Un modello di coltura cellulare di arterie di resistenza

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di coltivare insieme cellule endoteliali e muscolari lisce in vitro per creare giunzioni mioendoteliali che si verificano in arterie di resistenza di piccolo diametro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo cardiovascolare come la localizzazione delle proteine e l'attivazione delle cascate di segnalazione nella parete arteriosa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile isolare in modo specifico le frazioni della giunzione mioendoteliale dall'endotelio e dalla muscolatura liscia, cosa impossibile da fare utilizzando un'arteria reale.

La dimostrazione visiva di un'inclusione di paraffina è particolarmente critica, poiché le fasi di incorporazione possono essere difficili da apprendere senza vedere il processo. Iniziare la costruzione della co-coltura di cellule vascolari o VCCC, spruzzando piastre di Petri da 150 millimetri e coperchi con disinfettante e quindi strofinando con un tovagliolo di carta o salviette prive di lanugine. Quindi, spruzzare le piastre di Petri con etanolo al 70% e metterle nella cappa ad asciugare all'aria.

Aprire la piastra degli inserti del filtro in condizioni sterili. Rivestire il lato inferiore dei filtri con una soluzione di filactina pipettando fino a un millilitro di soluzione di filactina attraverso le fessure laterali nella parte inferiore della piastra. Assicurarsi che la metà inferiore del filtro sia coperta e lasciare gli inserti nella cappa, mantenendo il coperchio della piastra.

Dopo 30 minuti di trattamento con soluzione fiberaction, aspirare la soluzione in eccesso senza disturbare gli inserti del filtro. Quindi, capovolgere la piastra, posizionando i filtri nella metà inferiore della capsula di Petri pulita. Tripsinizzare un pallone di 225 centimetri quadrati di cellule muscolari lisce con tre millilitri di soluzione preriscaldata di tripsina EDTA.

Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungi nove millilitri di terreno SMC per neutralizzare la tripsina. Trasferire in un tubo conico e mescolare bene. Quindi, pipettare 10 microlitri su un emocitometro per determinare il numero di cellule.

Dopo aver eseguito un conteggio delle cellule, piastrate con cura 750 microlitri di sospensione cellulare contenente circa 75.000 cellule muscolari lisce sul lato inferiore di ciascun filtro. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte. Il secondo giorno, riempire ogni pozzetto di una piastra pulita a sei pozzetti con due millilitri di terreno SMC fresco preriscaldato.

Rimuovere il fluido da un inserto mediante aspirazione e trasferirlo sulla piastra a sei pozzetti con il mezzo SMC. Aggiungere un millilitro di una soluzione di gelatina bovina allo 0,5% sul lato superiore degli inserti e porre a 37 gradi Celsius, per almeno 30 minuti. Tripsinizzare un pallone di 225 centimetri quadrati di cellule endoteliali con tre millilitri di soluzione preriscaldata di tripsina EDTA.

Picchiettando delicatamente il pallone per sollevare le celle dalla piastra. Dopo aver risospeso le cellule nel terreno EC ed eseguito un conteggio cellulare, rimuovere la gelatina dal filtro. Quindi, piastra 360.000 EC in un volume di un millilitro sul lato superiore di ciascun inserto del filtro.

Lasciare incubare le cellule indisturbate a 37 gradi Celsius per 24 ore. Iniziare il frazionamento aspirando il terreno da una piastra a sei pozzetti di inserti nella cappa di coltura cellulare e quindi trasportarlo in una cella frigorifera con ghiaccio. Nella cella frigorifera, pipettare 10 microlitri di PBS sul lato SMC degli inserti.

Usa il sollevatore di celle per raschiare le SMC. Quindi, trasferire le cellule dal raschiatore a una capsula di Petri etichettata contenente tampone di lisi. Una volta che il raschiatore cellulare ha toccato il tampone di lisi, non lasciarlo toccare il filtro dell'inserto fino a quando non è stato completamente pulito e asciugato su carta assorbente.

Ripetere la rottamazione del filtro SMC ancora una o due volte, per rimuovere completamente i residui rimanenti della cella SMC. Quindi, pipettare 10 microlitri di PBS sul lato delle cellule endoteliali del filtro a inserto. Raschiare le cellule in una capsula di Petri opportunamente etichettata di tampone di lisi, come appena dimostrato.

Raccogliere il liquame cellulare dal lato EC del filtro con la pipetta e trasferirlo in una capsula di Petri adeguatamente etichettata. Essere molto accurati nel raschiare le cellule da entrambi i lati dei filtri per garantire una contaminazione cellulare minima nella frazione della giunzione mioendoteliale. Quindi, usa con attenzione il bisturi per ritagliare i filtri dall'inserto di plastica.

A tale scopo, tagliarne dal 70 all'80% dalla plastica e utilizzare una pinza per estrarre completamente il filtro dalla struttura dell'inserto in plastica. Puntare ciascun filtro in una provetta conica da 50 millilitri etichettata contenente il tampone di lisi. Assicurarsi che i filtri siano immersi nel tampone e rimangano bagnati.

Dopo che tutte le cellule sono state raccolte dai filtri, agitare il tubo MEJ da 50 millilitri alla massima potenza per 15 secondi o fino a quando non è ben miscelato. Rimuovere i filtri dal conico MEJ con una pinza, trascinandoli lungo le pareti laterali del tubo in modo da lasciare la massima quantità di proteine e liquidi nel tubo. Una volta rimossi tutti i filtri dal tubo conico MEJ, fai un giro veloce in una centrifuga per tirare tutto il liquido e le proteine sul fondo del tubo.

Dopo la centrifuga, trasferire il contenuto della provetta MEJ e le piastre di Petri SMC ed EC in provette da centrifuga separate più piccole. Quindi, centrifugare le provette a una temperatura vicina a 16.000 x G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere i surnatanti.

Quindi, saggiare i lisati cellulari per il contenuto proteico utilizzando un saggio zinconetico. Il quinto giorno di incubazione VCCC, aggiungere il 4% di PFA a ciascun pozzetto contenente un inserto filtrante risciacquato e incubare per una notte agitando a quattro gradi Celsius. Dopo circa 24 ore, trasferire gli inserti al 70% di etanolo per almeno 24 ore.

Processare i filtri a lungo termine su un processatore di tessuti automatizzato. Dopo la corsa, rimuovere un filtro dalla sua cassetta usando una pinza per tenere il filtro sul bordo e poi tagliare il filtro a metà con le forbici. Adagiare ciascuna delle due metà su una piastra fredda e riempire lo stampo da incasso con paraffina liquida.

Toccare molto brevemente lo stampo da incasso pieno sulla piastra fredda, quindi incorporare ciascuna metà del filtro nello stampo da incasso con il lato tagliato rivolto verso il basso per assicurarsi che il filtro sia sezionato dal centro. Usa una pinza per tenere il filtro in posizione per evitare che le metà cadano l'una nell'altra fino a quando la paraffina non si è raffreddata abbastanza da poterle stare da sole. Quindi, spostare lo stampo da incorporare su una piastra fredda fino a quando non si solidifica completamente.

Incorporare e sezionare l'inserto filtrato con orientamento verticale. Dopo il sezionamento, il VCCC può essere immunocolorato per l'immunofluorescenza trasversa. Questa immagine al microscopio elettronico per immunotrasmissione mostra un'arteria di topo con espressione di alfa globina al MEJ etichettata con perle d'oro, che appaiono come punti neri.

Questo western blot dimostra che l'espressione dell'inibitore dell'attivatore del plasminogeno uno è arricchita nella frazione MEJ rispetto alle frazioni EC o SMC. La plastica EC indica le EC coltivate su un piatto di plastica che non formano MEJ. L'immunocolorazione rivela la stretta compartimentazione del modello VCCC.

Il recettore alfa-1 adrenergico si vede solo nello strato delle cellule muscolari lisce, il recettore della bradichinina si vede solo nello strato delle cellule endoteliali. La colorazione con f actina è presente in entrambi i tipi di cellule al MEJ in vitro, come indicato dalla freccia bianca. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere tutto sterile fino al momento del raccolto, di impiattare accuratamente le cellule e di raschiare accuratamente i filtri.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il western blotting o l'immunofluorescenza per rispondere a ulteriori domande sulla localizzazione delle proteine, sui livelli di espressione o sull'attivazione.