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Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo significativo in un'ampia varietà di funzioni biologiche. La maggior parte delle interazioni proteina-proteina e i loro effetti biologici devono ancora essere identificati. La co-immunoprecipitazione, o CoIP, e i saggi pull-down sono due metodi strettamente correlati per l'identificazione di interazioni stabili proteina-proteina. Questo video tratterà i principi dei due saggi, le loro procedure generali di laboratorio e le applicazioni di queste tecniche.
I saggi CoIP e pull-down sono varianti dell'immunoprecipitazione, un metodo per isolare selettivamente una specie proteica da una soluzione complessa. In un esperimento di immunoprecipitazione, un anticorpo specifico per una proteina bersaglio può formare un complesso immunitario con quel bersaglio nel campione. Il complesso viene quindi catturato su un supporto solido, tipicamente la proteina A legata a una perlina di sefarosio. Tutte le proteine non catturate vengono rimosse mediante fasi di centrifugazione. La proteina viene quindi rilasciata dall'anticorpo e dal supporto solido mediante ebollizione nel tampone di caricamento del campione SDS-PAGE riducente.
La co-immunoprecipitazione viene condotta allo stesso modo, tranne per il fatto che i complessi proteici intatti vengono catturati sul supporto solido. L'anticorpo si lega alla proteina bersaglio, che, a sua volta, è legata a un'altra proteina che non è bersaglio dell'anticorpo. Come nell'immunoprecipitazione, il complesso proteico viene rilasciato dall'anticorpo e dal supporto solido mediante ebollizione nel tampone di caricamento del campione SDS-PAGE riducente.
I saggi pull-down sono simili alla co-immunoprecipitazione, differendo solo per l'uso di una proteina "esca", rispetto a un anticorpo. Attraverso tecniche di biologia molecolare, questa proteina esca viene ingegnerizzata con un tag di affinità, come una serie di residui di istidina. Questi tag di affinità sono descritti in "Separazioni di biomolecole basate sulla cromatografia". La proteina viene quindi catturata su un ligando di affinità immobilizzato specifico per il tag. La proteina catturata viene quindi incubata con un campione che contiene proteine che formano complessi con l'"esca". Il complesso proteico viene rilasciato dal supporto di affinità mediante lavaggio con una soluzione contenente un analita competitivo specifico per il tag sulla proteina "esca". I saggi pull-down sono utili per confermare le interazioni proteiche previste dalla co-immunoprecipitazione e per scoprire interazioni proteiche sconosciute.
Ora che sono stati discussi i principi della co-immunoprecipitazione e dei saggi di pull-down, diamo un'occhiata alle loro procedure di laboratorio.
Per prima cosa discutiamo della co-immunoprecipitazione. A una serie di provette per microfuge viene aggiunto: tampone PBS e una soluzione al 50% di proteina A-sefarosio, un complesso resina-proteina che si lega all'anticorpo. I tubi per microfugi vengono ruotati per garantire una corretta distribuzione, quindi la resina viene lavata con un tampone PBS aggiuntivo. Il lisato cellulare, contenente la proteina desiderata, e 2 μg di anticorpo vengono aggiunti ai tubi per microfughe e la miscela viene ruotata per 1 ora a 4 μC. Le perle vengono pellettate mediante centrifugazione, il surnatante viene scartato e le perle vengono lavate nuovamente tre volte con tampone per rimuovere le proteine non legate. Le perle contenenti il complesso anticorpo-proteina sono in grado di ridurre il tampone di caricamento del campione SDS-PAGE, per la rimozione del complesso dall'anticorpo e per l'analisi mediante SDS-PAGE e immunoblotting.
Ora discuteremo la procedura per i saggi pull-down: la proteina "esca" è espressa in un plasmide con l'appropriato tag di affinità. Dopo aver raggiunto la fase di crescita logaritmica, le cellule vengono lisate e quindi centrifugate. Le perle sospese di streptavidina-sefarosio, che catturano la proteina "esca" marcata con biotina, vengono pipettate in un tubo microfugo. Le perle vengono quindi centrifugate e il surnatante accuratamente rimosso mediante aspirazione. Le perle vengono quindi lavate con tampone, centrifugate e il surnatante rimosso.
Le cellule contenenti la proteina putativa "preda", che ha un'affinità per la proteina "esca", vengono raccolte mediante centrifugazione. Il surnatante viene quindi aggiunto alla provetta per microfuga contenente la resina e incubato a 4 ? C per 3 h su shaker. La resina viene quindi centrifugata, il surnatante rimosso e la resina lavata per rimuovere le proteine non legate. Alla resina viene aggiunto un tampone di eluizione e la miscela viene incubata a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker. La resina viene quindi centrifugata e il surnatante contenente il complesso desiderato viene analizzato mediante immunoblotting.
Ora che abbiamo esaminato le procedure, diamo un'occhiata ad alcune delle applicazioni utili dei saggi di co-immunoprecipitazione e pull-down.
La co-immunoprecipitazione può essere utile per comprendere meglio il meccanismo d'azione degli enzimi. Le proteine di resistenza ai mixovirus, o Mx, inibiscono un'ampia gamma di virus, tra cui l'influenza A, per i quali il meccanismo è poco compreso. La co-immunoprecipitazione è stata utilizzata per studiare l'interazione tra la proteina Mx1 del topo e la nucleoproteina dell'influenza.
I saggi pull-down si sono dimostrati utili nello studio degli effetti dei secondi messaggeri, che sono proteine che comunicano un segnale dall'ambiente cellulare. Sono un componente di una via di segnalazione in cui più proteine interagiscono in risposta a stimoli ambientali. Gli ioni calcio agiscono come messaggeri secondari legandosi alla calmodulina, che, a sua volta, si lega a un'ampia varietà di proteine, mediando molti tipi di risposte biologiche. Senza il calcio, la proteina non può legarsi alla calmodulina. È stato condotto un test pull-down per testare la capacità delle proteine di legarsi alla calmodulina in presenza o assenza di ioni calcio.
I saggi di co-immunoprecipitazione e pull-down sono generalmente utilizzati per analizzare le interazioni proteiche stabili o forti, ma non quelle transitorie. Un recente sviluppo nei saggi pull-down, l'HaloTag, ha semplificato lo studio delle interazioni proteiche transitorie; HaloTag è un tag di fusione proteica geneticamente codificato, fuso con la proteina di interesse, in grado di reagire chimicamente con un supporto solido aloalcano. Se si desidera un'analisi funzionale, il complesso proteico, meno il tag, nella sua interezza potrebbe quindi essere isolato incubando con la proteasi del virus dell'incisione del tabacco.
Hai appena visto il video di JoVE sulla co-immunoprecipitazione e sui saggi di pull-down. Questo video descrive i principi dei due metodi, le procedure generali di laboratorio e alcune delle loro applicazioni.
Grazie per l'attenzione!
