Name: Valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Impara a valutare la riserva di calcio del reticolo sarcoplasmico e il rimozione diastolica del calcio nei cardiomiociti ventricolari isolati. Questo metodo consente di studiare la gestione del calcio intracellulare in condizioni patologiche come diabete e scompenso cardiaco.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (No. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), il medico e salute scienza programma della provincia del Zhejiang (No. 201646246, Dongwu Lai) e la scienza di salute e Piano tecnologico della città di Hangzhou (n. 2013A28, Ding Lin).

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato di uso presso centro di ricerca sperimentale, Accademia delle scienze mediche cinese Cina e Università di Zhejiang e istituzionali Animal Care.
 1. preparazione della soluzione <ol><li>preparare tutte le soluzioni, come descritto nella tabella 1.</li></ol>
 2. isolamento di sinistra ventricolare (LV) cardiomiociti Nota: LV cardiomiociti sono isolati enzimaticamente utilizzando un sistema di perfusione Langendroff come descritto in precedenza 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
<ol><li>Ha istituito il sistema di perfusione Langendroff. Riempire il sistema di perfusione con soluzione di Tyrode normale (NT), impostare la temperatura a 36,5 ° C ed eliminare eventuali bolle d'aria nel tubo.</li>
	<li>Pesare e anestetizzare un ratto Sprague-Dawley tramite l'iniezione intraperitoneale (ip) di cloralio idrato (400 mg/kg). Confermare lo stato anestetico valutando la risposta di pizzico di punta o coda dopo 5 min</li>
	<li>Aprire la cavità addominale sotto il processo xifoideo con una forbice chirurgica, sollevare il processo xifoideo e aprite la cassa con la forbice. Rimuovere il pericardio, sollevare leggermente il cuore con pinzetta, identificare l'arco aortico e tagliare il cuore di forbici dalla radice dell'aorta.</li>
	<li>Trasferire il cuore a un piatto di 60 mm e lavare con soluzione di NT. Mantenere premuto l'aorta con due pinze di micro-dissezione e montarla sulla cannula di perfusione di Langendorff, poi legare saldamente l'aorta sulla cannula utilizzando suture chirurgiche. 
	Nota: Un operatore esperto può terminare questo processo entro 15 s.</li>
	<li>Irrorare il cuore con una soluzione di 30 mL NT per ripristinare la circolazione delle arterie coronarie. Passare quindi il perfusato 30 mL Ca 2 +-libera soluzione di Tyrode (10mm taurina, 1 mg/mL BSA) per arrestare il battito cardiaco. Successivamente, passare il perfusato alla soluzione di isolamento di collagenasi A (0,6 mg/mL) per digestione degli enzimi di. 
	Nota: Uso della collagenosi A per esperimenti con ratti diabetici, o collagenasi II per esperimenti senza ratti diabetici.</li>
	<li>Dopo la digestione per 20-25 min, cambiare rapidamente la soluzione di perfusione per il Ca 2 +-soluzione di Tyrode per arrestare ulteriore digestione libera. Quindi, tenere il cuore con il forcipe, tagliarlo dalla cannula e mettere il cuore in un piatto di 35 mm contenente soluzione KB (Vedi tabella 1).</li>
	<li>Sezionare la parete di LV con forbici e pinze. Tagliare l'atrio, ventricolo destro e la zona di giunzione atrioventricolare. Il tessuto restante è il LV; trasferirlo in un piatto nuovo 35mm con soluzione KB. Tritare il tessuto LV in piccoli pezzi.</li>
	<li>Delicatamente pipettare i pezzi con un contagocce di plastica filtrato e risospendere in soluzione 10 mL KB.</li>
	<li>Filtrare le cellule con 150 µm filtro di apertura in acciaio inox e trasferimento in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 150 x g per 30 s e scartare il surnatante. Risospendere i miociti in soluzione 10 mL KB, libero accontentarsi di 6 min, eliminare il supernatante e risospendere il pellet in soluzione 10 mL KB. 
	Nota: Tutti i passaggi sono stati eseguiti a 36 ° C nelle soluzioni gassati con 100% O 2.</li>
</ol> 3. Reintroduzione del calcio <ol><li>dopo assestamento per 20 min in soluzione KB, scartare il surnatante e risospendere i miociti con soluzione di reintroduzione di calcio A (0,3 mM Ca 2 +, 4,5 mL Ca 2 +-soluzione gratuita Tyrode, NT di 1,5 mL di soluzione) per 10 min.</li>
	<li>Ripetere la procedura con soluzione di reintroduzione del calcio B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-soluzione gratuita Tyrode, NT di 3 mL di soluzione).</li>
	<li>Ripetere la procedura con soluzione di NT (1,2 mM Ca 2 +) per purificare i miociti disponibili. Memorizzare i miociti isolati di LV in questa soluzione e studiarli entro 4-6 h.</li>
</ol> 4. Set Up di aspersione System <ol><li>collegare il tubo di afflusso con la soluzione di NT per aspersione di alloggiamento ( Figura 1A).</li>
	<li>Per la perfusione dell'ago del miocita destinazione, collegare la punta collettore multi-canna (ad es., matita aspersione, indicato come matita d'ora in poi), risolto nel micromanipolatore, alla valvola controllato sistema di perfusione. Aggiungere la soluzione di NT e soluzione di caffeina 10 mM per ogni colonna della matita ( Figura 1A).</li>
	<li>Evacuare eventuali bolle d'aria nei tubi per evitare il blocco aria.</li>
	<li>Contare il numero di goccia dalla punta micron della matita per 10 s e di regolare manualmente il regolatore di flusso per mantenere la velocità di flusso alla velocità approssimativa di 3 flebo/10 s.</li>
</ol> 5. Misure di Ca intracellulare 2 + transitori e accorciamento del sarcomero 7 , 8 , 9 <ol><li>sospensione di cellule di pipetta 10 µ l della diapositiva, contare i numeri delle cellule di un contatore di cellule sotto il microscopio e calcolare la densità. Diluire i miociti una concentrazione approssimativa di 50.000 cellule/mL.</li>
	<li>Aggiungi il Fura-2 acetossimetil (AM) magazzino (un colorante sensibile di calcio) in 1 mL di sospensione dei miociti per portare la concentrazione finale di 2 µM. tenere al buio per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifuga a 150 g per 30 s e risospendere i cardiomiociti con soluzione NT 2 volte.</li>
	<li>Disabilita spegne la luce e mantenere le cellule nel buio. Posto i miociti nella camera di perfusione per 15 min. Poi iniziare la perfusione di camera (1,5 mL/min) con soluzione di NT. Passo i miociti con stimolazione di campo 1 Hz utilizzando uno stimolatore (onda durata 4,0 ms, ampiezza di impulso 8.0 V) per 5 min.</li>
	<li>Selezionare un miocita con buona forma (forma di asta, spigoli vivi e deselezionare striature trasversali) e twitch stimolato stabile (nessuna contrazione spontanea) sotto i 10 x lente microscopica di obiettivo. Successivamente, modificare l'ingrandimento al microscopio a 40x e ruotare l'orientamento della telecamera CCD per mantenere miocita in posizione orizzontale.</li>
	<li>Telaio singolo miocita regolando l'adattatore di inquadratura delle cellule. Garantire che lo sfondo è chiaro.</li>
	<li>Esporre i miociti alla luce emessa da una lampada allo xeno, con 340 380 nm lunghezza d'onda di eccitazione filtri o e l'immagine i miociti attraverso un obiettivo 40x. Rilevare il segnale di fluorescenza a 510 nm. Nel frattempo, notare i cambiamenti di lunghezza del sarcomero dei miociti e registrare utilizzando il modulo del soft-bordo contemporaneamente.</li>
	<li>Record di fluorescenza da un sistema di fotomoltiplicatore dual-eccitazione fluorescenza. Eseguire il programma di registrazione per il calcio sistema di imaging, fare clic &#34; File/Nuovo File &#34; per creare un nuovo file di registrazione, scegliere il &#34; inizio &#34; pulsante per lunghezza in modo sincrono record di fluorescenza e sarcomero.</li>
</ol> 6. Valutazione di SR Ca 2 + riserva e diastolica Ca 2 + rimozione funzione 7 , 8 , 9 <ol><li>Interlink la &#34; Aux Out &#34; porta in lo stimolatore con la &#34; In analogici &#34; porta sul sistema di controllo della valvola (ad es., comandante della valvola, vedere Tabella materiali) da un cavo BNC (per sincronizzare il segnale TTL).</li>
	<li>Preset un programma per le valvole di aspersione di commutazione automaticamente come descritto in precedenza 8 , 9; Procedura dettagliata per il funzionamento è elencata come segue.
	<ol><li>Preset i parametri della valvola di controllano software secondo la tabella 2 e scegliere il &#34; Download &#34; pulsante per scaricare la sequenza caricati nel programma. Fare clic sul &#34; Trigger &#34; pulsante per attivare la funzione trigger. 
		Nota: Il sistema di controllo della valvola possa eseguire la sequenza dopo la ricezione del segnale TTL.</li>
		<li>Preset lo stimolatore alla modalità di sequenza e impostare i parametri come da tabella 3.</li>
	</ol></li> <li>Impostare lo stimolatore a &#34; S1 passo &#34; di ritmo LV miociti a 1 Hz. iniziare la perfusione dell'ago alla velocità di 1,5 mL/min con soluzione NT. 
	Nota: Perché la velocità del flusso dell'ago è più veloce di aspersione di camera, la rifrazione della luce del flusso dell'ago è diversa dalla rifrazione della luce di aspersione di camera. La differenza di rifrazione della luce indica la gamma di aspersione efficace dell'ago, che circonda il bersaglio del miocita.</li>
	<li>Selezionare un destinazione del miocita sotto la visualizzazione microscopica di bassa potenza (nella sequenza di a valle verso Monte), e assicurarsi che si raggiunge dalla micro punta della matita. Modificare l'ingrandimento del microscopio 400x. Ruotare l'orientamento della telecamera CCD per mantenere miocita in posizione orizzontale. Regolare l'apertura rettangolare sotto la scheda di inquadratura delle cellule a una finestra adatta che riempie con i miociti. Assicurarsi che vi sia un fondo minimo; non consentire altri miociti o detriti cellulari morti in questa finestra.</li>
	<li>Regolare la posizione della matita fissata sul micromanipolatore e posizionare con cura la micro punta alla distanza del raggio del campo di visione per il destinazione del miocita sotto 400 x ingrandimento del microscopio.</li>
	<li>Regolare l'intervallo di flusso dell'ago per gran parte coprire il bersaglio del miocita e assicurarsi che miocita non può essere spazzato via dal flusso dell'ago.</li>
	<li>Dopo 60 s base stimolazione, rotolare il cursore di stimolatore per il &#34; passo D2 &#34;. 
	Nota: Il resto del protocollo verrà eseguito automaticamente dal sistema di controllo di valvola e stimolatore. In base all'impostazione di cui sopra, il protocollo potrebbe essere eseguito automaticamente come in Figura 2A, 1 Hz base stimolazione con soluzione di NT per 60 s. Quindi mettere in pausa la cadenza e ritardo per 2 s, passare rapidamente alla perfusione di caffeina di 10 mM per 15 s (per funzionalmente rilasciare Ca 2 + archiviazione nella Repubblica slovacca) e quindi passare nuovamente alla soluzione NT.</li>
	<li>Alla fine della registrazione, rilevare la fluorescenza di fondo per singoli miociti. Fare clic sul &#34; pausa &#34; pulsante per mettere in pausa il file di registrazione, spostare la vista al microscopio in una vicina area vuota. Fare clic sul &#34; record &#34; pulsante per riprendere la registrazione per secondi e registrare valori numerici 340 e 380 nm intensità per la correzione di fondo.</li>
	<li>Aperto il &#34; operazione/costante &#34; nella finestra di dialogo e riempire i valori nel &#34; sfondo &#34; formano, rispettivamente; il software può correggere i valori di rapporto di Fura 2 sottraendo background.</li>
</ol> 7. Dati analisi 9 <ol><li>per misure di transienti di calcio e sarcomero accorciamento nella fase di stimolazione base, media gli impulsi di contrazione e quindi analizzare parametri dinamici, ad esempio transienti di calcio, la costante di tempo di decadimento transitoria di calcio (Tau-1 Hz), utilizzando il software automaticamente. 
	Nota: Se il software non si adatta bene il segmento di decadimento, esportare la traccia di declino per il montaggio manuale mono-esponenziale curva.</li>
	<li>Per gli impulsi di calcio indotta da caffeina, selezionare solo il polso con un'onda ripida per l'analisi della funzione di rimozione del calcio. Escludere le celle con dispersione di segnale, impulso anormale o quelli che scorreva via midway.</li>
	<li>Misurare l'ampiezza dell'impulso indotta da caffeina calcio (Ca-caffeina, un indice di SRCa 2 + riserva).</li>
	<li>Per ottenere la costante di tempo di decadimento dell'impulso di calcio indotta da caffeina (Tau-caffeina) mono-esponenziale curva raccordo (durata 10 s) manualmente da software ( Figura 2).</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
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<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
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<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII%7Bdelta%7D+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li>
<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Flusso di calcio rilasciato dal SR è il Ca2 + fonte principale per sistole nel cuore. A una certa misura, l'ampiezza del SR Ca2 + contenuto e frazionario Ca2 + rilasciato dal SR riflettono la SR Ca2 + riserva disponibile per la contrazione cardiaca. D'altra parte, il Ca2 + riserva di SR dipende dalla capacità del loro equilibrio, Ca2 + perdita di SR e SR Ca2 + reuptake attraverso la SR durante la diastole12,<su...

Calcio intracellulare ([Ca2 +]i) riciclaggio svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti1. Come sappiamo, il calcio Ca2 + rilascio indotto avvia l'accoppiamento, di eccitazione-contrazione che traducono il segnale elettrico alla contrazione. La depolarizzazione della membrana attiva il sarcolemma Ca L-tipo2 + canali, che inducono il Ca2 + rilasciano da SR nel citoplasma attraverso recettori della rianodina 2 (RyR2). I transitori elevati citoplasmico Ca2 + avvia la contrazione delle miofibrille. Durante la diastole, citoplasmici Ca2 + è reuptaken nel SR per mezzo di SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) e pompato fuori del cardiomyocyte via Na+-Ca2 + scambiatore (NCX)2. Questo processo conduce alla contrazione-rilassamento riciclaggio nei cardiomiociti.
Il SR cardiaco è una rete di intracellulare della membrana che circonda il macchinario contrattile. Esso funge da Ca2 + serbatoio per la contrazione, e riassorbe intracellulare di Ca2 + durante il rilassamento. La SR Ca2 + riserva disponibile per beats è determinata per la contrattilità cardiaca. Nel frattempo, la rimozione di intracellulare di Ca2 + è critica per la diastole cardiaca. In alcune condizioni fisiopatologiche, come diabete e infarto, distanza2 + Ca alterata e depresso SR Ca2 + negozio in cardiomiociti può essere coinvolti nel processo di disfunzione cardiaca2,3 ,4.
Per misurare il rilascio di SR Ca2 + e Ca2 + rimozione diastolica in cardiomiociti, esistono due approcci ampiamente usati: l'integrità della corrente NCX basato su patch clamp5,6e la Ca indotta da caffeina 2 + pulse basato su Ca2 + fluorescenza imaging7,8,9. Il primo approccio dipende dal fatto che il Ca2 + rilasciato dal SR è in gran parte pompato fuori dalla cella di NCX. Tuttavia, questo approccio è limitato dalla sua esigenza di attrezzature avanzate e abile operazione. Nello studio presente, descriviamo un metodo conveniente per valutare la riserva di SR Ca2 + e Ca2 + rimozione nei miociti misurando un indotta da caffeina Ca2 + impulso basato su un Ca2 + fluorescenza sistema di imaging. Brevemente,intracellulare Ca 2 + la fluorescenza è indicata da Fura-2. Di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione, vi presentiamo un programma per la perfusione di commutazione e automaticamente il sistema di stimolazione. 10 millimetri di caffeina è stata impiegata per indurre rapidamente il totale Ca2 + rilascio in SR. Le costanti di tempo di decadimento esponenziale (Tau) di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina sono state ottenute da mono-esponenziale curva di raccordo, che riflettono la contribuiscono di SERCA e NCX alla diastolica Ca2 + rimozione di conseguenza.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>caffeina</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Langendorff</td><td>Pechino Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Collegamenti Marchauser</td><td>MM33 Camera</td><td></td></tr><tr><td>di perfusione</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr> Sistema di <tr><td>perfusione a gravità controllata da valvola</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>Software di comando valvole</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di flusso di precisione</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Manifold multi-barile Matita per perfusione</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Punta rimovibile Micron</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di misurazione della fluorescenza e dimensionamento delle cellule</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Software di registrazione</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Ratti Sprague-dawley</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Cardiaco reticolo sarcoplasmatico (SR) funge da Ca2 + serbatoio per contrazione, che reuptakes intracellulare Ca2 + durante il rilassamento. La SR Ca2 + riserva disponibile per beats è determinata per contractibility cardiaco, e la rimozione di intracellulare di Ca2 + è critica per la funzione cardiaca diastolica. In alcune condizioni fisiopatologiche, come il diabete e infarto, alterato del calcio liquidazione e SR Ca2 + store nei cardiomyocytes possono essere coinvolti nel progresso della disfunzione cardiaca. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione SRCa2 + riserva e diastolica Ca2 + rimozione. Brevemente, un singolo dei cardiomiociti era enzimaticamente isolato, e l'intracellulare Ca2 + fluorescenza indicata da Fura-2 è stata registrata da un sistema di imaging del calcio. Per assumere caffeina per indurre il rilascio totale di SR Ca2 + , abbiamo preimpostato un programma di interruttore automatico di aspersione di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione. Quindi, l'adattamento delle curve mono-esponenziale è stato utilizzato per analizzare le costanti di tempo di decadimento di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina. Di conseguenza, il contributo del SR Ca2 +-ATPasi (SERCA) e Na+-Ca2 + scambiatore (NCX) alla rimozione del calcio diastolica è stato valutato.

Qui, vi illustriamo streptozotocin (STZ) - ratti diabetici (DM) indotti e pari età Sprague - Dawley (SD) ad esempio i ratti. 8-settimana-vecchio maschio SD ratti (200 ± 20 g) hanno ricevuto una singola iniezione intraperitoneale di STZ (70 mg/kg, ip) per il buffer di gruppo o citrato di DM per il gruppo di controllo. Una settimana dopo amministrazione di STZ, ratti con glicemia &#62; 16.7 mmol/L sono stati considerati diabetici. Dopo 8 settimane, i miociti di LV sono stati enzimaticamente...

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione del reticolo sarcoplasmico Ca2 + riserva e funzione di rimozione del calcio diastolica in cardiomiociti da un sistema di imaging di calcio.

Valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la riserva di calcio del reticolo sarcoplasmatico e la funzione di rimozione del calcio intracellulare durante la diastole in cardiomiociti isolati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sui meccanismi di gestione del calcio intracellulare in alcune condizioni fisiopatologiche, come il diabete e l'insufficienza cardiaca. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua praticità e il fatto di essere meno limitata da aspetti tecnici e strumentali.Per iniziare questa procedura, preparare il sistema di perfusione di Langendorff. Riempire il sistema di perfusione con soluzione NT, impostare la temperatura a 36,5 gradi Celsius ed eliminare eventuali bolle d'aria nel tubo. Successivamente, aprire la cavità addominale al di sotto del processo xifoidale, sollevare il processo xifoidale e aprire il torace con una forbice.Quindi rimuovere il pericardio, sollevare leggermente il cuore con pinze curve, identificare l'arco aortico e staccare il cuore alla radice dell'aorta. Successivamente, trasferire il cuore in una piastra da 60 millimetri e lavarlo con soluzione NT. Tenere l'aorta con due pinze da dissezione microscopiche e montarla sulla cannula di perfusione Langendorff.Quindi legare saldamente l'aorta alla cannula utilizzando suture chirurgiche. Successivamente, perfondere il cuore con 30 millilitri di soluzione NT per ripristinare la circolazione delle arterie coronariche. Poi passare al perfusato con 30 millilitri di soluzione Tyrode priva di calcio per arrestare il battito cardiaco.Successivamente, sostituire il perfusato con la soluzione isolante di collagenasi A per la digestione enzimatica. Dopo una digestione della durata di 20-25 minuti, cambiare rapidamente la soluzione di perfusione con la soluzione di Tyrode priva di calcio per arrestare ulteriori digestioni. Quindi afferrare il cuore con una pinzetta, staccarlo dalla cannula e posizionare il cuore in una piastra da 35 millimetri contenente soluzione KB.In seguito, identificare l'area del ventricolo sinistro. Rimuovere l'atrio, il ventricolo destro e la zona della giunzione atrioventricolare. Quindi trasferire il ventricolo sinistro in una nuova piastra da 35 millimetri contenente soluzione KB e tritare il tessuto in piccoli pezzi.Pipettare delicatamente i frammenti con una pipetta di plastica filtrata. Successivamente, filtrare le cellule attraverso un filtro in acciaio inox con apertura di 150 micron e trasferirle in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Dopodiché, centrifugare il campione a 150 ×g per 30 secondi e scartare il soprannatante.Risospendere i miociti in 10 millilitri di soluzione KB e lasciarli sedimentare per sei minuti. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di soluzione KB per 20 minuti. Dopo la sedimentazione in soluzione KB per 20 minuti, eliminare il soprannatante e risospendere i miociti con la soluzione A di reintroduzione del calcio. Ripetere la procedura sopra descritta con la soluzione B di introduzione del calcio. Quindi ripetere nuovamente la procedura con la soluzione NT per purificare i miociti disponibili.Conservare i miociti ventricolari isolati in questa soluzione e analizzarli entro quattro-sei ore. Quindi aggiungere la soluzione NT e la soluzione di caffeina 10 millimolare in ciascuna colonna della matita. Rimuovere eventuali bolle d'aria dai tubi per evitare ostruzioni causate dall'aria.Ora, collegare il tubo di ingresso con la soluzione NT per la perfusione della camera. Per la perfusione con ago del miocita bersaglio, collegare la punta del manifold multicanale al sistema di perfusione controllato a valvola. Successivamente, contare il numero di gocce provenienti dalla punta micrometrica della pipetta per 10 secondi e regolare manualmente il regolatore di flusso in modo da mantenere la velocità di flusso a circa tre gocce ogni 10 secondi.In questa procedura, aggiungere il stock di fura-2-acetossimetile in un millilitro di sospensione di miociti per ottenere una concentrazione finale di due micromoli. Mantenere al buio per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere i cardiomiociti con soluzione NT due volte.Successivamente, spegnere la luce e mantenere le cellule al buio. Posizionare i miociti nella camera di perfusione per 15 minuti prima di perfonderli con soluzione NT. Stimolare i miociti con una stimolazione elettrica a campo ad un hertz per cinque minuti utilizzando uno stimolatore.Ora, selezionare un miocita con una buona forma e una contrazione stimolata stabile utilizzando l'obiettivo microscopico 10X. Fare clic su File Nuovo file per creare un nuovo file di registrazione. Successivamente, modificare l'ingrandimento microscopico a 40X e ruotare l'orientamento della telecamera CCD per mantenere il miocita in posizione orizzontale.Quindi inquadrare il singolo miocita regolando l'adattatore per l'inquadratura cellulare e assicurarsi che lo sfondo sia nitido. Successivamente esporre i miociti alla luce emessa da una lampada allo xenon con filtri di eccitazione a 340 o 380 nanometri e acquisire le immagini dei miociti attraverso un obiettivo 40X. Rilevare il segnale fluorescente a 510 nanometri.Fare clic sul pulsante Start per registrare contemporaneamente la fluorescenza e la lunghezza dei sarcomeri utilizzando il sistema a fotomoltiplicatore a doppia eccitazione. Osservare le variazioni della lunghezza dei sarcomeri nei miociti e registrare simultaneamente mediante il modulo soft edge. In questa procedura, collegare la porta aux out dello stimolatore all'ingresso analogico del sistema di controllo delle valvole tramite un cavo BNC.Successivamente, impostare i parametri nel software di controllo della valvola, fare clic sul pulsante di download per scaricare la sequenza caricata nel programma e fare clic sul pulsante di attivazione per abilitare la funzione di trigger. Quindi, impostare lo stimolatore in modalità sequenza e configurare i parametri. In seguito, impostare lo stimolatore al passo S1 per stimolare i miociti del ventricolo sinistro a un hertz.Avviare la perfusione con l'ago alla velocità di 1,5 millilitri al minuto con soluzione NT. Selezionare un miocita bersaglio alla bassa ingrandimento microscopico e assicurarsi che possa essere raggiunto dalla micropunta della matita. Successivamente, modificare l'ingrandimento del microscopio a 400X.Ruotare l'orientamento della telecamera CCD per mantenere il miocita in posizione orizzontale. Successivamente, regolare l'apertura rettangolare sotto l'adattatore per il posizionamento della cellula in modo da ottenere una finestra adeguata riempita dai miociti. Quindi, regolare la posizione della matita fissata sul micromanipolatore e posizionare con attenzione la micropunta a una distanza pari al raggio del campo visivo rispetto al miocita bersaglio.Quindi regolare l'intervallo del flusso dell'ago in modo da coprire principalmente il miocita bersaglio e assicurarsi che il miocita non possa essere trascinato via dal flusso dell'ago. Dopo 60 secondi di stimolazione di base, spostare il cursore dello stimolatore al passo D2. Il resto del protocollo verrà eseguito automaticamente dallo stimolatore e dal comando delle valvole.Fare clic sul pulsante Pausa per interrompere la registrazione del file e spostare la vista microscopica in un'area vuota vicina. Quindi fare clic sul pulsante Registra per riprendere la registrazione per alcuni secondi e registrare i valori numerici di intensità a 340 e 380 nanometri per la correzione del fondo. Successivamente, aprire la finestra di dialogo Costante operativa e inserire i valori nel modulo relativo al fondo.Il software può correggere i valori del rapporto fura-2 sottraendo il fondo. Qui viene illustrato il protocollo per commutare automaticamente le valvole di perfusione e il sistema di stimolazione. Questa figura mostra i valori statistici della riserva di calcio del reticolo sarcoplasmatico e del rilascio frazionario di calcio per contrazioni indotte a un hertz nei gruppi diabetici e Sprague Dawley.Il gruppo diabetico ha mostrato una significativa riduzione della riserva di calcio nel reticolo sarcoplasmatico e del rilascio frazionario di calcio dal reticolo sarcoplasmatico rispetto al gruppo Sprague Dawley. Qui, il pannello del software mostra un'adattamento manuale a curva mono-esponenziale per la costante di tempo di decadimento dell'impulso di calcio indotto dalla caffeina. Questi istogrammi confrontano il Tau-caffeina e il rapporto Tau-1Hz/Tau-caffeina tra i gruppi diabetico e Sprague Dawley.Il gruppo diabetico ha mostrato valori significativamente aumentati di Tau-caffeina e Tau-1Hz/Tau-caffeina rispetto al gruppo Sprague Dawley. Questa procedura fornisce uno strumento fattibile e conveniente per esplorare il meccanismo di gestione del calcio intracellulare nella disfunzione cardiaca. Durante il tentativo di questa procedura, ci sono alcuni punti chiave da considerare, come l'adesione stabile dei miociti alla piastra, l'avvolgimento dell'interruttore del canale, il controllo della velocità di flusso della perfusione con ago e la distanza appropriata tra la punta dell'ago e il miocita bersaglio.

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Impara a valutare la riserva di calcio del reticolo sarcoplasmico e il rimozione diastolica del calcio nei cardiomiociti ventricolari isolati. Questo metodo consente di studiare la gestione del calcio intracellulare in condizioni patologiche come diabete e scompenso cardiaco.

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