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L'ultracentrifugazione a gradiente di densità è un approccio comune per isolare e purificare le strutture cellulari per esperimenti biochimici. La tecnica utilizza una centrifuga ad alta velocità, o ultra, per separare in modo non distruttivo i componenti cellulari in un gradiente di densità. Questo video descrive i principi dell'ultracentrifugazione con gradiente di densità, fornisce una procedura generale utilizzando un gradiente di saccarosio e discute alcune applicazioni.
Iniziamo esaminando i principi delle ultracentrifughe e dei gradienti di densità. Una sospensione contiene particelle in un solvente liquido. A causa della gravità, le particelle più dense del solvente si sedimentano mentre quelle meno dense del solvente galleggiano. Maggiore è la differenza di densità tra la particella e il solvente, più veloce è la separazione.
Un'ultracentrifuga contiene un'unità chiamata rotore, che ruota a velocità altamente controllate, simulando un forte campo gravitazionale. All'interno di questo campo, le differenze di densità tra le particelle e il solvente sono amplificate.
La forza del campo dipende dalla velocità di rotazione. Anche un piccolo rotore a una velocità di rotazione relativamente bassa può creare una forza migliaia di volte più forte del campo gravitazionale terrestre.
Se una provetta contiene più liquidi di diversa densità, la centrifugazione li manterrà in strati separati in ordine di densità, con il liquido più denso più vicino alla base. Tale stratificazione di più liquidi è chiamata "gradiente di densità". Ce ne sono di due tipi. Nei gradienti a gradini, i liquidi di densità decrescente vengono accuratamente stratificati l'uno sull'altro. Nei gradienti continui, i liquidi vengono miscelati in proporzioni variabili, quindi la densità diminuisce gradualmente dalla base verso l'alto.
Gli organelli cellulari possono essere separati utilizzando un gradiente a gradini, attraverso la "centrifugazione isopicnica a gradiente di densità". Questa è la procedura di centrifugazione più semplice e comune.
Questa procedura viene utilizzata per separare le strutture cellulari. Più denso è l'organello, più scende, con i mitocondri in alto e gli acidi nucleici verso il basso.
Ora che conosci i principi alla base della tecnica, vediamola in laboratorio.
Prima di avviare la procedura, è necessario annotare i valori di velocità e densità del produttore e controllare la corrosione dell'ultracentrifuga. Questa procedura utilizza un rotore a benna oscillante.
In primo luogo, il materiale cellulare viene preparato omogeneizzando le cellule, che rilascia in modo non distruttivo i loro organelli. L'omogenato può essere frazionato attraverso una centrifugazione preliminare a bassa velocità, per rimuovere i componenti a bassa densità. Successivamente, vengono preparate le soluzioni di saccarosio.
Il saccarosio viene aggiunto in quantità crescenti in modo che ogni soluzione sia più concentrata, e quindi più densa, della precedente. Le densità esatte delle soluzioni dipenderanno dai componenti da separare, che variano tra gli organismi. Le soluzioni devono avere densità comprese tra quelle dei componenti da separare, con l'ultima soluzione più densa del componente più denso dell'analita. Le tecniche per separare componenti più densi del saccarosio, come gli acidi nucleici, sono descritte nelle applicazioni.
Il gradiente di saccarosio viene ora creato in una provetta da centrifuga pulita. Una pipetta viene utilizzata per aspirare la soluzione di saccarosio più concentrata. Con il tubo tenuto in posizione verticale, il puntale della pipetta viene posizionato in alto contro la parete e il liquido viene erogato costantemente verso il basso. È importante che l'area di lavoro sia mantenuta libera da vibrazioni e altri disturbi.
Dopo aver sostituito la punta, le soluzioni rimanenti vengono aggiunte in ordine decrescente di densità. Vengono erogati con cura per formare strati distinti ed evitare la miscelazione. Infine, circa mezzo millilitro del campione cellulare viene aggiunto in cima al gradiente e la provetta viene pesata. Questo viene utilizzato per bilanciare la distribuzione del peso, la fase successiva del processo.
La centrifugazione dovrebbe iniziare il prima possibile. Il tubo viene inserito nel rotore, che viene poi bilanciato posizionando soluzioni bianche di uguale peso in fessure opposte. Il rotore viene inserito nell'ultracentrifuga e il sistema sigillato. La temperatura e la velocità e il tempo di rotazione sono impostati. I valori tipici sono 4 ? C con una forza superiore a 100.000 x g per 16 h.
Dopo la centrifugazione, la provetta viene estratta dal rotore, avendo cura di mantenerla in posizione verticale e indisturbata. I diversi componenti cellulari si sono frazionati in bande discrete tra gli strati della soluzione. Le frazioni possono essere raccolte con una siringa. In alternativa, il fondo del tubo può essere perforato con un ago sottile e sterilizzato e il deflusso può essere raccolto in tubi sterili. I componenti cellulari sono stati ora isolati. Possono essere memorizzati a -80 ?C.
Ora che abbiamo visto la procedura di base, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni.
Un'applicazione tipica è l'isolamento di complessi multiproteici nelle cellule vegetali. In questo esempio, i complessi responsabili del flusso ciclico di elettroni vengono isolati dal tilacoide, il sito della reazione della luce nella fotosintesi. Questa procedura utilizza soluzioni discrete dal 14 al 45% di saccarosio. La centrifugazione avviene oltre 100.000 x g per 14 ore a 4 °C.
Poiché gli acidi nucleici sono più densi del saccarosio, la centrifugazione isopicnica non può separarli dagli organelli in modo non distruttivo.
Viene utilizzata una tecnica diversa, nota come "centrifugazione rateo-zonale". Separa gli organelli in base ai loro tassi di sedimentazione, che dipendono non solo dalla loro densità, ma anche dalle loro conformazioni. In base a questa proprietà, viene utilizzato un gradiente continuo per separare i componenti.
Le fasi procedurali sono simili a quelle dei casi isopicnici. In questo esempio, i complessi RNA-ribosoma vengono isolati utilizzando un gradiente continuo dal 5% al 20%, centrifugati a 230.000 x g. La centrifugazione viene interrotta dopo alcune ore per evitare la co-precipitazione.
I filamenti di acido nucleico possono essere separati l'uno dall'altro in base alla densità.
Questo perché i filamenti ricchi di guanina e citosina sono più densi di quelli ricchi di adenina e tiamina. In questo caso, il gradiente non può essere fatto di saccarosio, perché il saccarosio è meno denso degli acidi nucleici. Invece, vengono utilizzati gradienti di cloruro di cesio, tipicamente da 1,65 a 1,75 g/mL, in quanto hanno una densità sufficiente e una bassa viscosità.
Qui vediamo il DNA del plancton che viene purificato utilizzando un gradiente continuo di cloruro di cesio. La centrifugazione avviene a oltre 1.000.000 x g per 18 ore sotto vuoto.
Hai appena visto il video di JoVE sull'ultracentrifugazione con un gradiente di densità del saccarosio. A questo punto dovreste capire come funziona un gradiente di densità, come costruire un gradiente a gradini e come caricare e far funzionare un'ultracentrifuga. Grazie per l'attenzione!
