Biofilm orali campionamento per l'analisi di Microbiome nei bambini sani
December 31st, 2017
Cambiamenti nel microbioma orale per tutta l'infanzia sono di crescente interesse. Confronto tra diversi microbiome studi rivela una mancanza di protocolli di campionamento standardizzati. Spazio limitato rende il solco subgengivale suono dei bambini impegnativi di campionamento. Carta del punto di campionamento è presentato qui in dettaglio come il metodo di scelta per questa zona.
L'obiettivo generale di questa procedura è presentare un metodo standardizzato per il campionamento orale di biofilm per l'analisi del microbioma in bambini sani. Ciò si ottiene preparando e sterilizzando prima gli strumenti e il materiale. Successivamente, il bambino viene preparato per il campionamento del biofilm.
Quindi il campionamento del biofilm viene eseguito da tre siti, il solco sottogengivale, la mucosa dalla piega vestibolare e la saliva. Infine, i campioni vengono conservati sistematicamente. Infine, le analisi del microbioma orale saranno eseguite per rispondere a domande cliniche e scientifiche.
Ciao, sono Elizabeth e sono un ortodontista. La mia ricerca si concentra sui cambiamenti del microbioma orale che accompagnano il trattamento ortodontico. Il campionamento del biofilm orale può essere complicato.
Lo spazio nel solco sottogengivale è limitato, soprattutto nei bambini. Confrontando i nostri dati sul microbioma con la ricerca mondiale, abbiamo riscontrato una mancanza di protocolli di campionamento standardizzati. Con questo video, facciamo il primo passo per colmare questa lacuna.
Le punte di carta calibrate e sterili che vengono solitamente utilizzate nella terapia endodontica vengono tagliate al primo anello per standardizzarne la lunghezza. Dopo il taglio, i punti di carta devono essere irradiati con raggi UV per evitare la contaminazione del DNA e dell'RNA. Le provette per lo stoccaggio saranno sterilizzate in autoclave e irradiate con raggi UV.
Prima del campionamento del biofilm, i denti devono essere puliti completamente, a partire dall'applicazione del burro di cacao. Quindi i denti vengono macchiati con la divulgazione della placca. Dopo la colorazione, la bocca viene risciacquata con acqua.
I denti vengono lavati correttamente con uno spazzolino elettrico e acqua. Non viene applicato alcun dentifricio, poiché ciò altererebbe il biofilm orale. Un divaricatore per guance e lingua viene utilizzato per mantenere la bocca aperta e asciutta.
Il posizionamento del divaricatore richiede mani esperte e ferme, in modo da ridurre al minimo il disagio per il bambino e mantenere la procedura il più breve possibile. Vengono utilizzate pinzette dentali sterili e il sito di campionamento rimane inalterato durante la procedura. I denti vengono puliti e asciugati con tamponi di cotone sterili per evitare l'assorbimento di liquido sopragengivale durante il campionamento dei punti cartacei.
Diversi metodi possono essere utilizzati per il campionamento di biofilm nella cavità orale. A causa dello spazio limitato nel solco sottogengivale dei bambini, il campionamento dei punti di carta è il metodo di scelta. I punti carta vengono inseriti tangenzialmente fino a una lunghezza definita di quattro millimetri per 20 secondi.
Particolare attenzione deve essere prestata a non traumatizzare l'epitelio giunzionale. I punti di carta vengono quindi tagliati al terzo segno a una lunghezza standardizzata di quattro millimetri. Il punto di carta può anche essere inserito contemporaneamente nello stesso sito o i campioni possono essere raggruppati da più siti.
L'apparato a secco viene rimosso per il campionamento della mucosa e della saliva. I punti di carta possono essere applicati allo stesso modo per campionare il biofilm della mucosa nella piega vestibolare. Il biofilm salivare può essere raccolto sputando saliva non stimolata.
A seconda del disegno dello studio, i punti di carta saranno conservati come campioni singoli, aggregati o paralleli. Un sistema di stoccaggio con codice colore faciliterà l'ulteriore gestione dei campioni. Infine, i campioni vengono conservati per l'analisi del microbioma a meno 80 gradi Celsius.
Sono stati sviluppati diversi kit commerciali per l'identificazione rapida e accurata dei batteri parodontopatogeni. I punti cartacei vengono inviati a laboratori specializzati. L'estrazione, la preparazione e l'analisi del DNA vengono quindi eseguite entro tre ore.
Il DNA può anche essere utilizzato nella ricerca per studi sul microbioma. Il sequenziamento di nuova generazione, ad esempio, produce set di dati completi sul microbioma. È possibile analizzare l'abbondanza relativa complessiva di alcune specie batteriche, così come i cambiamenti nel microbiota dovuti al cambiamento delle condizioni.
Questo grafico a barre e la mappa di calore mostrano l'abbondanza relativa nel microbiota sottogengivale a livello di phylum e di ordine. Le differenze nella composizione microbica nel tempo, i confronti tra o all'interno degli individui o i diversi metodi di campionamento sono presentati negli istogrammi. Questa figura mostra i risultati di un confronto tra due metodi di campionamento, Modo A e Modo B, su diversi livelli tassonomici.
L'analisi statistica dei valori creati con il sequenziamento di nuova generazione può essere presentata in tabelle. Diversi punti temporali, come mostrato in questa tabella, possono essere analizzati su diversi livelli tassonomici. I valori P sono calcolati per dimostrare risultati significativi.
Infine, il microbioma orale a livello di OTU può essere visualizzato con le principali analisi delle coordinate. Questa figura mostra le differenze intra e interindividuali in cinque soggetti. Un raggruppamento di determinati gruppi può mostrare cambiamenti nella composizione del microbioma.
Questa animazione 3D mostra i risultati di uno studio caso-controllo. I punti rossi sono i casi. I punti blu sono i controlli.
Un chiaro raggruppamento dei casi dopo l'intervento ortodontico al T3, i grandi punti rossi, visualizzano un cambiamento nel microbioma. I punti blu che mostrano il gruppo di controllo sono distribuiti uniformemente. Questo metodo può fornire informazioni sul campionamento clinico di biofilm nel solco sottogengivale di bambini sani.
Abbiamo scelto i punti di carta come i più adatti a questo scomparto vulnerabile. In questo video, abbiamo applicato il metodo solo alla condizione permanente. Può anche essere applicato a condizioni miste o mature.
Con alcuni pazienti, è possibile campionare anche i siti con malattia parodontale secondo lo stesso protocollo. Ciao, mi chiamo Barbara e sono una microbiologa molecolare. Quando analizzo il biofilm in laboratorio, devo fare affidamento su una libreria di campioni clinici imparziali.
Ogni fase nel campo interdisciplinare della ricerca microbica orale deve essere completamente standardizzata. E c'è un altro fatto importante. Si può avere successo solo in una squadra.
Quindi tratta sempre bene i tuoi colleghi.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo standardizzato per il campionamento del biofilm orale in bambini sani, concentrandosi sulle sfide del campionamento nello spazio limitato del solco subgengivale. Il metodo mira a migliorare l'affidabilità delle analisi del microbioma affrontando la mancanza di protocolli standardizzati.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Ricerca sul microbioma orale
- Odontoiatria pediatrica
- Tecniche di campionamento microbico
Sfondo
- I cambiamenti nel microbioma orale durante l'infanzia sono sempre più studiati.
- Gli attuali studi sul microbioma mancano di protocolli di campionamento standardizzati.
- Il campionamento nel solco subgengivale dei bambini presenta sfide uniche.
- Il campionamento con carta assorbente viene proposto come metodo adatto per quest'area.
Obiettivo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per il campionamento del biofilm orale nei bambini.
- Standardizzare le procedure per l'analisi del microbioma.
- Facilitare i confronti tra i dati del microbioma tra diversi studi.
Metodi utilizzati
- Preparazione e sterilizzazione di strumenti e materiali.
- Pulizia e preparazione dei denti del bambino prima del campionamento.
- Campionamento dal solco subgengivale, mucosa e saliva utilizzando carta assorbente.
- Conservazione sistematica dei campioni per l'analisi del microbioma.
Risultati principali
- Il campionamento standardizzato con carta assorbente raccoglie efficacemente campioni di biofilm.
- I campioni possono essere combinati o conservati individualmente per l'analisi.
- Il sequenziamento di nuova generazione fornisce dettagliati set di dati sul microbioma.
- Le analisi statistiche rivelano differenze significative nella composizione microbica.
Conclusioni
- Il metodo proposto migliora l'affidabilità degli studi sul microbioma orale nei bambini.
- La standardizzazione è cruciale per la ricerca interdisciplinare nella microbiologia orale.
- La collaborazione tra i ricercatori è essenziale per risultati di successo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Standardized oral biofilm sampling in children addresses a critical gap in pediatric microbiome research, enabling reliable data generation for target validation in oral health interventions. The method supports mechanistic de-risking by providing reproducible biological samples that reflect true microbial composition, reducing variability in preclinical assessments. This enhances predictive confidence in early discovery stages where oral microbiota shifts may indicate disease susceptibility or treatment response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oral microbiome composition as a biomarker for cariogenic and periopathogenic mechanisms in children.
- Operational Value: Provides a standardized sampling protocol that reduces technical variability in microbiome data generation.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing regarding microbial shifts during childhood development and intervention periods.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream NGS and bioinformatic analysis, ensuring assay readiness.
- Operational Value: Facilitates sample pooling or parallel processing, improving throughput and standardization across study sites.
- Scientific Value: Generates quantitative microbial abundance data suitable for assay optimization and screening campaign design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers disease-relevant samples from healthy pediatric oral sites, establishing baseline for comparative disease modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of microbiome shifts, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into host-microbe interactions that inform target selection and validation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying standardized biological inputs for microbiome profiling, which informs target identification and validation efforts prior to lead generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbial community shifts linked to oral health status and developmental stages.
- Screening: Delivers reproducible samples enabling consistent NGS-based microbial profiling for comparative compound or intervention evaluation.
- Analytics: Generates relative abundance and diversity metrics that allow cross-condition comparison and statistical assessment of microbial changes.
- Translational Research: Connects discovery-phase microbiome data to preclinical continuity by establishing healthy baselines for disease model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sampling protocol applicable across pediatric oral health studies, reducing protocol redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-associated target validation by minimizing sampling-induced noise.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization across sites and time points, critical for multi-center studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision reliability in oral health programs by reducing false positives from methodological artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oral microbiome targets based on robust, comparable longitudinal data.
Implementation Considerations
- Requires training in pediatric dental techniques and sterile handling to ensure sample integrity and child cooperation.
- Dependent on access to UV irradiation, autoclaving, and cold storage (-80°C) infrastructure for contamination control and sample preservation.
- Necessitates cross-disciplinary coordination between dental clinicians and molecular biologists for standardized execution.
- Requires adaptation considerations when applying to mixed dentition or periodontally diseased sites, as noted in the protocol.
- Limited by the physical constraints of subgingival access in very young children, which may affect sampling consistency.
