Name: Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Scopri un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediate indotte da anticorpi specifici dell'emagglutinina influenzale. Questa tecnica consente analisi rapide in 24 ore per studi di immunologia e vaccinologia.

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Questo progetto è stato finanziato in parte con fondi federali dal National Institute of Allergy e malattie infettive, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sotto CEIRS contratto P01AI097092-04S1 (p.e.l.).

Gli esperimenti preformati in questo manoscritto sono stati fatti il codice istituzionale seguente Icahn School of Medicine di etica e regolamenti.
1. espressione di Influenza Virus Hemagglutinin tramite transfezione o infezione
Transfezione:
<ol><li>Cellule embrionali umane del rene (HEK 293T) piastra ad una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto in una cultura di tessuto bianca trattati piastra a 96 pozzetti e lasciate riposare per 4 h in un incubatore a 37 °C (con 5% CO2).</li>
	<li>Transfect cellule con 100 ng di DNA codificante per emoagglutinina virale e 0,2 μL di reagente di transfezione per pozzetto in un volume totale di 50 μL. Nota: Entrambi plasmide e trasfettante reagente sono diluiti in 1 x Opti-minimo essenziale Media (MEM) ridotto del siero medio.</li>
	<li>Dopo incubazione piastre in un incubatore a 37 °C con 5% CO2 per 18 h, rimuovere i supporti di transfezione.</li>
</ol>2. infezione
<ol><li>Cellule di rene canino piastra A549 o Madin Darby ad una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto in una cultura di tessuto bianca trattati piastra a 96 pozzetti e crescono per almeno 18 h in incubatore a 37 °C con 5% CO2.</li>
	<li>Virus diluito in 1 x MEM e infettare le cellule ad una molteplicità di infezione di 0,33 per 1h in un incubatore a 37 °C con 5% di CO2, 1 o 3. Volume totale deve essere uguale a 100 μL. Nota: x 10 MEM è diluito con acqua per fare un 1 x stock lavoro MEM diluizioni di virus citati sopra.</li>
	<li>Dopo l'infezione, rimuovere l'inoculo e aggiungere 100 μL di 1 x MEM nella piastra in assenza di tripsina.</li>
	<li>Crescere le cellule infettate per 18-24 h in un incubatore a 37 °C con 5% CO2.</li>
</ol>3. valutando l'attivazione FcRg/NFAT-mediata di attività luciferasica di anticorpi monoclonali o sieri
<ol><li>In primo luogo, è possibile sostituire mezzi di sviluppo delle cellule trasfettate o infetti con 25 µ l di media di dosaggio (1 x RPMI 1640 supplementato con 4% (vol/vol) basso IgG fetale bovino sieri).</li>
	<li>In una piastra a 96 pozzetti separata, eseguire diluizioni quadruplo degli anticorpi di interesse a partire a 30 μg/mL utilizzando il supporto di analisi. Effettuare diluizioni in triplici copie ed un esempio di disposizione di piastra è illustrata in Figura 1A. Assicurati di includere un controllo che esclude anticorpo (nessun controllo dell'anticorpo) così come un controllo di sfondo (tampone del saggio da solo). Nota: per entrambi il 'nessun anticorpo' e controlli di sfondo, aggiungere 25 µ l di tampone di dosaggio invece di anticorpo.</li>
	<li>Trasferimento 25 μL di anticorpi diluiti in serie da passo 3.2 a rispettivi pozzetti su piatto di cellule trasfettate o cellule infettate.</li>
	<li>Incubare la piastra in un incubatore a 37 °C (con 5% CO2) per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL della cella appropriata dell'effettore modificate Jurkat esprimendo murino FcgRIV o FcgRIIIa umano (75.000 di cellule/pozzetto). Volume totale per ogni bene dovrebbe essere 75 µ l e la concentrazione iniziale e finale dell'anticorpo è a 10 µ g/mL (Figura 1B). Nota: Per il controllo di sfondo, aggiungere 25 µ l di tampone di dosaggio invece di cellule effettrici. Per esaminare la fagocitosi cellulo-mediata anticorpo-dipendente, può essere utilizzato un cellulare Jurkat modificate esprimendo la FcgRIIa umana.</li>
	<li>Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 6 h.</li>
	<li>Disgelo e tampone substrato caldo luciferasi in un'acqua di 37 °C per circa 1 h prima dell'uso. Nota: Per rendere il tampone del substrato di luciferasi, ricostituire il liofilizzato luciferase assay substrato nel tampone fornito. Tampone substrato ricostituito può essere conservato a-30 °C a-10 °C fino a sei settimane.</li>
	<li>Aggiungere 75 μL/pozzetto di tampone substrato luciferasi in tutti i pozzetti tranne per il controllo di sfondo.</li>
	<li>Continua a leggere un luminometro.</li>
	<li>Calcolare l'induzione di piega con la seguente equazione: piegare induzione = (valore di valore-sfondo indotto) / (nessun valore di valore-sfondo di mAb).</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
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<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il metodo qui descritto consente di misurare la capacità di un anticorpo monoclonale specifico HA per coinvolgere il FcγRIV murino. L'antigene bersaglio, emoagglutinina di virus influenzale, è espresso sulla superficie delle cellule dopo l'infezione da virus o transfezione del DNA del plasmide. Il dosaggio ulteriormente è favorevole all'utilizzo di diverse proteine virali di superficie espressa in combinazione con altri FcγRs (esseri umani o murino). Inoltre, abbiamo utilizzato campioni di siero per valutare la capacità ...

Immunità prevista dal vaccino influenzale stagionale tradizionalmente è stata valutata dal emoagglutinazione inibizione (HI) analisi1, che misura la presenza di anticorpi che il sito di legame del recettore del hemagglutinin di destinazione. Questi anticorpi HI-attivo possono conferire immunità sterilizzante, ma sono generalmente stretti nella loro ampiezza di protezione, fornire l'immunità per solo un selezionare alcuni ceppi del virus dell'influenza. L'isolamento e la caratterizzazione di largamente reattivi anticorpi monoclonali che riconoscono l'emoagglutinina (HA) suggerire che lo sviluppo di un vaccino antinfluenzale universale è a portata di mano2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. uno degli obiettivi principali di un vaccino antinfluenzale universale è quello di indurre una risposta anticorpale forte verso le regioni conservate del virus influenzale9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. in linea di massima gli anticorpi reattivi che riconoscono questi epitopi conservati, composto di neutralizzazione e non neutralizzando gli anticorpi17,18, hanno dimostrati di richiedono interazioni Fc-FcγR per ottimale protezione in vivo ed evidenziare il contributo di immunità Fc per la complessiva risposta immunitaria al virus influenzale19,20.
Componenti di protezione sono fondamentali per valutare l'immunità all'infezione. Questi indicatori consentono a scienziati e clinici valutare l'efficacia dei vaccini, il significato dei dati e il corso del trattamento. Il solo correlazione stabilito di protezione contro l'infezione da virus influenzale è l'analisi di inibizione di emagglutinazione. Un titolo di 01:40 è associato con una riduzione del 50% del rischio di malattia1,21 – e riflette la presenza di anticorpi che inibiscono agglutinazione prendendo di mira il recettore vincolante sito situato sulla testa globulare della HA. Tuttavia, dovrebbe anche essere notato che le risposte delle cellule T possono essere una componente migliore di protezione contro l'infezione da virus influenzale negli anziani. Interessante, un recente rapporto suggerisce che l'attività di inibizione della neuraminidasi può essere un migliore indicatore di immunità all'influenza22. Fortunatamente, tipico in vitro dosaggi come analisi di inibizione di neutralizzazione o neuraminidasi possono misurare anticorpi specifici del gambo o neuraminidasi HA. La maggior parte di questi saggi convenzionali in vitro , tuttavia, solo prendere in considerazione la funzione della regione di associazione dell'antigene dell'anticorpo e non misurano il ruolo della regione Fc. Inoltre, il contributo degli anticorpi non neutralizzanti che proteggere tramite Fc recettore fidanzamento in vivo non sono rilevati17,18. Al fine di misurare la protezione garantita dagli anticorpi che inducono immunità Fc quali citotossicità di anticorpo dipendente cellulo-mediata (ADCC), è necessaria un'analisi robusta in vitro .
Il metodo descritto di seguito valuta la capacità di anticorpi monoclonali murini di indurre funzioni Fc-mediata attraverso l'uso di una linea di cellule Jurkat geneticamente esprimendo un'attivazione murino digitare 1 FcR, FcγRIV. Impegno di anticorpo del FcγR trasduce quel fattore nucleare di trigger di attività luciferasica attivato T-cellule-mediata di segnalazione intracellulare. Il saggio ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali che richiedono isolamento e coltura di cellule effettrici primarie e l'uso di citometria a flusso per rilevare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata19,,23,24 ,25,26. In primo luogo, il protocollo descritto qui può essere facilmente adattato per incorporare diversi bersagli virali, FcγRs e anticorpi appartenenti a specie diverse (umane e murine). In secondo luogo, l'uso di una modifica per la cella di Jurkat linea esprimendo un FcγR con un gene reporter luciferasi sotto un fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) consente per un saggio di grande formato che possa essere facilmente analizzato utilizzando un lettore di luminescenza di misura. Qui, l'attivazione tradizionale di cellule effettrici primario viene sostituito con l'induzione di NFAT-luciferasi all'impegno dell'anticorpo di un FcγR sulla superficie della cellula Jurkat. Questo test di formato piastra a 96 pozzetti consente la misurazione di fino a quattro diversi campioni in triplici copie con sette diluizioni – un numero di campioni che potrebbe essere ingombrante usando le tecniche tradizionali. Ci sono ulteriori punti da considerare con questo test che può influenzare la progettazione di esperimenti e l'interpretazione dei dati. Il bersaglio virale deve essere espresso sulla superficie delle cellule in ordine per riconoscimento anticorpale. Per ovviare a questo inconveniente, l'antigene bersaglio (ad es. una proteina virale interna) può essere rivestito direttamente sulla superficie di una piastra. Tuttavia, questo non è ancora stato rigorosamente testato. Inoltre, la modifica per la linea cellulare Jurkat esprime un solo tipo di attivazione FcγR e non esprime alcun FcγRs inibitorio, mentre linee cellulari primarie esprimono tutti i recettori in un contesto fisiologico.
Precedentemente abbiamo usato questo test per dimostrare che l'epitopo specificità in un contesto policlonale svolge un ruolo cruciale nella regolazione di funzioni effettrici Fc-mediata e che l'attivazione ottimale della risposta cellulo-mediata anticorpo-dipendente richiede due punti di Contattare27,28. Qui, descriviamo un metodo che valuta la capacità degli anticorpi monoclonali specifici del gambo per coinvolgere e attivare murino attivazione FcγRIV. Anche se ci sono eccezioni29,30, un gran numero di anticorpi reattivi largamente la regione gambo antigenicamente conservata del hemagglutinin di destinazione e quindi gioca un ruolo importante nello sviluppo di una influenza universale vaccino.

<table><tbody><tr><td>Celle A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>Cellule epiteliali basali alveolari umane adenocimiche</td></tr><tr><td>Cellule HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Cellule renali embrionali umane</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11668019</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM Siero ridotto Medium ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti trattata con coltura di tessuti bianchi</td><td>Corning, Inc.</td><td>3917</td><td>Piastre per saggi</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat che esprime cellule murine FcgRIV</td><td>Promega</td><td>M1201</td><td>Il kit include cellule, il sistema di analisi Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e basso siero IgG</td></tr><tr><td>Jurkat che esprime cellule umane FcgRIIIa</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>fornisce include cellule, sistema di saggio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e siero</td></tr> <tr><td>a basso contenuto di IgGIl kit Jurkat che esprime cellule umane FcgRIIa</td><td>Promega</td><td>G9901</td><td>include cellule, sistema di analisi della luciferasi Bio-Glo, 1X RPMI e siero a basso contenuto di IgG</td></tr><tr><td>Luminometro Lettore</td> multimodale <td>BioTek</td><td>Synergy H1 Lettore di</td><td>piastre di luminescenza</td></tr> Sistema di <tr><td>analisi della luciferasi Bio-Glo Promega</td><td></td><td>G7940</td><td>Contiene tampone per il saggio della luciferasi e substrato del test della luciferasi</td></tr><tr><td>Cellule</td> <td>renali canine Madin DarbyATCC</td><td>CCL-34</td><td>Cellule renali canine</td></tr></tbody></table>

un metodo per valutare le funzioni effettrici fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di hemagglutinin di riossidazione

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Gli anticorpi svolgono un ruolo cruciale nell'accoppiamento la risposta immunitaria innata e adattativa contro gli agenti patogeni virali attraverso i loro domini di legame dell'antigene e Fc-regioni. Qui, descriviamo come misurare l'attivazione di Fc funzioni effettrici dagli anticorpi monoclonali targeting l'emoagglutinina di virus dell'influenza con l'uso di una linea di cellule Jurkat geneticamente esprimendo un'attivazione digitare 1 Fc-FcγR. utilizzando questo metodo, la contributo delle specifiche interazioni Fc-FcγR conferito dalle immunoglobuline può essere determinata usando un'analisi in vitro .

Abbiamo dimostrato che un gambo specifiche mAb, 6F12, ma non testa testa-specifiche mAb, PY102, era in grado di attivare le cellule natural killer di primarie aumentando CD107a e interferone γ19. Per modellare la capacità di un anticorpo specifico del gambo di attivare le cellule NK umane primarie, ci mostrano che un mAb specifici del gambo, 6F12, robustamente può attivare la cella di Jurkat modificata esprimendo la murino FcγRIV da ~ 14-fold. D'altra parte, il mAb di testa-specifico, PY102 e il c...

Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata dagli anticorpi che hanno come destinazione l'emagglutinina del virus dell'influenza. Questo dosaggio può essere adattato anche per valutare la capacità di anticorpi monoclonali o policlonali sieri altre glicoproteine di superficie virale di targeting di indurre immunità Fc.

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è valutare la capacità di un anticorpo o di un campione di siero di attivare la funzione effettrice mediata dal frammento Fc. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'immunologia e della vaccinologia misurando l'attivazione dell'immunità mediata dal frammento Fc dipendente dagli anticorpi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'esperimento può essere eseguito entro 24 ore, dalla preparazione del materiale all'analisi dei dati.Dimostrer&agrave; questa procedura Mark Bailey, studente laureato del laboratorio di Peter Palese. Per indurre l'espressione dell'emagglutinina del virus dell'influenza mediante trasfezione, piastrare prima cellule renali embrionali umane 293 a una concentrazione di due volte 10 alla quarta cellule per pozzetto in una piastra da coltura tissutale bianca da 96 pozzetti. Dopo quattro ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2, trasfettare le cellule con 100 nanogrammi di DNA codificante per l'emagglutinina virale e 0,2 microlitri di reagente di trasfezione per pozzetto, per un volume totale di 50 microlitri di mezzo ottimale ridotto in siero 1X.Aggiungere i complessi DNA-liposoma in ogni pozzetto per la trasfezione e rimettere la piastra nell'incubatrice per altre 18 ore. Per indurre l'espressione dell'emagglutinina del virus dell'influenza mediante infezione, seminare le cellule A549 a una concentrazione di due volte 10 alla quarta cellule per pozzetto in una piastra bianca da 96 pozzetti trattata per coltura tessutale, e incubare per almeno 18 ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Al termine dell'incubazione, diluire il virus dell'influenza a una multiplicità di infezione di tre in 100 microlitri di mezzo MEM 1X per pozzetto e infettare le cellule A549 per un'ora nell'incubatore per colture cellulari.Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con 100 microlitri di mezzo MEM fresco 1X senza virus e reinserire le cellule nell'incubatore per altre 18-24 ore. Per valutare la capacità di specifici anticorpi di interesse di riconoscere le cellule esprimenti emagglutinina, sostituire il sopranatante delle colture cellulari colpite dal virus con 25 microlitri di mezzo per il saggio di citotossicità mediata da cellule dipendente dagli anticorpi (ADCC). Successivamente, in una diversa piastra a 96 pozzetti, eseguire quattro diluizioni seriali complete degli anticorpi di interesse in triplicato, in mezzo ADCC fresco, partendo da 10 microgrammi per millilitro secondo lo schema indicato, avendo cura di includere i controlli di fondo e senza anticorpi.Una volta diluito completamente l'anticorpo, trasferire 25 microlitri dell'anticorpo diluito nei pozzetti corrispondenti della piastra cellulare sperimentale e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 15 minuti, aggiungere 7,5 volte 10 alla quarta cellule Jurkat effettrici modificate che esprimono il recettore Fc appropriato per pozzetto in 25 microlitri di mezzo ADCC, per un volume finale di 75 microlitri di mezzo ADCC per pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per sei ore, scongelando il tampone del substrato della luciferasi in un bagno a 37 gradi Celsius durante l'ultima ora dell'incubazione.Quando il tampone è pronto, aggiungere 75 microlitri di tampone del substrato per la luciferasi in tutti i pozzetti tranne quello di controllo del fondo e leggere la piastra su un luminometro. Successivamente, può essere calcolata l'induzione di citotossicità cellulare mediata da cellule dipendente dagli anticorpi nelle colture cellulari trasfettate o infette. In questo esperimento, un anticorpo monoclonale specifico per lo stock ha attivato e modificato in modo robusto le cellule Jurkat esprimenti il recettore Fc gamma murino quattro di circa 14 volte rispetto agli anticorpi monoclonali specifici per la testa e agli anticorpi IgG di controllo.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare un esperimento per valutare la capacità di specifici anticorpi di interesse ad attivare l'immunità mediata dalla porzione Fc.

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Un metodo semplice macchia di slot è stato sviluppato per la quantificazione del emoagglutinina e neuraminidasi dell'influenza virale utilizzando anticorpi universali indirizzare le proprie sequenze più conservate identificate attraverso l'analisi bioinformatica. Questo approccio innovativo può fornire una valida alternativa alla determinazione quantitativa di tutti i emoagglutinina e neuraminidasi virale.

Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Il video mostra un test di inibizione dell'emoagglutinazione per rilevare anticorpi sierici contro antigeni specifici. La conferma dell'inibizione dell'emoagglutinazione nel pozzetto del test e dell'emoagglutinazione nel pozzetto di controllo si ottiene attraverso modelli visivi distinti. Questo test svolge un ruolo cruciale nella valutazione della risposta immunitaria, dell'efficacia del vaccino e nello studio delle infezioni virali in virologia e immunologia.

Il test di inibizione dell'emoagglutinazione per rilevare gli anticorpi sierici contro un antigene bersaglio

Questo video mostra un test che misura l'attivazione mediata da anticorpi delle funzioni effettrici delle cellule T. L'aggiunta di un anticorpo monoclonale specifico per l'emoagglutinina (HA) del virus dell'influenza alle cellule di mammifero trasfettate che esprimono HA provoca la formazione di immunocomplessi con HA. Dopo l'introduzione di cellule T ingegnerizzate che esprimono recettori Fc e un reporter della luciferasi, le cellule T vengono attivate dai complessi anticorpo-HA e questa...

Misurazione dell'attivazione delle funzioni effettrici mediate da FC da parte degli anticorpi HA

Questo video mostra un test che misura i titoli anticorpali inibitori della neuraminidasi dell'influenza (NA) in un campione di siero. Un campione di siero contenente anticorpi contro NA viene aggiunto a una piastra a micropozzetti rivestita di fetuina. Dopo l'aggiunta del virus, gli anticorpi impediscono al NA virale di scindere la fetuina ed esporre la sua porzione di galattosio. Viene quindi aggiunta una lectina coniugata con perossidasi, che si lega al galattosio esposto. Il titolo...

Un test per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza

Utilizzando una strategia di microarray di glicani stampati, è stato miniaturizzato un test convenzionale su piastra a 96 pozzetti per l'analisi dell'avidità e della specificità dell'emoagglutinina del virus dell'influenza A per i recettori contenenti acido sialico.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Descriviamo il test della lectina enzimatica (ELLA) per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza (NA) nei sieri. Il test utilizza l'agglutinina di arachidi per quantificare i residui di galattosio che diventano accessibili quando NA rimuove l'acido sialico da piastre a 96 pozzetti rivestite di fetuina.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

I protocolli presentati viene descritto come eseguire un'analisi di inibizione di emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza da campioni di siero dei destinatari del vaccino di riossidazione. Il primo test determina concentrazioni di antigene virale ottimale di emagglutinazione. Il secondo test quantifica i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza di inibizione di emagglutinazione.

Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza

Influenza A virus (IAVs) è importanti patogeni respiratori umani. Per capire la patogenicità di IAVs e per eseguire test preclinici di approcci vaccinali romanzo, modelli animali che imita la fisiologia umana sono necessari. Qui, descriviamo le tecniche per valutare IAV patogenesi, le risposte umorali e l'efficacia del vaccino utilizzando un modello murino di infezione.

Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un microarray proteico costruito stampando antigeni influenzali su vetrini rivestiti di nitrocellulosa per sondare simultaneamente il siero per più isotipi anticorpi contro oltre 250 antigeni provenienti da diversi ceppi di virus, quindi consentendo la misurazione dell'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus.

Uso di un microarray antigeno influenzale per misurare l'ampiezza degli anticorpi del siero attraverso i sottotipi di virus

Questo documento descrive i protocolli di valutazione della risposta Tfh e GC B nel modello di topo di infezione da virus influenzale.

Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante l'infezione da virus influenzale A nei topi

Scopri un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediate indotte da anticorpi specifici dell'emagglutinina influenzale. Questa tecnica consente analisi rapide in 24 ore per studi di immunologia e vaccinologia.

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

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