Name: Dissezione della Retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Impara a dissezionare la retina umana e il complesso RPE-coroide per analisi proteomica. Questo metodo consente di raccogliere biopsie dalla fovea, macula e retina periferica con precisione.

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VBM è sostenuta da sovvenzioni NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 e R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant n.: 2013103 e la ricerca per prevenire la cecità (RPB), New York, NY. MT e GV sono supportati da NIH concedere T32GM007337.

questo studio è stato approvato dall'Università dell'Iowa &#39; s Institutional Review Board e aderisce ai principi stabiliti nella dichiarazione di Helsinki.
 1. Foveal e maculare biopsia Punch <ol><li>Open e farfalla l'occhio umano, tale che si compone di 4 distinti lembi di tessuto, come descritto in una precedente pubblicazione. 5</li> <li>a partire da un occhio umano butterflied inserito in una capsula Petri, centro uno strumento di biopsia del punzone da 4 millimetri sopra la fovea, premere verso il basso e rotolare delicatamente fino a quando non viene fatta un'incisione intorno alla fovea.</li>
	<li>Successivamente, generare un'incisione intorno al macula di centraggio e premendo verso il basso uno strumento di biopsia del punzone 8 mm pelle entro le arcate della macula, applicando una pressione delicata e rotolamento. Questo produrrà un anello di tessuto che circonda il primo secondo, esterno.</li>
</ol> 2. Periferico della retina biopsia Punch <ol><li>uso il punch di 4 mm pelle strumento di biopsia per fare una serie di pugni nella retina periferica, appena fuori l'arcade. Qui, fare due punzoni per ogni falda quadrante. 
	Nota: Dopo tutti i pugni sono fatte, l'occhio avrà due pugni concentrici nel centro, che rappresenta la fovea e macula, e due pugni alla base di ogni falda-per un totale di 8 pugni nella retina periferica.</li>
</ol> 3. Fovea e Macula biopsia collezione <ol><li>come il tessuto è ora pronto per la raccolta, raccogliere tutte le biopsie di tessuto in tubi separati del microfuge e congelamento con azoto liquido per l'elaborazione a valle. Conservare tutti i campioni a-80 ° C fino al momento di utilizzo.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta Colibri 0,12 per afferrare i bordi del tessuto traslucido della fovea retinica. Per raccogliere, elevare e separare il tessuto foveal dalla sottostante coroide-RPE.</li>
	<li>Allo stesso modo, utilizzare il forcipe Colibri 0,12 per afferrare l'anello esterno del tessuto traslucido macula. Se il tessuto è ancora attaccato al tessuto sottostante o adiacente, è possibile utilizzare un paio di forbici di Westcott attentamente tagliare il bordo, catturare solo il componente retinico e dissezione distanza qualsiasi tessuto di nervo ottico incluso nel punzone.</li>
</ol> 4. Collezione di Retina periferica <ol><li>utilizzare la pinzetta Colibri 0,12 per separare delicatamente i dischi di tessuto retinico periferico da RPE-coroide sottostanti e posto all'interno di tubi individuali del microfuge.</li>
	<li>Nel caso di residuo gel vitreale, usare il forcipe per sollevare e separare il gel di distanza per quanto possibile prima dell'accumulazione del tessuto retinico. Una volta tolta la retina, pigmentata RPE-coroide rimane di sotto.</li>
</ol> 5. Foveal e Macula RPE-coroide collezione <ol><li>uso il 0.12 Colibri pinze per afferrare i bordi del tessuto RPE-coroide scuro che si trova sotto l'area della fovea rimossa. Separare con cura questo tessuto dalla sclera e raccogliere.</li>
	<li>Usando la pinza stessa, afferrare i bordi dell'anello esterno di tessuto scuro di RPE-coroide sottostanti l'area maculare rimossa. Separare con cura questo tessuto da sclera afferrando i bordi in diversi punti intorno al ring e tirando leggermente. Alla fine, l'anello di tessuto RPE-coroide sarà essere sloggiato e possono essere raccolto. 
	Nota: Forcipe secondario nella mano opposta può essere utile nel manipolare il tessuto RPE-coroide durante la rimozione. Come il tessuto retinico, Wescott forbici possono essere utilizzate per aiutare a rimuovere tutto il tessuto che non è stato completamente inciso utilizzando lo strumento punch.</li>
</ol> 6. Collezione di RPE-coroide Retina periferica <ol><li>utilizzare il forcipe Colibri 0,12 per staccarsi le RPE-coroide nei settori periferici punch 8.</li>
	<li>Come in precedenza, posizionare il tessuto RPE-coroide in tubi del microfuge e congelamento con azoto liquido per l'elaborazione a valle. Mantenere tutti i campioni a-80 ° C fino a utilizzo.</li>
</ol> 7. Dissezione di forbici Nota: se la lama di biopsia del punzone è noiosa o lo strumento di biopsia punch non viene spinto abbastanza duro, potrebbe non esserci un Clean-Cut che circonda il tessuto.
<ol><li>In questi casi, tirare via il tessuto per quanto possibile e quindi utilizzare Westcott forbici per tagliare e separare.</li></ol>

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<li>Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+of+the+phosphoproteome+in+postmortem+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains.</a> PLoS One. 6 (6), e21405(2011).</li>
<li>Nagy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+postmortem+interval+on+biomolecule+integrity+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).</li>
<li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+frozen+tissue+samples+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection.</a> Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).</li>
</ol>

Conflitti di interesse non dichiarati.

Dopo tessuto raccolta, manipolazione e trattamento sono cruciali considerazioni14. Conservazione in azoto liquido è preferibile fissazione chimica, come quest'ultimo può causare danni alla struttura della proteina, che potrebbe inclinare analisi a valle. Inoltre, la conservazione in azoto liquido è preferito ai metodi che non comportano congelamento di campioni. In particolare, Ferrer et al hanno evidenziato differenze significative nei livelli della proteina tra cervello campioni conserv...

La retina, RPE e coroide sono tessuti complessi che mostrano importanti differenze regionali nell'espressione della proteina, funzione fisiologica e patologica predisposizioni1,2. Per esempio, malattie come la degenerazione Macular relativa all'età (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia sierosa centrale dimostrano caratteristica localizzazione all'interno della fovea, macula o retina periferia1,3, 4,6. Qui, presentiamo un metodo dimostrando retinico come distinta regioni possono essere campionate in modo indipendente. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una guida affidabile per la raccolta di campioni di tessuto dalle regioni foveale, maculare e periferiche della retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica. La spiegazione razionale per lo sviluppo e l'uso di questa tecnica è che attraverso analisi proteomica di queste regioni specifiche della retina, importanti intuizioni molecolare possono essere acquisite nelle funzioni fisiologiche e fisiopatologiche di queste regioni.
Questo approccio promette di rivelare la base di proteomica per la suscettibilità relativa malattia regionale e di facilitare l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici specifici. Infatti, le indagini di proteomica del vitreo e delle sue interazioni con la retina hanno fornito spunti preziosi per la composizione molecolare e la funzione del tessuto sano e malato5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Tuttavia, analisi proteomica comparativa chiaro di distinte regioni retiniche sono carenti. La tecnica contribuirà a sostenere questi studi tanto necessaria, fornendo vantaggi rispetto ad altri metodi dimostrando un approccio di raccolta del tessuto affidabili e riproducibili. Più così, l'approccio è molto accessibile, approfittando del punzone di tessuto di dimensioni standard e prontamente disponibili strumenti di biopsia. La nostra tecnica enfatizza l'appropriata raccolta e conservazione dei tessuti per proteomica elaborazione, facendo considerazioni importanti per la stabilità proteica e degradazione. Così, questo metodo è più adatto per gli investigatori considerando l'analisi molecolare a valle di proteomica fattori.

<table><tbody><tr><td>Strumento per biopsia con punzone cutaneo da 4 mm</td><td>Miltex</td><td>REF 33-34</td><td></td></tr><tr><td>Strumento per biopsia con punzone cutaneo da 8 mm</td><td>Miltex</td><td>REF 33-37</td><td></td></tr><tr><td>0,12 Colibri Forcipe</td><td>Stephens Instruments</td><td>S5-1145</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Wescott</td><td>Sklar Surgical Instruments</td><td>64-3146</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfuga</td><td>Eppendorf</td><td>#022364111</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Praxair, Inc.</td><td>7727-37-9 [R]</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione della retina umana e rpe-coroide per analisi proteomica

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

La retina umana è composto della neuroretina sensoriale e il sottostante dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), che è saldamente complessato allo strato coroidico vascolare. Diverse regioni della retina sono anatomicamente e molecolare distinte, facilitando funzioni uniche e dimostrando la suscettibilità alla malattia. Analisi proteomica di ciascuna di queste regioni e strati possono fornire le comprensioni vitale nel processo molecolare di molte malattie, compreso degenerazione Macular relativa all'età (AMD), mellito di diabete e il glaucoma. Tuttavia, separazione delle regioni retiniche e strati è essenziale prima analisi proteomic quantitativa possono essere compiuta. Qui, descriviamo un metodo per la dissezione e la collezione delle regioni retiniche foveale, maculare e periferiche e sottostante RPE-coroide complesso, che coinvolge le biopsie del punzone regionali e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano. Unidimensionale SDS-PAGE, nonché analisi proteomica a valle, come liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS), possono essere utilizzato per identificare le proteine in ogni strato retinico dissecata, rivelando biomarcatori molecolari per malattia retinica.

Tessuto di RPE-coroide e della retina possono essere elaborati in vari modi per soddisfare un'indagine individuale. Dopo la raccolta, il ricercatore sarà in possesso di campioni di tessuto RPE-coroide dalla regione foveal, macula esterno e retina periferica (Figura 1) e della retina. In particolare, il pugno di regione foveal includerà la fovea, il parafovea e una piccola quantità del perifovea adiacente. Il punzone maculare include il resto della regione per...

La retina umana è composta in modo funzionale e molecolare distinte regioni, tra cui la fovea, la macula e la retina periferica. Qui, descriviamo un metodo utilizzando biopsie punch e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano per sezionare e raccogliere queste regioni distinte della retina per analisi proteomica a valle.

Dissezione della Retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

In questo video verrà illustrato come prelevare biopsie tissutali dalla fovea, dalla macula e dalla retina periferica per la ricerca proteomica. In diversi passaggi utilizzeremo uno strumento per biopsie cutanee da quattro millimetri. L'occhio umano viene posizionato in una piastra di Petri dopo essere stato aperto a farfalla.Lo strumento per biopsia a punzone viene centrato esattamente sulla fovea, premere verso il basso e ruotare leggermente fino a quando viene effettuata un'incisione intorno alla fovea. Centrare e premere un punzone per biopsia di otto millimetri all'interno delle arcate della macula applicando una pressione delicata e una leggera rotazione. Nuovamente, utilizzare il punzone per biopsia di quattro millimetri per eseguire una serie di prelievi nella retina periferica appena al di fuori dell'arcata.Otteniamo due prelievi per ogni lembo. Dopo che tutti i prelievi sono stati effettuati, l'occhio avrà un aspetto simile a questo. E siamo pronti per iniziare il processo di raccolta del tessuto.Utilizziamo una pinzetta curva da 0,12 colibri per afferrare i margini del tessuto. Qui afferriamo il margine della retina foveale. La stessa pinzetta viene utilizzata per afferr

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Un metodo per l'isolamento di singole cellule retiniche e successiva amplificazione del cDNA è descritto loro. Unicellulari trascrittomica rivela il grado di eterogeneità cellulare presente in un tessuto e scopre nuovi geni marcatori per le popolazioni di cellule rare. Il protocollo di accompagnamento può essere regolato secondo molti tipi cellulari differenti.

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I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Questo lavoro presenta una preparazione alternativa della retina flatmount in cui la rimozione dei corpi cellulari dei fotorecettori consente una diffusione più rapida degli anticorpi e un migliore accesso con pipette patch ai neuroni retinici interni per esperimenti di immunoistochimica, ibridazione in situ ed elettrofisiologia.

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