Misurazione di deformabilità e l'eterogeneità delle cellule rosse nel sangue di ektacitometria

L'obiettivo generale di questa tecnica è misurare la deformabilità dei globuli rossi e l'eterogeneità cellulare mediante ectacitometria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in ektacitometria, come ad esempio quanto siano deformabili gli eritrociti, quanto sia eterogeneo un campione di sangue e come l'esperimento cambi in funzione della malattia. I principali vantaggi di queste tecniche sono l'accessibilità, la convenienza e l'affidabilità nella misurazione della deformabilità e dell'eterogeneità delle popolazioni di globuli rossi.

Le tecniche possono essere utili per monitorare la risposta alla terapia nei pazienti con anemia falciforme. Perché la deformabilità e l'eterogeneità dei globuli rossi sono correlate alla composizione e alla concentrazione dell'emoglobina. Questi metodi possono essere applicati ad altre malattie caratterizzate da una ridotta deformabilità dei globuli rossi, come il diabete, dove la ridotta deformabilità dei globuli rossi potrebbe contribuire alla malattia microvascolare.

Iniziare collegando il tubo osmolare zero alla soluzione PVP a bassa osmolare e il tubo osmolare 500 alla soluzione PVP ad alta osmolare. Assicurarsi che il bob sia completamente abbassato nella tazza. Avviare il software e innescare la macchina selezionando Controllo hardware, quindi I/O dello strumento. Lasciare che lo strumento completi il ciclo di adescamento.

Una volta completato il ciclo, sollevare il bob dalla tazza e asciugare completamente il bob e la tazza con un panno per la pulizia a basso contenuto di lanugine. Mescolare delicatamente un campione di sangue intero appena prelevato capovolgendo più volte la fiala. Quindi, pipettare 25 microlitri di sangue intero in cinque millilitri di soluzione PVP isoosmolare.

Dopo aver tappato il flaconcino, mescolare delicatamente capovolgendo nuovamente più volte. Scegliere deformabilità dal menu principale del software, quindi creare una nuova analisi e aggiungere i dettagli sperimentali. Quindi, sollevare il coperchio dell'ectacitometro e verificare che il bob sia completamente abbassato nella tazza e che la tazza stia girando.

Pipettare un millilitro di soluzione di sangue PVP nello spazio tra la tazza e il bob. Quindi sollevare leggermente il bob per abbassare il campione. Attendere che tutte le bolle siano uscite dalla soluzione, quindi chiudere il coperchio dell'ectacitometro.

Regola il guadagno su 200 spostando la freccia lungo la barra di scorrimento nel software. Quando la temperatura è stabile a 37 gradi Celsius e l'immagine di diffrazione è stabile, premere start. Osservare i modelli di diffrazione man mano che l'acquisizione dei dati procede per assicurarsi che rimangano circolari, ellittici o a forma di diamante.

Al termine dell'acquisizione dei dati, stampare il rapporto e pulirlo. Un modello di diffrazione ottenuto da sangue sano in risposta allo stress di taglio mostra il modello ellittico atteso. L'indice di allungamento viene calcolato utilizzando l'equazione mostrata qui.

Quando il campione viene aspirato, sciacquare lo spazio tra la tazza e il bob spruzzando acqua deionizzata nello spazio mentre lo strumento rimane nel ciclo di pulizia. Una volta completato il ciclo di pulizia, sollevare il bob dalla tazza e asciugare completamente il bob e la tazza con un panno per la pulizia a basso contenuto di lanugine. Una corretta essiccazione è fondamentale, poiché l'acqua residua lisa i globuli rossi, producendo interferenze.

Selezionare Esporta per salvare il report. Infine, fai clic sul pulsante del menu principale sul software per tornare alla pagina principale. Dopo aver caricato un altro campione nell'ectacitometro come prima, assicurarsi che sullo schermo sia presente un'immagine di diffrazione stabile.

Regola il guadagno della fotocamera spostando un righello lungo lo schermo fino a quando non produce un'altezza di diffrazione di 3,8 cm. Utilizzare un righello per verificare l'altezza dell'immagine sullo schermo del computer. Quindi, premere start e osservare l'acquisizione dei dati come prima.

Questa immagine mostra un modello di diffrazione di 3,8 cm ottenuto dal sangue di un paziente affetto da anemia falciforme. Dopo aver pulito l'ectacitometro come mostrato in precedenza, ripetere la procedura per ottenere modelli di diffrazione ad altezze di 4,5 cm e 5,4 cm. La distorsione del modello di diffrazione si verifica in campioni di sangue eterogenei perché i globuli rossi rigidi non si allineano correttamente con le cellule deformabili, risultando in un modello di diffrazione a forma di diamante.

Questo modello di distorsione è sempre più rilevabile man mano che il guadagno della fotocamera viene regolato per generare modelli di diffrazione più ampi. Per l'ectaccitometria a gradiente osmotico, iniziare aggiungendo 250 microlitri di sangue intero a una fiala contenente cinque millilitri di PVP iso-osmolare e mescolare delicatamente. Scegli Osmoscan dal menu principale del software.

Quindi posizionare il flaconcino contenente la soluzione PVP per il sangue sotto l'ago sul lato sinistro della macchina. Abbassare l'ago fino a toccare il fondo del flaconcino. Assicurarsi che il tubo sia collegato correttamente alle soluzioni osmolari basse e alte per la produzione di gradiente.

Chiudere il coperchio dell'ectacitometro e aprire lo sportello nella metà inferiore per consentire una visione del sangue che entra nel tubo. Premere Nuova analisi e digitare i dettagli dell'esperimento. Dopo aver regolato il guadagno della fotocamera su 200, lasciare in funzione la macchina fino a quando il sangue non entra nella tazza dal tubo sotto lo strumento.

Quando lo schermo del computer mostra un modello di diffrazione stabile, iniziare l'acquisizione dei dati premendo il pulsante Inizia ora nella finestra di dialogo. Consentire all'ectacitometro di acquisire dati fino a circa 500 milliosmoli per chilogrammo, quindi arrestare lo strumento. Stampare il report.

Quindi, rimuovi la vecchia fiala di sangue PVP e sostituiscila con una fiala pulita contenente acqua deionizzata. Abbassare l'ago in modo che tocchi il fondo della fiala, quindi premere il pulsante di risciacquo nella finestra di dialogo per risciacquare il sistema di sfumatura. Una volta completato il risciacquo, premere l'opzione di pulizia nella finestra di dialogo sul monitor del computer e selezionare Esporta per salvare il rapporto.

Asciugare il bob e la tazza come prima. Le popolazioni di sangue omogenee, come quelle riscontrate nei volontari sani, non producono curve di deformabilità diverse quando vengono misurate le dimensioni della diffrazione. Al contrario, le popolazioni di sangue eterogenee, come il sangue di pazienti con anemia falciforme, mostrano diminuzioni significative delle misure di deformabilità in funzione della dimensione del modello di diffrazione.

Nell'anemia falciforme, quando il grado di distorsione del pattern di diffrazione viene misurato in funzione dell'EI max, è correlato con l'emoglobina S e la variante dell'emoglobina adulta, l'emoglobina A2. La trasfusione corregge la distorsione, come indicato dalla sua relazione inversa con la percentuale di emoglobina adulta normale nel sangue. Sia che il grado di distorsione del pattern di diffrazione sia misurato in funzione dello sforzo di taglio richiesto per ottenere la deformabilità massima dimezzata, o in funzione dell'EI max, è correlato con l'emoglobina fetale. I parametri chiave dell'ektacitometria a gradiente osmotico, come EI max, EI min e O min, forniscono informazioni aggiuntive rispettivamente sull'idratazione cellulare, sui rapporti superficie/volume e sulla fragilità osmotica.

Una volta padroneggiate, queste tecniche possono essere eseguite in circa un'ora, se eseguite correttamente. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia, per rispondere a ulteriori domande relative alla deformabilità dei singoli eritrociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la deformabilità e l'eterogeneità del siero nei campioni di sangue.