2.15: Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR)

1. Preparazione del materiale di partenza NMR

1. Aggiungere ~ 10 mg di materiale di partenza a un tubo NMR pulito.
2. Sciogliere il materiale di partenza in ~0,7 mL di solvente deuterato (esempio dato CDCl₃). Un'altezza adatta del solvente per un buon spettro è di 4,5-5 cm.
3. Tappare attentamente il tubo NMR e scrivere il nome del campione sul cappuccio.
4. Agitare delicatamente il campione per assicurarsi che tutto il materiale si sia sciolto. Fare attenzione ad evitare il contatto tra il solvente e il tappo, che potrebbe portare a possibili contaminazioni del campione.
5. Inserire accuratamente il tubo NMR in uno spinner. Lo spinner ruoterà una volta inserito nel magnete per garantire che l'intero campione sperimenti un campo magnetico omogeneo. Pulire l'esterno del tubo NMR e dello spinner con 2-propanolo e tessuti di laboratorio per rimuovere impronte digitali e sporco.
6. Posizionare lo spinner in un profondimetro per campioni per assicurarsi che il fondo del tubo NMR non sia inserito troppo lontano nella sonda NMR in quanto ciò potrebbe danneggiare lo spettrometro. Sonde diverse hanno profondità di campionamento diverse e l'utente deve essere a conoscenza del profondimetro specifico.
7. Posizionare il campione nello spettrometro NMR. Qui è stato utilizzato uno spettrometro Varian 400 MHz, dotato di un autocampionatore.
8. Dopo aver completato la misurazione NMR, elaborare lo spettro e assegnare i picchi nello spettro.

2. Preparazione di 3 M NaOH e sintesi di calcone

1. Aggiungere 60 mg di NaOH a un matraccio volumetrico da 50 mL.
2. Sciogliere il NaOH aggiungendo acqua deionizzata a metà del pallone. Diluire ulteriormente la soluzione aggiungendo altra acqua fino a raggiungere il segno.
3. Aggiungere 10 ml di etanolo a un matraccio a fondo tondo da 50 ml dotato di una barra magnetica.
4. Successivamente, aggiungere 680,5 mg di 4-metossibenzaldeide e 5 mL di soluzione di NaOH preparata al punto 2.1 allo stesso matraccio.
5. Aggiungere successivamente 671 mg di 4-metilacetofenone alla soluzione agitata e tappare il matraccio e mescolare a temperatura ambiente.
6. Monitorare l'avanzamento della ^{reazione mediante 1}H NMR a intervalli di 30 minuti (vedere fase 3) fino al pieno consumo di materie prime.
7. Aggiungere 5 ml di acqua quando la reazione ha raggiunto il completamento (~3 h). Filtrare il precipitato risultante e lavarlo con 20 ml di etanolo/acqua 1:2. Lasciare asciugare il precipitato all'aria.
8. Calcola la resa del prodotto ottenuto. Preparare un campione NMR secondo il punto 1.2.2.7. Controllare la purezza con ¹H NMR. Se non puro, purificare il prodotto tramite ricristallizzazione con etanolo.
9. Aggiungere circa 3 gocce di miscela di reazione a un tubo NMR utilizzando una pipetta Pasteur e risciacquare la pipetta con solvente deuterato.
10. Ripetere i passaggi da 1.2 a 1.8.

3. Breve interpretazione di uno spettro NMR

1. Elaborare lo spettro con un programma adatto (esempio dato MestReNova).
2. Correlare i diversi picchi agli spostamenti NMR nella Tabella 1. I cambiamenti chimici danno un indizio del tipo di ambiente in cui esistono i protoni.
3. Integrare i picchi per dare il numero di idrogeni corrispondenti a ciascun picco. L'integrazione di tutti i picchi dà un numero relativo di protoni totali.
4. Valutare la scissione dei picchi di protoni, che indicano il numero di vicini.
5. Misurare l'accoppiamento J per vedere come i protoni sono collegati tra loro.

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, o NMR, è un metodo importante per determinare la struttura molecolare e la purezza dei campioni in chimica organica.

Nella spettroscopia NMR, i campioni sono esposti a un forte campo magnetico. Dopo l'esposizione, alcuni nuclei passano, o risuonano, tra livelli di energia discreti. Il divario di energia tra questi livelli può essere misurato e visualizzato come spettri. Questi dati possono essere utilizzati per chiarire la struttura chimica del campione.

Non tutti i nuclei hanno le proprietà richieste per essere NMR-attivi. Gli isotopi comuni studiati sono 1H, 2H, 13C, 19F e 31P.

Questo video introdurrà i principi alla base della risonanza magnetica nucleare, illustrerà esempi di preparazioni di campioni NMR provenienti da diverse fasi di una reazione chimica e discuterà diverse applicazioni.

Nello strumento NMR, l'azoto liquido e l'elio vengono utilizzati per raffreddare un magnete superconduttore. Il magnete applica un campo magnetico costante a un campione. All'interno del campione, i nuclei atomici con un numero dispari di protoni e/o neutroni si allineeranno con il campo, adottando uno stato a bassa energia, o contro di esso, adottando uno stato ad alta energia.

La differenza di energia tra i due livelli è la frequenza di risonanza, che dipende dall'intensità del campo applicato e dal tipo di nucleo. Per i magneti utilizzati in NMR, il valore è nell'intervallo di radiofrequenza, o RF.

Una bobina RF eccita il campione con un impulso a radiofrequenza, spostando i nuclei a bassa energia allo stato superiore, prima di tornare indietro. La bobina rileva queste variazioni di magnetizzazione, che vengono visualizzate come picchi.

La forza della NMR risiede nella sua capacità di distinguere i nuclei, in questo caso l'idrogeno, in base al loro ambiente chimico. Gli elettroni sugli atomi vicini bloccheranno, o "scherzeranno", i nuclei da parte del campo magnetico. Questo campo efficace cambia la frequenza di risonanza per i nuclei particolari, chiamato spostamento chimico. Nell'etanolo, i protoni metilene, ossidrile e metile hanno tutti frequenze di risonanza uniche. Determinando l'area sotto ogni picco si chiarisce il numero di ciascun tipo di protone.

Poiché gli strumenti con diverse intensità magnetiche sposteranno le frequenze di risonanza, si riferiscono a una molecola standard aggiunta al campione, spesso tetrametilsilano o TMS. Lo spostamento chimico delle frequenze è molto piccolo, spesso riportato in parti per milione, o ppm.

Quando si utilizza un magnete potente ad alta risoluzione, i picchi a volte si dividono in picchi secondari. Ciò è causato dai nuclei vicini, alcuni dei quali sono allineati con il campo magnetico, altri contro; modificando ulteriormente il campo effettivo applicato ai nuclei. Nell'etanolo, i 2 protoni di metilene dividono il picco metilico due volte in una tripletta e i 3 protoni metilici dividono il picco di metilene tre volte in un quartetto. La distanza della scissione, o accoppiamento J, è correlata alla distanza dei nuclei, aiutando nella scoperta qualitativa.

Ora che hai compreso i principi di base alla NMR, esaminiamo una procedura di esempio che utilizza la NMR protonica per monitorare la sintesi del calcone da un'aldeide e un chetone.

Inizia usando una pipetta Pasteur per aggiungere una piccola quantità di materiale di partenza a un bicchiere. Spostarsi nella cappa aspirante e diluire il materiale di partenza con 0,7 mL di solvente deuterato. Vengono utilizzati solventi deuterati, poiché la frequenza di risonanza del deuterio è al di fuori dell'intervallo dei protoni.

Utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere 0,7 ml di materiale di partenza diluito in una provetta NMR pulita da 5 mm, riempiendo il fondo di 4,5 x 5 cm. Tappate il tubo NMR ed etichettatelo. Agitare delicatamente la provetta, facendo attenzione a evitare il contatto tra il campione e il tappo. Quindi, inserire il tubo nello spinner.

Pulire l'esterno del tubo e dello spinner utilizzando 2-propanolo e fazzoletti da laboratorio. Quindi posizionare il gruppo campione nel profondimetro e calibrare la profondità di inserimento.

Dopo la calibrazione, caricare il gruppo campione nello spettrometro NMR manualmente o utilizzando un campionatore automatico. Infine, utilizzare una workstation computer per acquisire lo spettro NMR.

Generare spettri NMR utilizzando questa procedura per ciascuno dei materiali di partenza della reazione. Per la sintesi del calcone, gli spettri dovrebbero essere generati sia per la metossibenzaldeide che per il metilacetofenone.

Successivamente, eseguire la sintesi del campione combinando i materiali di partenza e i reagenti in un pallone per iniziare la reazione.

A intervalli di 30 minuti, rimuovere una piccola aliquota della miscela di reazione utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere 3 gocce in una provetta NMR pulita.

Diluire questo prodotto di reazione grezzo con solvente deuterato e preparare per NMR utilizzando la procedura precedentemente descritta.

Man mano che la reazione procede, si formerà un precipitato giallo. Al termine della reazione, lavare e filtrare il precipitato e generare spettri NMR per il prodotto di reazione purificato.

Ora che abbiamo generato spettri NMR in ogni fase della reazione chimica, analizziamoli.

I picchi degli spettri NMR per ciascuno dei materiali di partenza sono assegnati a diversi gruppi di protoni all'interno della molecola in base ai loro spostamenti chimici e al numero di protoni che contribuiscono a ciascun picco. Qui, assegniamo i 4 principali gruppi di protoni per il metilacetofenone e la metossibenzaldeide, notando il picco dell'aldeide tra 9,5 e 10,5 ppm. Confrontando gli spettri NMR dei prodotti di reazione grezzi in diversi punti temporali, viene chiarita l'evoluzione della reazione chimica che sintetizza il calcone. Ad esempio, il picco aldeidico del materiale di partenza metossibenzaldeide è ancora presente dopo 30 minuti di reazione, ma è completamente scomparso dopo 3 ore, a significare il completamento della reazione.

Esaminando lo spettro del prodotto purificato possiamo assegnare ogni picco a un gruppo di protoni nella struttura del calcone. Ad esempio, esaminando i picchi 3 e 4 vediamo che i loro integrali sono entrambi uno, corrispondenti a gruppi contenenti un solo protone.

I picchi 3 e 4 sono i cosiddetti doppietti che indicano un protone vicino. Entrambi hanno costanti di accoppiamento J di 16 Hz, suggerendo che i protoni sono situati attraverso un doppio legame E. Assegnando tutti i picchi NMR del prodotto di reazione purificato, confermiamo la sintesi di un calcone puro.

La spettroscopia NMR ha una vasta gamma di applicazioni e viene utilizzata in molti campi scientifici e medici.

In questa applicazione, la risonanza magnetica mobile protonica viene utilizzata per verificare la sintesi e la struttura sia del diamidocarbene che della mononoamidocarbina, i cui spettri NMR hanno diversi modelli di divisione dei picchi. Questi carbeni hanno anche generato prodotti di reazione apparentemente diversi quando combinati con fosforo bianco; DAC1 ha generato un prodotto di reazione rosso brillante, mentre MAAC2 ha prodotto un prodotto arancione brillante. Queste differenze nei prodotti di reazione sono state confermate utilizzando una seconda applicazione di NMR, 31P? NMR, che genera spettri basati sulle differenze nella frequenza di risonanza dei nuclei di fosforo.

Qui, la risonanza magnetica nucleare, o MRI, è stata utilizzata per generare una mappa anatomica del cervello e per selezionare le regioni cerebrali di interesse. Quindi la spettroscopia NMR è stata utilizzata per generare spettri di metaboliti chiave. Infine, utilizzando la risonanza magnetica, sono stati valutati i cambiamenti nel metabolismo cerebrale in diverse condizioni sperimentali.

In questa applicazione, la risonanza magnetica mobile è stata utilizzata per analizzare le proprietà di legame e proporre una struttura 3D di un peptide legante il rame. In primo luogo, gli spettri NMR sono stati confrontati per gli stati non legati e legati al rame del peptide. Quindi, utilizzando tecniche NMR bidimensionali più avanzate, sono state valutate diverse potenziali conformazioni della struttura del peptide. Infine, questi vincoli strutturali derivati dalla risonanza magnetica sono stati utilizzati per sviluppare una struttura tridimensionale proposta per il peptide non legato.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'analisi NMR. A questo punto è necessario comprendere i principi alla base della generazione e dell'analisi degli spettri NMR, nonché una procedura per la preparazione dei campioni NMR.

Grazie per l'attenzione!