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Advanced Biology

Il test TUNEL

The TUNEL Assay

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Cell Biology

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The TUNEL Assay

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

4.15: Annexin V and Propidium Iodide Labeling

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08:12 min

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April 30, 2023

Overview

Uno dei tratti distintivi dell’apoptosi è la frammentazione del DNA nucleare da parte delle nucleasi. Questi enzimi sono attivati dalle caspasi, la famiglia di proteine che eseguono il programma di morte cellulare. Il test TUNEL è un metodo che sfrutta questa funzione per rilevare le cellule apoptotiche. In questo test, un enzima chiamato desossinucleotidil transferasi terminale catalizza l’aggiunta di nucleotidi dUTP alle estremità libere 3′ del DNA frammentato. Utilizzando dUTP etichettati con tag chimici in grado di produrre fluorescenza o colore, le cellule apoptotiche possono essere identificate in modo specifico.

Il video di JoVE sul test TUNEL inizia discutendo di come questa tecnica possa essere utilizzata per rilevare le cellule apoptotiche. Passiamo quindi attraverso un protocollo generale per eseguire saggi TUNEL su sezioni di tessuto e visualizzare i risultati utilizzando la microscopia a fluorescenza. Infine, saranno trattate diverse applicazioni del test alla ricerca attuale.

Procedure

Il test TUNEL è più comunemente usato per rilevare le cellule sottoposte ad apoptosi, che è una forma di morte cellulare programmata. L’apoptosi è un importante processo biologico durante lo sviluppo e per il mantenimento dell’omeostasi tissutale. La colorazione TUNEL consente la visualizzazione e la quantificazione delle cellule apoptotiche. Questo aiuta gli scienziati a testare l’efficacia di nuovi trattamenti per i disturbi in cui l’apoptosi è inibita, come nel cancro, o migliorata, come nella neurodegenerazione.

Questo video spiegherà come il test TUNEL può essere utilizzato per etichettare le cellule sottoposte ad apoptosi, un protocollo passo-passo per eseguire questo metodo in sezioni di tessuto e come i ricercatori stanno applicando questa tecnica per comprendere i meccanismi di morte cellulare.

Prima di approfondire il protocollo del test TUNEL, discutiamo i principi alla base di questa tecnica.

Una delle molte caratteristiche distintive dell’apoptosi è la frammentazione del DNA. Come avviene la frammentazione del DNA? L’apoptosi è effettuata da enzimi chiamati caspasi presenti nel citosol. Il loro ruolo primario è quello di scindere le proteine al fine di smantellare la cellula. Inoltre, le caspasi attivano un enzima chiamato DNasi attivata dalla caspasi, o CAD, staccandolo dal suo inibitore: ICAD. La CAD attivata è un’endonucleasi che viaggia verso il nucleo e fende il DNA cromosomico.

La scissione del DNA alla fine causa l’accumulo di frammenti di DNA con estremità graffiate, e il test TUNEL etichetta fluorescentemente queste estremità nicked di DNA frammentato, consentendo agli scienziati di rilevare l’apoptosi. Ma come avviene? Per questo devi capire la reazione TUNEL. TUNEL è l’acronimo di terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling. I due principali reagenti TUNEL sono la deossinucleotidil transferasi terminale, o TdT, e la deossiuridina trifosfato, o dUTP, che possono essere etichettati fluorescentemente per facilitare il rilevamento.

Per capire la reazione TUNEL, torniamo alle cellule apoptotiche con frammenti di DNA. Questi frammenti ossidrilici hanno gruppi idrossilici liberi di 3′. Una volta aggiunti i reagenti TUNEL a un campione contenente cellule apoptotiche, i dUTP etichettati fluorescentemente si attaccano a questi gruppi ossidrilici 3′ con l’aiuto dell’enzima catalizzatore TdT. Le cellule colorate con questa procedura sono chiamate cellule positive TUNEL, che possono quindi essere visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Ora che hai compreso i principi e i concetti di base alla base del test TUNEL, descriviamo un protocollo generale per l’esecuzione di questa tecnica nelle sezioni di tessuto. I passaggi principali del test TUNEL includono il fissaggio del tessuto di interesse, la permeabilizzazione del tessuto, l’aggiunta di reagenti TUNEL, l’arresto della reazione TUNEL e infine l’analisi.

In primo luogo, il tessuto di interesse deve essere fissato al fine di preservare le strutture biologiche. La fissazione funziona incrociando le proteine all’interno delle cellule. Per il test TUNEL, i tessuti possono essere fissati aggiungendoli a una soluzione contenente il 4% di paraformaldeide per 4-24 ore a 4°C. Dopo la fissazione, criosezionare il tessuto in fette sottili di 10 μm o meno.

Il passo successivo è la permeabilizzazione, che consente ai reagenti come l’enzima TdT di penetrare nel nucleo cellulare. La permeabilizzazione delle sezioni tissutali può essere eseguita aggiungendo il tessuto alla soluzione di proteinasi K per 5-15 minuti a 37°C. Risciacquare le sezioni di tessuto con soluzione salina tamponata con fosfato su uno shaker orbitale per 15-30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la permeabilizzazione, l’enzima TdT e i dUTP etichettati fluorescentemente vengono aggiunti alle sezioni tissutali, insieme a un tampone di etichettatura contenente cobalto che funge da cofattore per la reazione TUNEL. Insieme, la miscela di reazione TUNEL e la sezione tissutale vengono incubate per 1-3 ore a 37 ° C e protette dalla luce per evitare che la fluorescenza svanisca.

Dopo l’incubazione, il tampone di arresto viene aggiunto alla sezione tissutale per cessare la reazione TUNEL e dopo una breve incubazione le sezioni vengono lavate con soluzione salina tamponata con fosfato. Infine, le sezioni di tessuto colorate con dUTP marcato fluorescentemente vengono visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza e valutate per la localizzazione di cellule POSITIVE TUNEL all’interno di un determinato tessuto. Si può quantificare la morte cellulare semplicemente contando la percentuale di cellule TUNEL positive in una determinata sezione di tessuto.

Ora che hai visto come eseguire il test TUNEL per rilevare le cellule apoptotiche, discutiamo di come questo test può essere utilizzato per rispondere alle domande poste dai biologi cellulari.

La morte cellulare si verifica come una parte normale dello sviluppo per la scultura di tessuti e strutture e per l’eliminazione di cellule non necessarie. Pertanto, gli scienziati interessati a questo fenomeno studiano l’effetto dell’esposizione prenatale a diverse sostanze sull’apoptosi durante lo sviluppo. Qui, gli scienziati erano interessati a esaminare l’effetto dell’esposizione prenatale all’alcol sullo sviluppo del cervello. I risultati della colorazione TUNEL eseguita sul cervello fetale hanno rivelato un aumento dell’apoptosi nei tessuti esposti prenatale all’alcol, rispetto agli animali di controllo.

Gli scienziati usano anche il test TUNEL per studiare l’apoptosi in risposta all’infezione batterica. In questo esperimento, gli scienziati hanno sviluppato un modello di polmonite iniettando topi con Pseudomonas aeruginosa, che induce l’infiammazione polmonare. Quindi, il tessuto polmonare è stato rimosso e la colorazione TUNEL è stata eseguita per esaminare l’apoptosi in risposta all’infezione batterica. I risultati mostrano che la morte delle cellule apoptotiche è aumentata nei topi esposti ai batteri, rispetto agli animali di controllo.

Infine, la colorazione TUNEL può essere utilizzata su campioni di tumore umano, al fine di determinare la risposta del tumore ai farmaci. In questo esempio, i campioni di tumore sono stati raccolti da pazienti umani e coltivati ex vivo. Successivamente, sono stati trattati con farmaci pre-clinici e valutati per una risposta utilizzando il test TUNEL. I dati ottenuti mostrano che il trattamento con un farmaco che inibisce la proteina 90 da shock termico aumenta significativamente l’apoptosi nel tessuto tumorale.

Hai appena visto il video di JoVE sull’utilizzo del test TUNEL per rilevare le cellule sottoposte ad apoptosi. Questo video ha esaminato i principi alla base della colorazione TUNEL e un protocollo passo-passo per eseguire il test TUNEL sulle sezioni di tessuto. Abbiamo anche esaminato come questo metodo potrebbe essere applicato per comprendere la morte cellulare programmata durante lo sviluppo e la malattia. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

The TUNEL assay is most commonly used to detect cells undergoing apoptosis, which is a form of programmed cell death. Apoptosis is an important biological process during development, and for maintaining tissue homeostasis. TUNEL staining allows for visualization and quantification of apoptotic cells. This helps scientists test efficacy of new treatments for disorders in which apoptosis is either inhibited, like in cancer, or enhanced, as in neurodegeneration.

This video will explain how the TUNEL assay can be used to label cells undergoing apoptosis, a step-by-step protocol for performing this method in tissue sections, and how researchers are applying this technique to understand mechanisms of cell death.

Before delving into the protocol of the TUNEL assay, let’s discuss the principles behind this technique.

One of the many hallmark characteristics of apoptosis is DNA fragmentation. How does DNA fragmentation occur? Apoptosis is carried out by enzymes called caspases present in the cytosol. Their primary role is to cleave proteins in order to dismantle the cell. In addition, caspases activate an enzyme called caspase-activated DNase, or CAD, by detaching it from its inhibitor—ICAD. Activated CAD is an endonuclease that travels to the nucleus and cleaves chromosomal DNA.

Cleavage of DNA ultimately causes accumulation of DNA fragments with nicked ends, and the TUNEL assay fluorescently labels these nicked ends of fragmented DNA, allowing scientists to detect apoptosis. But how does this happen? For that you have to understand the TUNEL reaction. TUNEL stands for terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling. The two main TUNEL reagents are terminal deoxynucleotidyl transferase, or TdT, and deoxyuridine triphosphate, or dUTP, which may be fluorescently labeled for ease of detection.

In order to understand the TUNEL reaction, let’s go back to the apoptotic cells with DNA fragments. These nicked fragments have free 3′ hydroxyl groups. Once you add the TUNEL reagents to a sample containing apoptotic cells, the fluorescently labeled dUTPs attach to these 3′ hydroxyl groups with the help of the catalyst enzyme TdT. The cells stained using this procedure are called TUNEL positive cells, which can then be visualized using fluorescence microscopy.

Now that you understand the basic principles and concepts behind the TUNEL assay, let’s outline a general protocol for performing this technique in tissue sections. The major steps of the TUNEL assay include fixing the tissue of interest, permeabilization of the tissue, adding TUNEL reagents, stopping the TUNEL reaction, and finally the analysis.

First, the tissue of interest must be fixed in order to preserve biological structures. Fixation works by crosslinking proteins within cells. For the TUNEL assay, tissues can be fixed by adding them to a solution containing 4% paraformaldehyde for 4–24 hours at 4°C. After fixation, cryosection the tissue into thin slices of 10 µm or less.

The next step is permeabilization, which allows for reagents such as the TdT enzyme to penetrate the cell nucleus. Permeabilization of tissue sections can be performed by adding the tissue to proteinase K solution for 5–15 minutes at 37°C. Rinse tissue sections with phosphate buffered saline on an orbital shaker for 15–30 minutes at room temperature.

Following permeabilization, the TdT enzyme and fluorescently labeled dUTPs are added to the tissue sections, along with a labeling buffer containing cobalt that acts as a cofactor for the TUNEL reaction. Together, the TUNEL reaction mixture and the tissue section are incubated for 1–3 hours at 37°C, and protected from light to prevent the fluorescence from fading.

Following incubation, stop buffer is added to the tissue section to cease the TUNEL reaction, and after a short incubation the sections are washed with phosphate buffered saline. Finally, tissue sections stained using fluorescently tagged dUTP are visualized using fluorescence microscopy, and assessed for localization of TUNEL positive cells within a given tissue. One can quantify cell death simply by counting the percentage of TUNEL positive cells in a given tissue section.

Now that you’ve seen how to perform the TUNEL assay to detect apoptotic cells, let’s discuss how this assay can be used to address questions asked by cell biologists.

Cell death occurs as a normal part of development for the sculpting of tissues and structures, and for the elimination of unnecessary cells. Therefore, scientists interested in this phenomenon study the effect of prenatal exposure to different substances on apoptosis during development. Here, scientists were interested in examining the effect of prenatal alcohol exposure on brain development. The results of TUNEL staining performed on fetal brains revealed increased apoptosis in tissues that were prenatally exposed to alcohol, as compared to control animals.

Scientists also use the TUNEL assay to investigate apoptosis in response to bacterial infection. In this experiment, scientists developed a model of pneumonia by injecting mice with Pseudomonas aeruginosa, which induces lung inflammation. Then, lung tissue was removed and TUNEL staining was performed to examine apoptosis in response to the bacterial infection. Results show that apoptotic cell death increased in mice exposed to the bacteria, as compared to control animals.

Lastly, TUNEL staining can be used on human tumor samples, in order to determine tumor responsiveness to drugs. In this example, tumor samples were harvested from human patients and cultured ex vivo. Next, they were treated with pre-clinical drugs and assessed for a response using the TUNEL assay. Data obtained show that treatment with a drug that inhibits heat shock protein 90 significantly increases apoptosis in tumor tissue.

You’ve just watched JoVE’s video on using the TUNEL assay to detect cells undergoing apoptosis. This video reviewed the principles behind TUNEL staining, and a step-by-step protocol to perform the TUNEL assay on tissue sections. We also reviewed how this method could be applied to understand programmed cell death during development and disease. As always, thanks for watching!

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