Name: Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e lattivazione dei macrofagi peritoneali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Scopri come valutare l'attivazione antinfiammatoria dei macrofagi indotta da farmaci a base di anticorpi nel midollo osseo murino e nei macrofagi peritoneali. Questo metodo misura la risposta dei macrofagi primari in vitro e in vivo.

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La rosa è il destinatario del premio borsa di studio laureato 4-anno fellowship (4YF) University of British Columbia. L.M.S è il destinatario di un'associazione canadese di Gastroenterologia / di Crohn e colite Canada / CIHR nuovo investigatore stipendio premio ed è uno studioso biomedica della Fondazione Michael Smith per ricerca di salute. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto dal Canadian Blood Services, in collaborazione con la canadese istituti di ricerca sanitaria (concessione n # CIHR2016-LS).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of British Columbia.
1. del midollo osseo del macrofago derivazione e attivazione con anticorpi
<ol>
	<li>Eseguire l'eutanasia usando CO2 asfissia.<ol>
		<li>Del mouse posto nella camera di induzione. Eutanasia, mouse con 5% isoflurane anestesia, per 60-90 s, fino a quando l'immobile e la respirazione è profondo e lento.</li>
		<li>Spegnere l'anestesia isoflurano e amministrare di CO2 del 6-8 L/min fino a quando il mouse ha smesso di respirare. Lasciare mouse con CO2 per almeno altri 5 min verifica che non c'è più un battito cardiaco o la respirazione. Eseguire una dislocazione cervicale per assicurare la morte. Nota: 8-12 settimane vecchi topi forniscono il più alto rendimento dei macrofagi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spray gambe del mouse con etanolo al 70% e bloccarli con braccia e gambe distese nella posizione supina sopra un bordo della gomma piuma. Con forbici e pinze per tenere la pelle, fate un taglio superficiale (0,2 cm) per rimuovere la pelle e del pelo dalla superficie di ciascuna delle zampe posteriori. Nota: Eseguire questa procedura e tutte le manipolazioni di cultura del tessuto in una cappa sterile.</li>
	<li>Tagliare il muscolo per rendere visibile delle tibie e femori. Rimuovere le tibie e femori, tagliando l'osso e i muscoli appena sotto l'articolazione dell'anca e sopra le caviglie. Tagliare come muscolo molto possibile.</li>
	<li>Spruzzare le ossa con etanolo al 70% e attendere 1 minuto per farlo evaporare, poi metterli in ben 6 piastra di medie a livello osseo (Iscove modificato medio di Dulbecco (IMDM), 10% siero bovino fetale (FBS)).</li>
	<li>Tagliare le estremità delle ossa di taglio 0,1 cm dell'osso fuori della caviglia e la parte superiore del femore in modo che la cavità dell'osso è esposto. Assicurarsi che il midollo è visibile e un ago di 26 calibro può essere posizionato nella cavità dell'osso.</li>
	<li>Tagliare le ossa e i muscoli per separare le tibie e femori da articolazioni del ginocchio. Inserire un ago di 26 calibro collegato a una siringa da 10 mL nella cavità. Sciacquare il midollo osseo in una provetta conica da 50 mL con 5 mL di osso a filo medio. Lavare due tibie e due femori, da un mouse, in ogni provetta da 50 mL.</li>
	<li>Pipettare su e giù parecchie volte o vortice il midollo a bassa velocità per disperdere delicatamente ciuffi. Stringhe del midollo devono essere suddiviso in macchie di piccolo (meno di 0,5 mm) del midollo. Riempire la provetta conica a 50 mL con l'osso a filo medio. Pipetta contenuto della provetta conica in una cultura di tessuto2 75 cm trattati boccetta e incubazione a 37 ° C, 5% CO2 per 1 h. Nota: Macrofagi maturi e cellule mesenchimali diventerà aderente al pallone ed essere scartato, mentre i progenitori ematopoietici desiderati rimangano in sospensione.</li>
	<li>Dispensare il mezzo con progenitori ematopoietici in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare la provetta a 300 x g e a temperatura ambiente per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura (MCSF) fattore di stimolazione della Colonia del macrofago (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 150 μM monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro18. Aggiungere il terreno per risospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL, 1,5 x 107 cellule/boccetta in 30 mL di terreno e pipettare su e giù delicatamente. Pipettare 30 mL di sospensione in un matraccio da nuova coltura di tessuti trattato2 di 75 cm.</li>
	<li>Il giorno 4 e 7 ° giorno dopo la coltura iniziale nel passaggio 1,9, verificare che le cellule siano aderenti e leggermente ramificata utilizzando un microscopio a campo chiaro contrasto fase invertita. Scartare il supporto che contiene le cellule non-aderenti. Lavare le cellule con IMDM una volta e aggiungere 30 mL di terreno di coltura MCSF.</li>
	<li>Quando le cellule sono mature di giorno 10 (&#62; 95% positivo per F4/80 e Mac-1), verificare di nuovo che le cellule sono aderenti e leggermente.</li>
	<li>Piastra di cellule per stimolazioni, rimuovere il terreno di coltura dalla beuta e aggiungere 8 mL di tampone di enzima libero, basato su EDTA cella dissociazione (Tabella materiali). Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Raschiare delicatamente, cellule con una piccola quantità di pressione, con una spatola sterile cella. Check-nel microscopio che cellule staccato dalla superficie del pallone. Pipettare cellule dissociate in una provetta conica da 50 mL. Risciacquare il matraccio 3 volte con 5 mL di IMDM e piscina la soluzione di risciacquo con le cellule che sono state raccolte. Centrifugare le cellule a 300 x g a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di coltura MCSF a tubo conico da 50 mL. Conteggio di cellule vitali utilizzando un emocitometro18. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL e piastra 100 µ l di sospensione cellulare (1 x 105 cellule/pozzetto) per pozzetto di una cultura di tessuto 96 pozzetti trattata, piatto fondo piatto. Nota: Le ossa da un mouse genererà abbastanza cellule per 100 pozzi. Se lo si desidera, 1 mL di cellule può essere placcato in una piastra a 6 pozzetti (coltura di tessuti trattati, fondo piatto). Un numero maggiore di cellule (1 x 106 cellule) può essere utile per analisi western blot.</li>
	<li>Una volta che è aderente, stimolare duplicato o triplicato pozzetti ciascuna con 10 ng/mL di LPS in IMDM, 30 mg/mL di IVIg, o IVIg + LPS. Dosi di LPS o IVIg possono essere titolate per ottimizzare le risposte. Lasciare i pozzetti duplicati o triplice copia come controlli non stimolati. Li Incubare per 24 h (37 ° C, 5% CO2). Nota: Ri-placcate cellule dovrebbero aderire pozzi di coltura del tessuto all'interno di 1 h.</li>
	<li>Raccogliere i surnatanti delle cellule da ciascun pozzetto in microcentrifuga individuali 1,7 mL e rimuovere particelle estranee di filatura a 10.000 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante delle cellule ed evitare di disturbare il pellet. Mettere la cella chiarificata surnatante in una provetta da microcentrifuga sterile. Nota: I surnatanti delle cellule possono essere analizzati per citochine, IL-10 e subunità di citochina, IL-12 / 23p 40, dall'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) immediatamente, o conservati a-80 ° C a lungo termine. Seguire il protocollo di ELISA da kit disponibile in commercio (Tabella materiali). Altre citochine pro-infiammatorie può essere analizzato, come IL-6 e TNF, come sono anche ridotti dal co-trattamento con IVIg + stimolazione dei LPS rispetto alla stimolazione con LPS da solo. Dopo stimolazione, cellule aderenti possono essere preparate per tecniche quali macchiarsi occidentale o quantitativa della polimerasi reazione a catena (Q-PCR) 19,20.</li>
</ol>
2. impegnativo topi In Vivo con IVIg e macrofagi peritoneali di raccolta
<ol>
	<li>Pesare ogni mouse.</li></ol>Calcolare il volume di IVIg (concentrazione stock di 100 mg/mL) necessari per fornire una dose finale di 2,5 g/kg peso corporeo per ogni mouse. Nota: ad esempio, per un mouse 20g, 500 µ l di IVIg è richiesto.
	<li>Disegnare la quantità necessaria di IVIg in una siringa sterile da 1 mL dotata di una sterile 26 ago del manometro. Per topi di controllo che non riceverà IVIg, somministrare un volume equivalente di dose di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS), pH 7,4 invece di IVIg.</li>
	<li>Collottola il mouse con una mano afferrando la sua pelle sul retro del collo con il pollice e il dito indice e che tiene la coda e le zampe posteriori con le restanti dita. Inclinare il suo corpo verso il suolo.</li>
	<li>Posizionare l'ago a un angolo di 30-40° rispetto addome del mouse, nel quadrante inferiore destro, in rilievo fino e inserire 1,5 cm dell'ago. Iniettare l'IVIg o PBS intraperitonealmente. Aspettare 1 ora.</li>
	<li>Eutanasia di topi con l'anestesia di isoflurano 5% seguita da 6-8 L/min CO2 asfissia (vedere i passaggi 1.1.1 - 1.1.2), o secondo orientamenti etici dell'istituzione.</li>
	<li>Pin il mouse a un bordo della gomma piuma, con le membra sparse. Spruzzare le parti con etanolo al 70%. Nota: Eseguire la procedura in una cappa sterile.</li>
	<li>Fate un taglio superficiale della pelle (0,2 cm) con le forbici lungo la linea mediana del mouse, per evitare di tagliare la cavità peritoneale. Tirare la pelle addominale fuori pancia del mouse usando il forcipe, affinché il rivestimento della parete peritoneale intatto è visibile.</li>
	<li>Riempire una siringa da 5 mL con 5 mL di PBS sterile (pH 7.4). Inserire un 25 o 27 ago nella parte superiore della cavità da sinistra o da destra verso il centro del mouse con la smussatura dell'ago del manometro fino. Nota: Inserire l'ago con attenzione nel topo affinché non si inietti PBS negli organi, ma piuttosto, nello spazio peritoneale.</li>
	<li>Spingere il fluido nella cavità peritoneale. Estrarre l'ago dalla cavità e massaggiare il peritoneo per 10 s per rimuovere tutte le cellule. Inserire l'ago nella parte superiore della cavità ed evitare gli organi. Raccogliere e mettere il liquido di lavaggio recuperato in una provetta conica da 15 mL sul ghiaccio. Nota: Per ogni 5 mL di fluido iniettato, saranno recuperati circa 3,75 mL.</li>
	<li>Ripetere l'iniezione e recupero (passaggi 2,8-2,9) 3 più volte (volume di iniezione totale di 20 mL), per recuperare 15 mL di liquido di lavaggio in totale. Raccogliere il lavaggio da ogni mouse in una provetta conica separato da 15 mL. Nota: Dopo l'ultima iniezione, potrebbe essere più facile estrarre il liquido dal lato lontano destro e sinistro del mouse, dove ha accumulato fluido. Gli organi causerà meno interferenze con l'ago in questa posizione.</li>
	<li>Selezione di celle verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in 500 μL di placcatura medio (IMDM, 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina) per topo svuotata. Conta Vitali macrofagi utilizzando un emocitometro18. Nota: I macrofagi sarà leggermente più grandi rispetto alle altre cellule peritoneali. Rendimento tipico è 5x105 - 1 x 106 . macrofagi/mouse utilizzando un mouse C57BL/6 di tipo selvaggio. Opzionale: Se un gran numero di globuli rossi è presente nel pellet cellulare, eseguire un passaggio di lisi per rimuoverli, utilizzando il buffer di lisi del globulo rosso di 1x secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Risospendere le cellule in mezzo a 1 x 106 macrofagi/mL di placcatura e 100 μL per pozzetto in una piastra di coltura di tessuti trattato 96 pozzetti piatto inferiore della lastra. Nota: Potrebbe essere necessario al pool di cellule da più di un mouse per un esperimento se utilizza in triplice copia pozzi o titolazione stimolanti. Ad esempio, se un mouse ha avuto 5 x 105 macrofagi, 500 μL di placcatura medio sarebbe necessaria. Non ci sarebbe abbastanza cellule per 5 pozzi, o 1 esperimento in duplice copia, con una dose di LPS.</li>
	<li>Incubare le cellule per 1 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire i macrofagi diventare aderente. Le cellule aderenti sono macrofagi peritoneali. Rimuovere i surnatanti delle cellule e cellule non aderenti. Lavare i pozzetti due volte con 200 μL IMDM (pre-riscaldato a 37 ° C), attendere 10 s e lentamente inclinare il piatto. Sostituire il mezzo di placcatura. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 per 30 min prima della stimolazione.</li>
	<li>Stimolare i macrofagi con 10 ng/mL di LPS in IMDM, o lasciare non stimolate, come un controllo. Incubare per 24 h, raccogliere e chiarire i surnatanti delle cellule (vedere i passaggi 1.16-1.17) per analisi di citochina IL-10 da ELISA. Seguire il protocollo di ELISA da kit disponibile in commercio (Tabella materiali). Nota: Dopo stimolazione, cellule aderenti possono essere preparate per tecniche come il western blot o PCR.</li>

3. impegnativo topi in Vivo con IVIg + LPS e macrofagi peritoneali di raccolta
<ol>
	<li>Pesare ogni mouse. Calcolare il volume di IVIg (concentrazione stock di 100 mg/mL) necessari per fornire una dose finale di 2,5 g/kg peso corporeo. Calcolare la quantità di LPS (concentrazione stock 100 μg/mL in IMDM) necessaria per fornire una dose finale di 0,2 μg/g di peso di corpo. Nota: ad esempio, per un mouse 20g, 500 µ l di soluzione madre di IVIg e 40 µ l di una soluzione di 100 μg/mL di LPS è richiesti.</li>
	<li>Disegnare la quantità necessaria di IVIg e LPS in una siringa sterile da 1 mL con una sterile 26 ago del manometro. Per topi di controllo che non riceverà IVIg, è possibile sostituire un volume equivalente di IVIg con PBS sterile a pH 7,4.</li>
	<li>Collottola il mouse con una mano afferrando la sua pelle sul retro del collo con il pollice e il dito indice e che tiene la coda e le zampe posteriori con le restanti dita. Inclinare il suo corpo verso il suolo.</li>
	<li>Posto l'ago a un angolo di 30-40° rispetto addome del mouse, nel quadrante inferiore destro, smussato e inserire 1,5 cm. iniettare le IVIg + LPS, o PBS + LPS, intraperitonealmente as in passaggio 2.4.</li>
	<li>Dopo 1h, raccogliere macrofagi peritoneali attenendosi alla procedura 2.5-2.10.</li>
	<li>Selezione di celle verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere 1 mL di fluido di lavaggio recuperati e utilizzare per IL-10 e IL-12 / 23p 40 analisi di ELISA secondo le istruzioni del produttore o congelare a-80 ° C per le analisi future. Nota: Per garantire il confronto puntuale tra i trattamenti per l'analisi di citochina fluido di lavaggio, eseguire Internetlittlereno 5ml della cavità peritoneale 4 volte per un volume finale di 15 mL. Non tutto il liquido sarà recuperato da ogni filo.</li>
	<li>Come descritto al punto 2.11, risospendere e contare i macrofagi praticabili. Nota: I macrofagi sarà leggermente più grandi rispetto alle altre cellule peritoneali.</li></ol>Rendimento tipico è 5x105 - 1 x 106 . macrofagi/mouse utilizzando un mouse C57BL/6 di tipo selvaggio. Opzionale: Se un gran numero di globuli rossi è presente nel pellet cellulare, eseguire un passaggio di lisi secondo le istruzioni del produttore per rimuoverli, come descritto al punto 2.11.
	<li>Come descritto al punto 2.12, risospendere le cellule in medium di placcatura. Nota: Potrebbe essere necessario alle cellule di piscina da più di un mouse per un esperimento. Ad esempio, se un mouse ha avuto 5 x 105 macrofagi, 500 μL di placcatura medio sarebbe necessaria.</li>
	<li>Come in 2.13, incubare le cellule per 1 h a 37 ° C 5% CO2 per consentire i macrofagi diventare aderente.</li>
	<li>Raccogliere e chiarire il medium condizionato, secondo passi 1.14-1.15, da tutte le cellule peritoneali. Nota: I campioni possono essere utilizzati immediatamente o congelati e conservati a-80 ° C per l'analisi di cytokine Elisa.</li>
	<li>Eseguire il passaggio 2.11, ma Incubare le cellule per 24 h non stimolate. Raccogliere e chiarire i surnatanti delle cellule, secondo passi 1.16-1.17, per l'analisi di cytokine Elisa. Nota: Le cellule possono essere preparate per tecniche come il western blot o PCR, come in passaggi 1.16-1.17 e 2.14.</li>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Gli Stati di attivazione del macrofago svolgono un ruolo importante in entrambi di omeostasi e malattia del tessuto22. Macrofagi possono avere distinti così come sovrapposizione di Stati di attivazione, a seconda delle stecche in loro microambiente3. Hanno ruoli distinti in tutte le fasi della risposta infiammatoria: difesa contro gli agenti patogeni, ferita restituzione di tessuto e di guarigione, e hanno anche uno stato di attivazione antinfiammatori distinti che è import...

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata, che svolgono i ruoli multipli nella risposta immunitaria alle infezioni o lesioni. I macrofagi sono responsabili dell'avvio di una risposta immunitaria a danno di tessuto o di infezione, fermare la risposta infiammatoria e promuovere la guarigione di risposta1. Esempi dei tre stati di attivazione meglio studiati macrofago sono: 1) macrofagi trattati con interferone gamma (IFNγ) e lipopolisaccaride batterico (LPS), designato M (IFNγ + LPS), che contribuiscono alla risposta infiammatoria. 2) macrofagi stimolati con l'interleuchina 4 (IL-4), M(IL-4), che sono associati con la risposta di guarigione; 3) macrofagi stimolati con immunocomplessi (IC) e LPS, M (IC + LPS), che hanno la capacità di spegnere la risposta infiammatoria2,3. M (IC + LPS) sono distinti dai macrofagi di cicatrizzazione M(IL-4) e non esprimono l'arginasi enzima (Arg-1) o FIZZ14. Il miglior marcatore per questi macrofagi infiammatori è loro cytokine produzione5. I macrofagi hanno ruoli multipli nel mantenimento della salute, ma anche contribuiranno a malattie infiammatorie e cancro3. Per questo motivo, i macrofagi sono un fondamentale obiettivo terapeutico per il trattamento di un'ampia varietà di malattie. È importante studiare gli effetti degli anticorpi sul loro stato di attivazione di sviluppare trattamenti basati su macrofago per malattia.
Il focus di questa carta è sull'uso dei macrofagi del midollo osseo murino derivato (BMDMs) e macrofagi peritoneali di testare l'effetto di droghe dell'anticorpo su risposte infiammatorie in vitro e in vivo. Recentemente, ci sono stati più studi che mostrano gli effetti degli anticorpi il macrofago attivazione6,7,8. Macrofagi co-attivati con complessi immuni, che sono anticorpi complessati con un antigene e LPS, uno stimolo infiammatorio normalmente, producono livelli molto elevati della citochina antinfiammatoria IL-10 e livelli molto bassi di citochina pro-infiammatoria, interleuchina 12 (IL-12)9. Inoltre, infliximab, un anticorpo monoclonale contro il TNFα, è stato trovato a lavorare, in parte, inducendo antinfiammatori macrofagi attraverso suo frammento cristallizzabile (Fc) regione7. Abbiamo segnalato che IVIg + LPS inducono l'attivazione del macrofago antinfiammatori che è simile a M (IC + LPS), in cui co-stimolato i macrofagi producono grandi quantità di IL-10 e basse quantità della subunità citochina pro-infiammatoria Interleukin 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) e TNF8. IVIg è un farmaco composto da anticorpi policlonali, principalmente IgG, che è stata riunita dal sangue di più di 1.000 donatori10. Esso è usato per trattare una vasta gamma di malattie immunologiche, come purpura thrombocytopenic idiopatico e polineuropatia demielinizzante cronica, ma il suo meccanismo d'azione non è completamente capito11. Gli effetti delle droghe dell'anticorpo basato sull'attivazione del macrofago possono essere valutati utilizzando i metodi descritti nel presente documento.
Gli effetti dei farmaci biologici specifici sull'attivazione del macrofago possono essere testati in BMDMs e macrofagi peritoneali. Utilizzando queste fonti del macrofago consente la valutazione di cellule primarie. Test preliminari di anticorpi su cellule in coltura primaria richiede meno tempo e investimento monetario rispetto ad altri modelli di malattia che richiede tempo e costoso. Iniettare una droga in un topo sano in vivoe isolando le cellule e analizzarli ex vivo, si può determinare se gli studi sono autorizzati per valutare se il trattamento con farmaci biologici colpisce l'attivazione del macrofago in modelli di malattia.
Con pochi studi test direttamente l'effetto delle terapie biologiche sul macrofago attivazione in vitro e in vivo , le nostre tecniche forniscono un vantaggio rispetto a tecniche alternative. Le attuali tecniche comportano test effetti di farmaci biologici su cellule miste popolazioni in vitro, ad esempio l'effetto di infliximab in una reazione linfocitaria mista (MLR) o IVIg su macrofagi umani in cellule mononucleari di sangue periferico, dove l'effetto non può essere attribuita a una cella specifica tipo7,12. Utilizzando BMDMs e macrofagi peritoneali è vantaggioso rispetto all'utilizzo di linee cellulari, quali le cellule RAW 264.7, che non producono le citochine pro-infiammatorie, IL-12, in risposta a LPS8,13. Verificare l'effetto di un farmaco a base di anticorpi sul macrofago risposte ex vivo ha vantaggi perché risposte di citochina possono essere attribuite direttamente ai macrofagi, piuttosto che la deduzione di risposte del macrofago misurando i livelli di citochina del siero14 . BMDMs e macrofagi peritoneali possono essere derivati e isolati da topi geneticamente modificati per determinare il ruolo specifico di una proteina in attivazione macrofagica anti-infiammatori. Ad esempio, abbiamo utilizzato Il10 carente(- / -) BMDMs per dimostrare che IVIg-indotta di riduzione della produzione di citochine pro-infiammatorie dipende parzialmente dal-108. Meccanismo di azione di un farmaco può essere studiato usando macchiarsi occidentale, dove può essere determinato il ruolo delle proteine specifiche e segnalazione eventi. Reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) può essere eseguita su BMDMs o macrofagi peritoneali di mostrare pattern di espressione genica che derivano dall'attivazione dell'anticorpo. Modelli di malattia in topi possono fornire informazioni sull'efficacia potenziale di anticorpo-ha basato le terapie biologiche nei modelli per le malattie infiammatorie intestinali malattia, artrite reumatoide ed il cancro15,16, 17. Tuttavia, le tecniche qui descritte forniranno informazioni sul meccanismo di azione di questi farmaci biologici determinando se essi inducono l'attività antinfiammatoria del macrofago.

<table><tbody><tr><td>Iscove' s modificato Dulbecco' Tecnologie</td> per la <td>vita</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fattore stimolante le colonie di macrofagi murini ricombinanti (MCSF)</td><td>Tecnologie per le cellule staminali</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina Tecnologie</td> per la <td>vita</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerolo (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X tampone per lisi dei globuli rossi</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone per dissociazione cellulare</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>Senza enzimi, a base di Hanks, EDTA</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>Da E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Ricevuto da BC Children's Hospital, Medicina trasfusionale</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Gammagard liquido)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Ricevuto da BC Children's Hospital, Medicina</td><td></td>trasfusionale</tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Ricevuto da BC Children's Hospital, Medicina</td><td></td>trasfusionale</tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (sterile), pH 7.4</td><td>Tecnologie di vita</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>topo IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>topo IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anticorpi anti-Erk1/2</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-pp38</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>ago da 26 g</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL Siringa</td><td>da</td><td></td> 10 mL 309659 <td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 mL</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>(1,7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm><2 Pallone trattato per coltura tissutale</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>BD biosciences 353085</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>punta fine, dissezione&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicato, 4 1/2</td></tr><tr><td>"Microscopio a campo chiaro</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Scala a contrasto di fase invertito</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mettler&nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

I macrofagi sono fagocitiche cellule dell'immunità innata, che avviare le risposte immunitarie ai patogeni e contribuiscono alla restituzione di tessuto e di guarigione. I macrofagi sono ugualmente importanti nella disattivazione le risposte infiammatorie. Abbiamo dimostrato che i macrofagi stimolati con l'immunoglobulina endovenosa (IVIg) possono produrre le quantità elevate della citochina antinfiammatoria, interleuchina 10 (IL-10) e bassi livelli di citochine pro-infiammatorie in risposta a lipopolisaccaridi batterici ( LPS). IVIg è che un anticorpo polivalente, principalmente immunoglobulina Gs (IgG), riuniti dal plasma di donatori di sangue più di 1.000. Serve a integrare gli anticorpi nei pazienti con deficienze immunitarie o sopprimere le risposte immunitarie in pazienti con condizioni autoimmuni o infiammatorie. Infliximab, un anticorpo di terapeutico anti-tumore necrosi fattore alfa (TNFα), ha anche dimostrato di attivare i macrofagi a produrre IL-10 in risposta a stimoli infiammatori. IVIg e altri biologici basati su anticorpi possono essere testati per determinare i loro effetti sull'attivazione del macrofago. Questo articolo descrive metodi per la derivazione, la stimolazione e la valutazione del midollo osseo murino macrofagi attivati da anticorpi in vitro e macrofagi peritoneali murini attivati con anticorpi in vivo. Infine, dimostriamo l'utilizzo di western blotting per determinare il contributo di specifici percorsi di attività antinfiammatoria del macrofago di segnalazione delle cellule. Questi protocolli possono essere utilizzati con topi geneticamente modificati, per determinare l'effetto di una specifica proteina su attivazione macrofagica anti-infiammatori. Queste tecniche è utilizzabile anche per valutare se biologics specifico può agire modificando i macrofagi a uno stato di attivazione anti-infiammatori producono IL-10 che riduce le risposte infiammatorie in vivo. Questo può fornire informazioni sul ruolo dell'attivazione macrofagica nell'efficacia dei farmaci biologici durante modelli di malattia in topi e forniscono approfondimenti un potenziale nuovo meccanismo di azione nelle persone. Al contrario, questo può ammoniscono contro l'uso dei farmaci biologici basati su anticorpi specifici per il trattamento di malattie infettive, soprattutto se i macrofagi svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro l'infezione.

Macrofagi derivato del midollo osseo murino possono essere coltivati da precursori di cellule ematopoietiche nel midollo osseo aspira. Il midollo osseo aspira pool da femori e tibie di un topo C57BL/6 in genere resa 107 derivata midollare macrofagi, che li rende una fonte conveniente dei macrofagi per esperimenti. BMDMs può essere utilizzato per verificare le risposte di droga dell'anticorpo basato quando sfidato con uno stimolo infiammatorio in vitro. <strong class="x...

Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

L'obiettivo generale di questi esperimenti è determinare gli effetti di farmaci a base di anticorpi sugli stati di attivazione dei macrofagi antinfiammatori utilizzando il midollo osseo di topo e i macrofagi peritoneali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio, i farmaci anticorpali specifici agiscono modificando i macrofagi in uno stato di attivazione antinfiammatoria che produce IL-10. Il vantaggio principale di questa tecnica è che misura la risposta dei macrofagi primari di topo dal midollo osseo in vitro e dalla cavità peritoneale in vivo.Eseguire questa procedura in una cappa sterile. Fissa un topo soppresso supino su una tavola di schiuma con gli arti distesi. Quindi, pulire le gambe con etanolo al 70%.Quindi, fai un taglio poco profondo di circa due millimetri per rimuovere la pelle e il pelo dalla superficie di ciascuna zampa posteriore. Quindi, seziona i tessuti per accedere alle tibie e ai femori. Per rimuovere le tibie e i femori, tagliare l'osso e i muscoli appena sotto l'articolazione dell'anca e sopra le caviglie.Quindi, rimuovi quanto più tessuto muscolare possibile dalle ossa. Quindi, pulisci le ossa con etanolo al 70% e lascialo evaporare per un minuto. Quindi, metti le ossa in un piatto a sei pozzetti riempito con carne di osso.Nella piastra, tagliare un millimetro da entrambe le estremità dei femori in modo che le loro cavità interne siano esposte. Assicurati che un ago calibro 26 possa accedere alle cavità. Quindi, separa la tibia e il femore dall'articolazione del ginocchio.Quindi, inserire l'ago collegato a una siringa da 10 millilitri in una cavità ossea e raccogliere il midollo osseo. Estrarre il midollo osseo da tutte e quattro le ossa in un tubo conico da 50 millilitri con cinque millilitri di terreno di carne ossea. Espellere il terreno e il midollo su e giù più volte.Oppure vortice a bassa velocità per disperdere delicatamente i grumi nelle sospensioni. I fili di midollo dovrebbero essere spezzati in piccole macchie di midollo lunghe meno di mezzo millimetro. Quindi, rabboccare il tubo a 50 millilitri con terreno di coltura ossea e trasferirlo in un pallone di coltura tissutale da 75 centimetri quadrati.Incubare il midollo osseo per un'ora. Durante l'incubazione, le cellule mature aderiranno al pallone e i progenitori ematopoietici desiderati rimarranno in sospensione. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 millilitri e far girare le celle in un pellet.Quindi, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno di coltura MCSF. Quindi regolare la densità delle celle a 500.000 per millilitro e caricare 30 millilitri in un nuovo pallone da 75 centimetri quadrati. Continuare a coltivare le cellule e, nei giorni quattro, sette e dieci, verificare che le cellule siano aderenti e leggermente ramificate utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito.Quando si controllano le cellule, scartare il terreno contenente le cellule non aderenti. Quindi lavare una volta le cellule aderenti con IMDM e aggiungere 30 millilitri di terreno di coltura MCSF fresco nel pallone. Il giorno 10, sostituire il terreno con otto millilitri di tampone di dissociazione cellulare a base di EDTA privo di enzimi per raccogliere le cellule.Incubare brevemente le cellule, quindi raschiare delicatamente le cellule e verificare che siano state rilasciate utilizzando un microscopio. Una volta che le cellule sono state rilasciate, trasferire il tampone con le cellule in una provetta conica da 50 millilitri. Quindi sciacquare il pallone tre volte con cinque millilitri di IMDM per raccogliere più cellule.Estrarre tutte le raccolte, centrifugarle e risospendere il pellet in tre millilitri di MCSF. Ora, conta le cellule e regola la loro concentrazione a un milione per millilitro. Quindi piastra 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti.L'intero piatto dovrebbe essere riempibile. Coltiva le cellule per circa un'ora fino a quando non sono aderenti. Quindi stimolali con diverse concentrazioni di LPS o immunoglobuline per via endovenosa o entrambe preparate in IMDM.Esegui tutte le manipolazioni in doppio o triplice copia e assicurati di mantenere i controlli non trattati. Quindi incubare le cellule per 24 ore e analizzare i surnatanti. Preparare una siringa da un millilitro con la quantità richiesta di immunoglobuline e LPS per via endovenosa e inserire un ago calibro 26.Per i controlli, utilizzare invece PBS e LPS. Afferra il topo per la collottola mentre gli assicuri i quarti posteriori e la coda con una mano. Prendi di mira il quadrante inferiore destro dell'addome e inserisci l'ago con un angolo di 30-40 gradi con lo smusso rivolto verso l'alto e inseriscilo di circa 1,5 centimetri.Quindi iniettare il bolo. Dopo un'ora, raccogliere i macrofagi peritoneali dopo l'eutanasia del topo. In un cappuccio sterile, appuntare il topo soppresso su una tavola di gommapiuma con gli arti divaricati e sterilizzare l'addome con etanolo al 70%.Quindi, fai un'incisione superficiale di due millimetri lungo la linea mediana e tira via la pelle addominale. Evitare di forare la parete peritoneale. Quindi, caricare completamente una siringa da cinque millilitri con PBS sterile a pH 7,4 e iniettare il topo utilizzando un ago calibro 25 o 27, nella parte superiore della cavità peritoneale, da entrambi i lati, verso la linea mediana, con lo smusso dell'ago verso l'alto.Dopo aver estratto l'ago, massaggiare il peritoneo per 10 secondi per rimuovere le cellule. Ora, reinserisci l'ago, reinseriscilo nella cavità e raccogli circa 3,75 millilitri di liquido di lavaggio. Trasferire il liquido di lavaggio in un tubo conico da 15 millilitri con ghiaccio.Ripetere l'iniezione, il massaggio e la raccolta del liquido di lavaggio altre tre volte e tirare tutte le raccolte nello stesso tubo. Durante la raccolta finale può essere più facile prelevare il liquido di lavaggio dal lato opposto del topo. Quindi centrifugare le celle e risospenderle in 500 microlitri di terreno di placcatura.Quindi contare i macrofagi vitali e risospenderli a un milione per millilitro. Ora, piastrerete 100 microlitri di sospensione nei pozzetti di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Quindi, incubare le cellule per un'ora.I macrofagi peritoneali aderiranno alla placca. Quindi, rimuovere le cellule non aderenti e sciacquare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di IMDM caldo. Dopo ogni lavaggio, attendere 10 secondi e inclinare lentamente la piastra per estrarre la soluzione di risciacquo.Dopo i lavaggi, aggiungere nuovamente 100 microlitri di terreno di placcatura e posizionare la piastra nell'incubatrice. Per l'ELISA, continuare a incubare le cellule senza stimolazione per 24 ore. Quindi raccogliere e chiarire il terreno condizionato per l'analisi delle citochine.I BMDM possono essere utilizzati per testare le risposte ai farmaci basate su anticorpi quando vengono stimolati con uno stimolo infiammatorio in vitro. L'immunoglobulina per via endovenosa con LPS aumenta la produzione della citochina antinfiammatoria IL-10, sette volte, rispetto alla sola stimolazione di LPS. E diminuisce la produzione di IL-12/23p40.Inoltre, la stimolazione endovenosa con immunoglobuline da sola o con LPS ha aumentato l'attivazione della MAP chinasi ERK1/2, con fosforilazione precoce e prolungata. Anche l'attivazione del P-38 avvenne prima. Inoltre, i macrofagi peritoneali hanno aumentato significativamente la produzione di IL-10 con la stimolazione in vitro, rispetto ai topi iniettati con PBS.La produzione di citochine è stata successivamente valutata nel liquido di lavaggio e nei surnatanti di macrofagi peritoneali stimolati ex vivo. L'IL-10 è risultata aumentata nel liquido di lavaggio, nelle cellule peritoneali e nei macrofagi peritoneali quando i topi sono stati sottoposti a immunoglobuline e LPS per via endovenosa. In confronto, la produzione della subunità citochina pro infiammatoria IL-12/23p40 è risultata significativamente ridotta nei macrofagi peritoneali in coltura, ma non nel liquido di lavaggio.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare gli effetti dei farmaci a base di anticorpi sugli stati di attivazione dei macrofagi in vitro e in vivo utilizzando il midollo osseo di topo e i macrofagi peritoneali.

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Immunologia e Infezioni

I macrofagi hanno un ruolo centrale nella omeostasi e patologia in molti tessuti. Il protocollo presentato qui descrive i metodi per esaurire i...

Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

In questo video, dimostriamo l'attivazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo in risposta al lipopolisaccaride batterico e all'immunoglobulina per via endovenosa.

Attivazione di macrofagi derivati dal midollo osseo di topo in risposta agli anticorpi

Questo video dimostra l'attivazione dei macrofagi peritoneali di un topo utilizzando immunoglobuline per via endovenosa e lipopolisaccaride batterico. La co-stimolazione attiva i macrofagi peritoneali in macrofagi antinfiammatori dotati di attività immunoregolatrice.

Attivazione in vivo di macrofagi peritoneali in risposta agli anticorpi in un modello murino

In questo video, dimostriamo l'effetto di diverse concentrazioni di anticorpi anti-c-fms sull'osteoclastogenesi, che è il processo di formazione degli osteoclasti dai progenitori degli osteoclasti.

Effetto dell'anticorpo anti C-fms sull'osteoclastogenesi nelle cellule del midollo osseo di topo in vitro

I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell'interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l'attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l'adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione in vivo dell'ingenuo T CD4 delle cellule (cellule T) attivazione, proliferazione e differenziazione Th1, indotta da GM-CSF midollo osseo (BM)-derivato le cellule dendritiche (DCs). Inoltre, questo protocollo descrive isolamento BM e T-cell, generazione di DC e DC e T-cell trasferimento adottivo.

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Questo protocollo comprende dissezione delle ossa lunghe murine e isolamento del midollo osseo, per generare i macrofagi del midollo osseo e producono gli osteoclasti usando fattore (M-CSF) e attivatore del ricevitore del legante di fattore nucleare Kappa-B (RANKL) di stimolazione della Colonia del macrofago o fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e loro arresto dall'anticorpo anti-c-fms, ricevitore di M-CSF.

Effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro

Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

Antigeni assorbimento delle cellule dendritiche e migrare verso gli organi immunitario di presentare antigeni alle cellule T trattati. Qdot nanocristalli etichettatura fornisce un segnale di lunga durata e stabile fluorescenti. Questo permette di tenere traccia delle cellule dendritiche a diversi organi mediante microscopia a fluorescenza.

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

Scopri come valutare l'attivazione antinfiammatoria dei macrofagi indotta da farmaci a base di anticorpi nel midollo osseo murino e nei macrofagi peritoneali. Questo metodo misura la risposta dei macrofagi primari in vitro e in vivo.

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

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