Name: Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Impara a preparare fette fresche di retina di zebrafish per imaging ex vivo con biosensori fluorescenti. Questo metodo consente di studiare i ruoli fisiologici e metabolici degli ioni calcio nelle cellule retiniche in tempo reale.

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Ringraziamo Ralph Nelson e Daniel Possin per guida premurosa durante lo sviluppo di questo protocollo ed Eva Ma, Ashley George e Gail Stanton per la generazione di linee di zebrafish transgenici stabile. Il lavoro è stato supportato da NSF GRFP 2013158531 a M.G., 5T32EY007031 NIH NEI W.C. e M.G. ed EY026020 di J.H. e S.B.

<ol><li>Lieschke, G., Currie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Ma, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3789190/">Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors.</a> Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Andrews, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualising+apoptosis+in+live+zebrafish+using+fluorescence+lifetime+imaging+with+optical+projection+tomography+to+map+FRET+biosensor+activity+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time.</a> J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).</li>
<li>Kioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intramitochondrial+ATP+levels+identifies+G0%2FG1+switch+gene+2+as+a+positive+regulator+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).</li>
<li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Visualizationof+Neuronal+Activity+during+Perception%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception.</a> Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li>
<li>Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+translational+neuroscience+research%3A+from+tank+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside.</a> Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).</li>
<li>Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (36), e1742(2010).</li>
<li>Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetic+approaches+to+visual+system+development+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish.</a> J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).</li>
<li>Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutation+in+the+Cone-Specific+pde6+Gene+Causes+Rapid+Cone+Photoreceptor+Degeneration+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish.</a> J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).</li>
<li>Gross, J., Perkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutants+as+models+for+congenital+ocular+disorders+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans.</a> Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).</li>
<li>Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+Cone+Photoreceptors+Persist+Despite+Neighboring+Mutant+Cone+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration.</a> J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).</li>
<li>Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+an+optogenetic+pH+sensor+reveals+that+protons+mediate+lateral+inhibition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina.</a> Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).</li>
<li>Van Hook, M., Thoreson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Whole-cell+Recordings+from+Photoreceptors+and+Second-order+Neurons+in+an+Amphibian+Retinal+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (76), e50007(2013).</li>
<li>Connaughton, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).</li>
<li>Kennedy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+cone+photoreceptor-specific+promoter+and+genetic+rescue+of+achromatopsia+in+the+nof+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).</li>
<li>George, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptojanin+1+is+required+for+endolysosomal+trafficking+of+synaptic+proteins+in+cone+photoreceptor+inner+segments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments.</a> PLoS ONE. 9 (1), e84394(2014).</li>
<li>George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hdl.handle.net/1773/33102">http://hdl.handle.net/1773/33102</a> (2015).</li>
<li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li>
<li>Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).</li>
<li>Kanow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Maintain+Distinct+Ca2%2B+Pools+in+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).</li>
<li>Uckermann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staining+by+vital+dyes+of+M%C3%BCller+glial+cells+in+retinal+wholemounts%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts.</a> Glia. 45 (1), 59-66 (2003).</li>
<li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cytometry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Ca2%2B+Dynamics+in+Cone+Photoreceptor+Axon+Terminals+of+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (99), (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ex vivo imaging di zebrafish fresco fette retinica ha dimostrato di essere un versatile strumento per lo studio del fotoricettore biologia20,21,22ed è unico in quanto permette l'analisi delle singole cellule in un maturo, completamente retina differenziato. Con la pratica, è possibile condurre esperimenti multipli con il tessuto da un singolo pesce, utilizzando anche fette di serie dalla stessa parte della retina. Oltre...

Il danio zebrato (Danio rerio) diventare ampiamente utilizzato nella ricerca scientifica medica e base1, grazie alla sua piccola dimensione, rapido sviluppo e sistemi dell'organo dei vertebrati. La naturale trasparenza delle larve di zebrafish combinati con metodi stabiliti per transgenesi hanno permesso la visualizzazione dettagliata dei processi cellulari in un animale vivente. Un numero di biosensori fluorescenti geneticamente codificati è stati presi di mira alle cellule di zebrafish specifico per rilevare il Ca2 + 2, perossido di idrogeno3, apoptotico attivazione4 e ATP5.
In vivo imaging delle larve di zebrafish ha portato innovazioni nel campo delle neuroscienze, tra cui la mappatura del cervello circuito6 e7di disturbi dello sviluppo del farmaco per il sistema nervoso centrale. Zebrafish sono adatti per ricerca sulla visione, perché le loro retine presentano la struttura laminare e tipi di neurone dei vertebrati superiori, e mostrano comportamenti visual robusto8,9. Diversi tipi di degenerazioni retiniche analoghe alla malattia umana sono stati modellati con successo e ha studiati in zebrafish10,11, compreso formazione immagine diretta dei singoli fotorecettori che degenera in una retina2, 12.
Mentre in vivo imaging larvale zebrafish è uno strumento prezioso, diventa più difficile come pesci crescono e si sviluppano pigmentazione, e alcuni trattamenti farmacologici non possono superare un animale intero. Ulteriormente, alcuni processi cellulari cambiano con lo sviluppo e l'età, rendendo più tardi tempo punti critici per la funzione di comprensione e la progressione della malattia negli animali adulti. Metodi biochimici quali immunoblot, quantitative PCR, il consumo di O2 e analisi metabolomica possono fornire importanti indizi sulla biologia della retina nel suo complesso, ma è difficile discernere contributi singoli tipi di cellule colpiti da malattia. Tessuto retinico isolato ex vivo di imaging consente di ignorare questi problemi e mentre imaging piatto montate retine offre una vista della retina esterna13, funzionalità retinica interna più profonda sono oscurati. Le sezioni trasversali retiniche, come quelli presentati fissa le analisi di immunohistochemical, permettono una visione chiara di tutti i livelli e tipi di cellule, ma offrono solo un singolo snapshot dei processi dinamici coinvolti nella malattia e nella funzione normale.
Qui, presentiamo un metodo per la generazione ex vivo sezioni trasversali retiniche dallo zebrafish adulto per l'imaging. È simile ai metodi per la preparazione di fette retiniche anfibio e zebrafish per studi elettrofisiologici e morfologici14,15, con importanti modifiche per time lapse imaging ex vivo mediante confocale microscopia. Le risposte di fluorescenza di biosensori o coloranti a fette sono monitorate in tempo reale con un microscopio confocale offrendo agenti farmacologici mediante perfusione. Mentre il metodo è stato sviluppato per l'imaging di fotorecettori, può essere fattibile per utilizzarlo per la visualizzazione di celle Müller, cellule bipolari, cellule orizzontali, cellule amacrine o cellule retiniche del ganglio con appropriati marcatori fluorescenti. Inoltre, le fette possono essere caricati con coloranti fluorescenti cellula-permeabile di attuabilità delle cellule di relazione, trasporto vescicolare, funzione mitocondriale o stato redox. Questa preparazione versatile permette la visualizzazione di una vasta gamma di processi subcellulare in tutta la retina, tra cui Ca2 + dinamiche, trasduzione del segnale e dello stato metabolico.

<table><tbody><tr><td></td><td>zebrafish University of Washington South Lake Union Aquatics Facility</td><td></td><td>stock mantenute internamente come linee transgeniche stabili</td></tr><tr><td>vaselina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-090-843</td><td>per siringa di vaselina Siringa</td></tr> da <tr><td>3 ml Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-823-436</td><td>per siringa di vaselina</td></tr><tr><td>20 g 3,8 cm ago a punta scorrevole</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>per siringa di vaselina</td></tr><tr><td>liscia 7 cm X 2,5 cm vetrino da microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>per dissezione oculare, camera di affettamento</td></tr><tr><td>Seche Vite smalto trasparente</td><td>Amazon</td><td>B00150LT40</td><td>per camera di affettamento</td></tr><tr><td>18 mm X 18 mm #1 vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>per scale di imaging cera dentale</td></tr><tr><td>non aromatizzata</td><td>Amazon</td><td>B01K8WNL5A</td><td>per scale di imaging lame di</td></tr><tr><td>rasoio a doppio taglio</td><td>Stoelting</td><td>51427</td><td>per affettare i tessuti</td></tr><tr><td>affettatrice con micrometro digitale</td><td>Stoelting</td><td>51415</td><td>per affettare i tessuti</td></tr><tr><td>carta da filtro - cellulosa mista grigliata bianca, diametro 13 mm, 0,45 &; m dimensione dei pori</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWG01300</td><td>carta da filtro per il montaggio di retine</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712 per l'eutanasia</td><td>, la dissezione, l'imaging assemblaggio della scala</td></tr> di imaging <tr><td>15 cm bastoncino applicatore in legno a punta liscia</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>per strumento ad anello per filo metallico</td></tr><tr><td>30 g (0,25 mm di diametro) filo di tungsteno</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>per strumento ad anello per occhielli a filo</td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>componente della soluzione madre di</td></tr><tr><td>integratore L-lattato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td>componente della soluzione madre di integratore</td></tr><tr><td>piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P2256</td><td>componente della soluzione madre di integratore</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>componente della soluzione madre di integratore</td></tr><tr><td>&nbsp; L-glutatione, ridotto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>componente della soluzione madre dell'integratore</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>componente della soluzione madre dell'integratore</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>componente della soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>componente della soluzione</td></tr> <tr><td>di RingerCaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>componente della soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td>componente della soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0250</td><td>componente della soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>componente della soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td>componente di Na+-free Soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-063</td><td>componente di Na+-free Soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>componente di Na+-free Soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica da 50 ml</td><td>Contenitore Denville</td><td>Scientific C1062-P</td><td>per la soluzione di Ringer</td></tr><tr><td>Forbici Vannas - 8 cm, lame angolate da 5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501790</td><td>micro-forbici per la dissezione delle conchiglie oculari</td></tr><tr><td>Pinzette svizzere - #5, 11 cm, dritte, punte da 0,06 X 0,07 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504510</td><td>pinze fini per la dissezione delle conchiglie oculari e la manipolazione delle fette</td></tr><tr><td>lame di rasoio a taglio singolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>per la dissezione e la rifilatura delle conchiglie oculari</td></tr><tr><td>Pinze filtranti EMD Pinza filtrante Millipore</td><td>Fisher Scientific Fisher Scientific</td><td>XX6200006P</td><td>pinze piatte per la manipolazione della carta da filtro bagnata</td></tr><tr><td>C12 558/568 BODIPY</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3835</td><td>colora i nuclei delle cellule vive; incubare 5 &micro; g/mL per 15 minuti a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>ioduro di propidio (PI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>colora i nuclei delle cellule morte; incubare 5 &micro; g/mL per 20 minuti a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td>colora i nuclei delle cellule vive; incubare 5 &; micro; g/mL per 20 minuti a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, estere metilico (TMRM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T668</td><td>colora i mitocondri funzionali caricati negativamente; incubare 1 nM per 30 minuti a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>camera di perfusione tissutale</td><td>Cell MicroControls</td><td>BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td> <td>camera di imaging per iniezione o perfusione</td></tr><tr><td>2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)ammino)-2-Deossiglucosio (NBDG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>N13195</td> analogo <td>fluorescente del glucosio somministrato per via orale al pesce zebra 30 minuti prima dell'eutanasia</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser Olympus</td> Microscopio confocale <td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>per la visualizzazione della fluorescenza di fette con risoluzione di una singola cellula</td></tr><tr><td>Cianuro di carbonile 3-clorofenilidrazone (CCCP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td>reagente sperimentale che abla la respirazione mitocondriale; trattare le fette a una concentrazione finale di 1 &micro; M</td></tr><tr><td>posizionatore aspiratore miniaturizzato</td><td>Cell MicroControls</td><td>FL-1</td><td>per perfusione</td></tr><tr><td>, collettore di perfusione, collettore gorgogliatore di gas, valvola di flusso, 60cc porta siringa</td><td>Warner Instruments</td><td>vari</td><td>per perfusione</td></tr></tbody></table>

preparazione fette fresche della retina dallo zebrafish adulto per ex vivo imaging esperimenti

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

La retina è un tessuto complesso che avvia e integra i primi passi della visione. Disfunzione delle cellule retiniche è un segno distintivo di molte malattie accecante, e terapie future cerniera su fondamentali comprensioni circa retinico come le diverse cellule di funzionano normalmente. L'acquisizione di tali informazioni con metodi biochimici ha dimostrato difficile perché i contributi di tipi delle cellule particolari sono diminuiti nell'ambiente delle cellule retiniche. Live imaging retinico può fornire una visualizzazione di numerosi processi biologici a livello subcellulare, grazie a un numero crescente di biosensori fluorescenti geneticamente codificati. Tuttavia, questa tecnica è stato finora limitata a girini e larve di zebrafish, gli strati retinici esterni di retine isolate o immagine in alta risoluzione inferiore delle retine in animali vivi. Qui presentiamo un metodo per la generazione diretta ex vivo retinica fette dallo zebrafish adulto per l'imaging dal vivo tramite microscopia confocale. Questa preparazione produce in sezioni trasversali con tutti gli strati della retina e la maggior parte dei tipi di cellule visibili per l'esecuzione di esperimenti di imaging confocale mediante perfusione. Zebrafish transgenici esprimenti le proteine fluorescenti o biosensori in tipi specifici delle cellule retiniche o organelli vengono utilizzate per estrarre informazioni di cella singola da una retina intatta. Inoltre, fette della retina possono essere caricati con indicatore fluorescente tinture, aggiungendo alla versatilità del metodo. Questo protocollo è stato sviluppato per l'imaging di Ca2 + all'interno di fotorecettori cono zebrafish, ma con gli indicatori di corretta potrebbe essere adattato per misurare Ca2 + o metaboliti Müller cells, cellule bipolari e orizzontali, microglia, cellule amacrine, o retinica cellule del ganglio. L'epitelio pigmentato retinico è rimosso dalle fette quindi questo metodo non è adatto per lo studio di tale tipo di cella. Con la pratica, è possibile generare fette di serie da un animale per esperimenti multipli. Questa tecnica adattabile fornisce un potente strumento per rispondere alle tante domande sulla biologia delle cellule retiniche, Ca2 +e l'omeostasi energetica.

Posizionamento stabile e orientamento trasversale delle fette sono la chiave a successo imaging con iniezione o aspersione di agenti farmacologici. Esaminare attentamente e riposizionare le fette prima di imaging confocale come necessario per garantire a tutti gli strati della retina sono visibili (Figura 2A, sezione ii). Se una fetta è ruotata leggermente in avanti (Figura 2A, sezione iii), fasci di segmenti esterni saranno visi...

Formazione immagine del tessuto retinico può fornire informazioni di cella singola che non possono essere raccolti dai metodi biochimici tradizionali. Questo protocollo descrive la preparazione delle fette della retina dallo zebrafish per imaging confocale. Fluorescenti geneticamente codificati sensori o indicatore coloranti permettono la visualizzazione di numerosi processi biologici in tipi distinti delle cellule retiniche.

Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare fette fresche di retina di pesce zebra per esperimenti che richiedono l'imaging dal vivo di proteine fluorescenti o biosensori. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulla vista, come i ruoli fisiologici e metabolici degli ioni calcio in specifici tipi di cellule e compartimenti cellulari all'interno di una retina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni spaziali e temporali sui metaboliti chiave e sulle molecole di segnalazione nei tessuti vivi.Per rendere possibile la rimozione dell'epitelio pigmentato retinico, o RPE, dal pesce zebra, adattare il pesce scuro per un'ora prima di fare fette di tessuto. Per una camera di affettatura, dipingere linee di smalto per unghie su un vetrino. Usando lo smalto trasparente, dipingi linee strette per creare un rettangolo.Ridipingere lo smalto una volta quando è asciutto. Se la camera verrà utilizzata per l'imaging statico o per esperimenti di iniezione con un flusso minimo di soluzione, utilizzare una siringa per applicare due strisce parallele di vaselina su un vetrino coprioggetti, lungo un centimetro e dist

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Questo articolo descrive un approccio alla microdissect retine zebrafish con e senza epitelio pigmentato retinico collegato, da una a tre embrioni postfertilization giorni.

Microdissezione dei tessuti oculari Zebrafish embrionali

In questo video, le tecniche per multicolor confocale time-lapse imaging e ablazione delle cellule bersaglio sono forniti. Time-lapse imaging è utilizzato per monitorare il comportamento dei diversi tipi di cellule di...

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Il video dimostra un metodo per coltivare cellule gangliari retiniche primarie da embrioni di pesce zebra. Gli embrioni in fase iniziale vengono sottoposti a dissezione per isolare gli occhi, che vengono successivamente dissociati meccanicamente in una sospensione di cellule gangliari retiniche. Questa sospensione cellulare viene coltivata su vetrini coprioggetti rivestiti con proteine adesive per facilitare lo sviluppo degli assoni.

Generazione di colture cellulari primarie di ganglio retinico da embrioni di zebrafish

Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l'imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Introduciamo un metodo efficiente per marcare retrogrademente le cellule gangliari retiniche (RGC) nel pesce zebra adulto.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l'intera retina.

A Novel Luce Danni Paradigma per l&#39;uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere risultati di localizzazione sottocellulare della proteina sulla retina di zebrafish correlando microscopia di Super-risoluzione e immagini di microscopia elettronica di scansione.

Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

Discutiamo qui, un protocollo di metodo che vi permetterà una facile analisi del vasculature retinico adulto tg(fli:EGFP) zebrafish come una lettura veloce nelle impostazioni delle patologie vascolari a lungo termine legate alla neoangiogenesi e cambiamenti strutturali.

Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish

Questo protocollo descrive l'uso di un perossido di idrogeno geneticamente codificato (H2O2)biosensore nei neuroni e nelle larve di zebrafish coltivati per valutare i ruoli fisiologici di segnalazione di H2O2 durante lo sviluppo del sistema nervoso. Può essere applicato a diversi tipi di cellule e modificato con trattamenti sperimentali per studiare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in generale sviluppo.

Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Impara a preparare fette fresche di retina di zebrafish per imaging ex vivo con biosensori fluorescenti. Questo metodo consente di studiare i ruoli fisiologici e metabolici degli ioni calcio nelle cellule retiniche in tempo reale.

Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti

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