15-30 minuti.

Durante l'incubazione, preparare il gel 7,5% STS PAGE. Quindi aggiungere tre microlitri di tampone campione 10X STS a ciascuna provetta e mescolare accuratamente per arrestare la reazione chinasica. Far scorrere i campioni nel gel a 70 volt per 20 minuti e poi a 140 volt per un'ora.

Al termine dell'elettroforesi su gel, rimuovere con cautela il gel altamente radioattivo sotto la linea blu di bromofenolo. Trasferire delicatamente il gel dalla rotella a un tubo di vetro. Fissare il gel in una soluzione di 50% metanolo, 40% di acqua e 10% di acido acetico per 20 minuti.

Quindi posizionare delicatamente il gel su carta da filtro e coprirlo con pellicola trasparente. Asciugare il gel con un essiccatore sottovuoto per un'ora a 80 gradi Celsius. Esporre il gel secco a uno schermo al fosforo o a una pellicola radiografica per circa 16 ore per due giorni, rispettivamente.

Usa un Phosphorimager per generare un file TIFF o Bitmap ad alta risoluzione dello schermo. Per iniziare il test di attività dell'AMPK, scongelare campioni di AMPK e di GST NRF2 mutante e wild type su ghiaccio. Combina 0,4 microgrammi di GST NRF2 mutante con 0,15 microgrammi di AMPK e sei microlitri di tampone chinasi 5X.

Aggiungere acqua distillata sterile per portare il volume a 30 microlitri. Preparare un'altra miscela di reazione in questo modo con 0,4 microgrammi di GST NRF2 wild type. Aggiungere una microcurie di gamma 32P ATP a ciascuna fiala di reazione.

Pipettare le miscele su e giù più volte e poi centrifugare brevemente le miscele. Incubare le miscele a 30 gradi Celsius per 30 minuti in un'area schermata e quindi terminare la reazione chinasica con tre microlitri di tampone campione 10X STS. Eseguire STS PAGE, fissare il gel e asciugare il gel utilizzando le stesse condizioni del test della chinasi competitiva.

Esporre il gel a uno schermo al fosforo durante la notte ed eseguire la scansione dello schermo con il Phosphorimager. È stato eseguito un test in vitro dell'AMPK in presenza di tre oligopeptidi da 10 residui che imitano i siti di fosforilazione dell'AMPK su NRF2 umano. L'oligopeptide che imita il sito della serina 558 ha offerto la più grande competizione per la fosforilazione dell'AMPK.

Un mutante NRF2 che sostituisce la serina 558 con l'alanina è stato quindi sintetizzato e valutato in un saggio di attività in vitro. È stata osservata pochissima fosforilazione dell'AMPK del mutante S558 A, indicando che l'AMPK fosforila direttamente l'NRF2 umano alla serina 558. Poiché i peptidi si legano in modo competitivo alle proteine, il principio di questo metodo può essere applicato anche per identificare altre modifiche e post-traduzioni, come l'acetilizzazione e i residui di lisina e le interazioni proteiche proteiche.

Non dimenticare che lavorare con gli isotopi radio può essere estremamente pericoloso. La formazione sulla sicurezza degli isotopi radio deve essere già seguita prima di eseguire questa procedura.