Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

L'obiettivo generale di questo protocollo è valutare la capacità di un anticorpo o di un campione di siero di attivare la funzione effettrice mediata da Fc. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia e della vaccinologia misurando l'attivazione dell'immunità mediata da Fc anticorpo-dipendente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'esperimento può essere fatto entro 24 ore dalla preparazione del materiale all'analisi dei dati.

A dimostrare questa procedura sarà Mark Bailey, studente laureato presso il laboratorio di Peter Palese. Per indurre l'espressione dell'emoagglutinina del virus dell'influenza attraverso la trasfezione, prima piastra di rene embrionale umano 293 cellule a una concentrazione di due volte 10 al quarto per pozzetto in una coltura di tessuto bianco trattata con una piastra a 96 pozzetti. Dopo quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, trasfettare le cellule con 100 nanogrammi di DNA che codifica per l'emoagglutinina virale e 0,2 microlitri di reagente di trasfezione per pozzetto e un volume totale di 50 microlitri di terreno sierico 1X ridotto in modo ottimale.

Aggiungere complessi di liposomi di DNA a ciascun pozzetto per trasfettare e rimettere la piastra nell'incubatore per altre 18 ore. Per indurre l'espressione dell'emoagglutinina del virus dell'influenza attraverso l'infezione, le cellule A549 sono state piastrate a una concentrazione di due volte 10 al quarto per pozzetto in una coltura di tessuto bianco trattata con una piastra a 96 pozzetti per un'incubazione di almeno 18 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Al termine dell'incubazione, diluire il virus dell'influenza a una molteplicità di infezione di tre su 100 microlitri di terreno MEM 1X per pozzetto e infettare le cellule A459 per un'ora nell'incubatore di coltura cellulare.

Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con 100 microlitri di terreno MEM 1X fresco senza virus e rimettere le cellule nell'incubatore per altre 18-24 ore. Per valutare la capacità di specifici anticorpi di interesse di colpire le cellule che esprimono emoagglutinina, sostituire il surnatante delle colture cellulari influenzate viralmente con 25 microlitri di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente o terreno di saggio ADCC. Successivamente, in una piastra separata da 96 pozzetti, eseguire quattro diluizioni complete degli anticorpi di interesse in triplicato in terreno ADCC fresco a partire da 10 microgrammi per millilitro secondo lo schema e avendo cura di includere il background e nessun controllo anticorpale.

Quando tutto l'anticorpo è stato diluito, trasferire 25 microlitri dell'anticorpo diluito nei pozzetti corrispondenti appropriati nella piastra cellulare sperimentale e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 15 minuti, aggiungere 7,5 volte 10 alla quarta cellula effettrice Jurkat modificata che esprime il recettore Fc appropriato per pozzetto in 25 microlitri di terreno ADCC per un volume finale di 75 microlitri di terreno ADCC per pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per sei ore, scongelando il tampone del substrato di luciferasi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius durante l'ultima ora di incubazione.

Quando il tampone è pronto, aggiungere 75 microlitri di tampone per substrato di luciferasi a tutti i pozzetti tranne il pozzetto di controllo dello sfondo e leggere la piastra su un luminometro. È quindi possibile calcolare l'induzione del fold della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle colture cellulari trasfettate o infette. In questo esperimento, un anticorpo monoclonale stock-specifico ha attivato e modificato in modo robusto le cellule Jurkat che esprimono il recettore gamma Fc 4 murino di circa 14 volte rispetto agli anticorpi monoclonali specifici per la testa e agli anticorpi IgG di controllo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare un esperimento per valutare la capacità di specifici anticorpi di interesse di attivare l'immunità mediata da Fc.