Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

L'obiettivo generale di questi esperimenti è determinare gli effetti di farmaci a base di anticorpi sugli stati di attivazione dei macrofagi antinfiammatori utilizzando il midollo osseo di topo e i macrofagi peritoneali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio, i farmaci anticorpali specifici agiscono modificando i macrofagi in uno stato di attivazione antinfiammatoria che produce IL-10. Il vantaggio principale di questa tecnica è che misura la risposta dei macrofagi primari di topo dal midollo osseo in vitro e dalla cavità peritoneale in vivo.

Eseguire questa procedura in una cappa sterile. Fissa un topo soppresso supino su una tavola di schiuma con gli arti distesi. Quindi, pulire le gambe con etanolo al 70%.

Quindi, fai un taglio poco profondo di circa due millimetri per rimuovere la pelle e il pelo dalla superficie di ciascuna zampa posteriore. Quindi, seziona i tessuti per accedere alle tibie e ai femori. Per rimuovere le tibie e i femori, tagliare l'osso e i muscoli appena sotto l'articolazione dell'anca e sopra le caviglie.

Quindi, rimuovi quanto più tessuto muscolare possibile dalle ossa. Quindi, pulisci le ossa con etanolo al 70% e lascialo evaporare per un minuto. Quindi, metti le ossa in un piatto a sei pozzetti riempito con carne di osso.

Nella piastra, tagliare un millimetro da entrambe le estremità dei femori in modo che le loro cavità interne siano esposte. Assicurati che un ago calibro 26 possa accedere alle cavità. Quindi, separa la tibia e il femore dall'articolazione del ginocchio.

Quindi, inserire l'ago collegato a una siringa da 10 millilitri in una cavità ossea e raccogliere il midollo osseo. Estrarre il midollo osseo da tutte e quattro le ossa in un tubo conico da 50 millilitri con cinque millilitri di terreno di carne ossea. Espellere il terreno e il midollo su e giù più volte.

Oppure vortice a bassa velocità per disperdere delicatamente i grumi nelle sospensioni. I fili di midollo dovrebbero essere spezzati in piccole macchie di midollo lunghe meno di mezzo millimetro. Quindi, rabboccare il tubo a 50 millilitri con terreno di coltura ossea e trasferirlo in un pallone di coltura tissutale da 75 centimetri quadrati.

Incubare il midollo osseo per un'ora. Durante l'incubazione, le cellule mature aderiranno al pallone e i progenitori ematopoietici desiderati rimarranno in sospensione. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 millilitri e far girare le celle in un pellet.

Quindi, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno di coltura MCSF. Quindi regolare la densità delle celle a 500.000 per millilitro e caricare 30 millilitri in un nuovo pallone da 75 centimetri quadrati. Continuare a coltivare le cellule e, nei giorni quattro, sette e dieci, verificare che le cellule siano aderenti e leggermente ramificate utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito.

Quando si controllano le cellule, scartare il terreno contenente le cellule non aderenti. Quindi lavare una volta le cellule aderenti con IMDM e aggiungere 30 millilitri di terreno di coltura MCSF fresco nel pallone. Il giorno 10, sostituire il terreno con otto millilitri di tampone di dissociazione cellulare a base di EDTA privo di enzimi per raccogliere le cellule.

Incubare brevemente le cellule, quindi raschiare delicatamente le cellule e verificare che siano state rilasciate utilizzando un microscopio. Una volta che le cellule sono state rilasciate, trasferire il tampone con le cellule in una provetta conica da 50 millilitri. Quindi sciacquare il pallone tre volte con cinque millilitri di IMDM per raccogliere più cellule.

Estrarre tutte le raccolte, centrifugarle e risospendere il pellet in tre millilitri di MCSF. Ora, conta le cellule e regola la loro concentrazione a un milione per millilitro. Quindi piastra 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti.

L'intero piatto dovrebbe essere riempibile. Coltiva le cellule per circa un'ora fino a quando non sono aderenti. Quindi stimolali con diverse concentrazioni di LPS o immunoglobuline per via endovenosa o entrambe preparate in IMDM.

Esegui tutte le manipolazioni in doppio o triplice copia e assicurati di mantenere i controlli non trattati. Quindi incubare le cellule per 24 ore e analizzare i surnatanti. Preparare una siringa da un millilitro con la quantità richiesta di immunoglobuline e LPS per via endovenosa e inserire un ago calibro 26.

Per i controlli, utilizzare invece PBS e LPS. Afferra il topo per la collottola mentre gli assicuri i quarti posteriori e la coda con una mano. Prendi di mira il quadrante inferiore destro dell'addome e inserisci l'ago con un angolo di 30-40 gradi con lo smusso rivolto verso l'alto e inseriscilo di circa 1,5 centimetri.

Quindi iniettare il bolo. Dopo un'ora, raccogliere i macrofagi peritoneali dopo l'eutanasia del topo. In un cappuccio sterile, appuntare il topo soppresso su una tavola di gommapiuma con gli arti divaricati e sterilizzare l'addome con etanolo al 70%.

Quindi, fai un'incisione superficiale di due millimetri lungo la linea mediana e tira via la pelle addominale. Evitare di forare la parete peritoneale. Quindi, caricare completamente una siringa da cinque millilitri con PBS sterile a pH 7,4 e iniettare il topo utilizzando un ago calibro 25 o 27, nella parte superiore della cavità peritoneale, da entrambi i lati, verso la linea mediana, con lo smusso dell'ago verso l'alto.

Dopo aver estratto l'ago, massaggiare il peritoneo per 10 secondi per rimuovere le cellule. Ora, reinserisci l'ago, reinseriscilo nella cavità e raccogli circa 3,75 millilitri di liquido di lavaggio. Trasferire il liquido di lavaggio in un tubo conico da 15 millilitri con ghiaccio.

Ripetere l'iniezione, il massaggio e la raccolta del liquido di lavaggio altre tre volte e tirare tutte le raccolte nello stesso tubo. Durante la raccolta finale può essere più facile prelevare il liquido di lavaggio dal lato opposto del topo. Quindi centrifugare le celle e risospenderle in 500 microlitri di terreno di placcatura.

Quindi contare i macrofagi vitali e risospenderli a un milione per millilitro. Ora, piastrerete 100 microlitri di sospensione nei pozzetti di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Quindi, incubare le cellule per un'ora.

I macrofagi peritoneali aderiranno alla placca. Quindi, rimuovere le cellule non aderenti e sciacquare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di IMDM caldo. Dopo ogni lavaggio, attendere 10 secondi e inclinare lentamente la piastra per estrarre la soluzione di risciacquo.

Dopo i lavaggi, aggiungere nuovamente 100 microlitri di terreno di placcatura e posizionare la piastra nell'incubatrice. Per l'ELISA, continuare a incubare le cellule senza stimolazione per 24 ore. Quindi raccogliere e chiarire il terreno condizionato per l'analisi delle citochine.

I BMDM possono essere utilizzati per testare le risposte ai farmaci basate su anticorpi quando vengono stimolati con uno stimolo infiammatorio in vitro. L'immunoglobulina per via endovenosa con LPS aumenta la produzione della citochina antinfiammatoria IL-10, sette volte, rispetto alla sola stimolazione di LPS. E diminuisce la produzione di IL-12/23p40.

Inoltre, la stimolazione endovenosa con immunoglobuline da sola o con LPS ha aumentato l'attivazione della MAP chinasi ERK1/2, con fosforilazione precoce e prolungata. Anche l'attivazione del P-38 avvenne prima. Inoltre, i macrofagi peritoneali hanno aumentato significativamente la produzione di IL-10 con la stimolazione in vitro, rispetto ai topi iniettati con PBS.

La produzione di citochine è stata successivamente valutata nel liquido di lavaggio e nei surnatanti di macrofagi peritoneali stimolati ex vivo. L'IL-10 è risultata aumentata nel liquido di lavaggio, nelle cellule peritoneali e nei macrofagi peritoneali quando i topi sono stati sottoposti a immunoglobuline e LPS per via endovenosa. In confronto, la produzione della subunità citochina pro infiammatoria IL-12/23p40 è risultata significativamente ridotta nei macrofagi peritoneali in coltura, ma non nel liquido di lavaggio.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare gli effetti dei farmaci a base di anticorpi sugli stati di attivazione dei macrofagi in vitro e in vivo utilizzando il midollo osseo di topo e i macrofagi peritoneali.