Un metodo generale per la rilevazione Nitrosamide formazione nel metabolismo In Vitro di nitrosammine di citocromo P450s

L'obiettivo generale di questa metodologia è determinare se il citocromo P450 può ossidare processivamente le nitrosammine n in nitosamide in vitro. Questo metodo avvantaggia il campo tossicologico valutando se le nitosamine sono direttamente metabolizzate in nitrosamide. Poiché le nitrosamide sono relativamente stabili nel DNA alchilato, potrebbero svolgere un ruolo nella cancerogenesi.

Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di uno spettrometro di massa altamente sensibile che fornisce limiti di rilevamento inferiori a quelli precedentemente raggiunti per saggi analoghi sul metabolismo delle nitrosammine in vitro. Per iniziare questa procedura, inserire in un forno un pallone a fondo tondo da 25 millilitri, contenente un'ancoretta magnetica. Asciugare per 16 ore a 140 gradi Celsius.

Successivamente, trasferire il pallone in una cappa aspirante e raffreddarlo sotto un flusso di azoto gassoso. Aggiungere 31,8 milligrammi di norcotinina, cinque millilitri di anidride acetica e un millilitro di acido acetico al pallone e iniziare a mescolare. Trasferire il pallone in un bagno di acqua ghiacciata.

Aggiungere 33,3 milligrammi di nitrito di sodio. Continuare a mescolare per 2,5 ore, quindi versare la reazione in 18 millilitri di acqua ghiacciata per spegnere la reazione. Trasferire immediatamente la soluzione in un imbuto separatore contenente 18 millilitri di DCM ed estrarre la soluzione acquosa.

Estrarre lo strato acquoso altre due volte, utilizzando 9 millilitri di DCM ogni volta. Quindi asciugare le sostanze organiche accumulate oltre 100 milligrammi di solfato di magnesio per due minuti. Dopo il filtraggio, utilizzare un evaporatore rotante per concentrare la soluzione a 30 gradi Celsius per ottenere un olio giallo grezzo.

Purificare il composto grezzo utilizzando la cromatografia su colonna come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, sciogliere il composto puro in un millilitro di cloroformio deuterato. Utilizzando la risonanza magnetica, confermare la struttura e la molarità della soluzione come indicato nel protocollo di testo.

Conservare questa soluzione al buio a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius fino al momento del bisogno. Quindi confermare l'accuratezza della massa genitore e determinare le masse ioniche del prodotto della soluzione NNC pura mediante infusione diretta su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione, come indicato nel protocollo di testo. Per iniziare, rimuovi i reagenti necessari da un congelatore a 80 gradi Celsius e scongelali con ghiaccio.

Una volta scongelato, utilizzare un tampone di reazione di forza 0,5 per diluire i baculosomi nel sistema di rigenerazione NADPH 1-10 e 1-50 rispettivamente, in una provetta da un millilitro. Quindi aggiungere tre microlitri della soluzione madre NADP a una provetta da un millilitro contenente 97 microlitri di un tampone di reazione di forza 0,5. Per ogni incubazione, preparare una provetta da un millilitro aggiungendo 40 microlitri di una soluzione NNN a quattro micromolari realizzata con tampone di reazione.

Aggiungere 50 microlitri di soluzione enzimatica contenente cinque picomoli di P450 2A6 in ogni provetta. Preincubare a bagnomaria a 37 gradi per due minuti. Quindi aggiungere 10 microlitri di soluzione di NADP+ diluita in ogni provetta.

Incubare a 37 gradi Celsius per un tempo compreso tra uno e 30 minuti. Successivamente, aggiungi prima 10 microlitri di solfato di zinco normale 3.0, quindi aggiungi 10 microlitri di idrossido di bario normale 3.0 per estinguere la reazione. Agitare la soluzione per formare un precipitato bianco.

Quindi, centrifugare a ottomila Gs per quattro minuti. Raccogliere immediatamente il surnatante e analizzare due microlitri mediante cromatografia liquida con ionizzazione nanoelettrospray positiva ad alta risoluzione e spettrometria di massa tandem. In questo studio, la norcotinina viene nitrosata a NNC in modo pulito e ad alta resa, producendo uno standard per l'uso nell'esperimento in vitro.

Il successo della reazione è verificato dall'analisi spettroscopica, inclusa la spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione, che ha confermato che la massa del genitore è entro cinque parti per milione dal valore teorico. La frammentazione della spettrometria di massa tandem di NNC viene quindi utilizzata per determinare le masse ioniche prodotte più abbondanti. Come si può vedere, i due ioni prodotti più abbondanti sono 134 e 162, con un rilevamento di massa accurato fino a cinque cifre decimali.

L'NNC sintetizzato viene quindi utilizzato come standard per il saggio del metabolismo in vitro P450. Nelle condizioni utilizzate, NNC sintetico eluisce a circa 17,5 minuti, con picchi ben risolti sia nei canali ionici del genitore che in quelli del prodotto. In conformità con il controllo positivo, la formazione di NNC si osserva nelle incubazioni di un minuto, cinque minuti e 10 minuti.

Se eseguita correttamente, l'analisi inspectroscopica della sintesi di nitrosamide può essere eseguita in circa sei ore. Allo stesso modo, il test in vitro con incubazioni multiple non dovrebbe richiedere più di otto ore. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla valutazione del rischio per i tumori correlati al tabacco, perché la misurazione dei biomarcatori correlati alla nitrosamide potrebbe essere informativa sull'attivazione individuale delle nitrosammine.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di elaborare rapidamente le incubazioni enzimatiche. Le nitrosamidi si idrolizzano in queste condizioni e non dovrebbero rimanere a lungo prima dell'analisi di spettrometria di massa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare gli standard di nitrosamide e valutare se sono formati in vitro dal corretto sistema di citocromo nitrosamminico P450.

Non dimenticare che lavorare con NNN, NNC o agenti cancerogeni correlati può essere pericoloso. Questi composti devono essere sempre maneggiati in una cappa aspirante indossando un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti. Inoltre, tutti i rifiuti cancerogeni devono essere adeguatamente conservati ed etichettati.