Sequenziamento di nuova generazione e bioinformatica Pipeline per valutare fattori determinanti genetici della malattia costituzionale mirati

L'obiettivo generale del sequenziamento mirato di nuova generazione è quello di chiarire i determinanti genetici di varie malattie costituzionali concentrandosi sulle regioni genomiche di particolare interesse. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave riguardanti l'ideologia genetica di una malattia, in particolare quando ci sono associazioni genetiche precedentemente note. Questa tecnica è altamente efficiente.

Produce milioni di letture in un breve periodo di tempo, le otteniamo a un costo relativamente basso, c'è un carico computazionale relativamente basso, soprattutto se lo confrontiamo con altri approcci di sequenziamento di nuova generazione. Le implicazioni della tecnica si estendono alla diagnosi delle malattie neurodegenerative, che sono fenotipicamente e geneticamente eterogenee, ma hanno molti loci genetici associati noti. Sebbene questo metodo sia particolarmente diretto verso le malattie neurodegenerative, potrebbe essere applicato anche a varie altre malattie costituzionali con regioni genomiche di interesse precedentemente identificate.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'elaborazione bioinformatica richiesta per l'analisi finale delle varianti rare può essere computazionalmente intensiva e creare molte fonti di errore. In questa procedura, i campioni di sangue umano vengono raccolti in provette EDTA K2 da tre e quattro millilitri per fornire un volume totale di circa 12 millilitri. Centrifugare i campioni di sangue a 750 volte la gravità per 20 minuti.

Questo fraziona ogni campione in una fase superiore di plasma, una fase intermedia sottile di leucociti e una fase inferiore di eritrociti. Pipettare il plasma dalla parte superiore del campione di sangue utilizzando una pipetta di trasferimento monouso. Erogare in più aliquote da 500 microlitri e conservare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per future analisi biochimiche.

Estrarre il DNA dal campione di sangue con un kit di estrazione del sangue secondo le istruzioni del produttore. Il DNA estratto viene quindi utilizzato per preparare una libreria di sequenziamento per il sequenziamento di nuova generazione. Una volta completata l'esecuzione della sequenziazione, su un computer, trova i file all'interno dell'ambiente di elaborazione basato su cloud selezionando Esecuzioni nel pannello di navigazione.

Selezionare l'esecuzione di sequenziazione appropriata per passare alla pagina di riepilogo dell'esecuzione. Selezionare Scarica per ottenere i dati dal cloud. Dalla finestra di dialogo visualizzata, selezionare i file FASTQ come tipo di file da scaricare e fare clic su Scarica.

Dalla pagina Riepilogo esecuzione dell'ambiente di elaborazione basato su cloud, passare a Grafici per analizzare la qualità dell'esecuzione del sequenziamento con le varie cifre prodotte dall'ambiente di elaborazione. Nella pagina Esegui grafici, individuare la figura denominata Dati per ciclo, in Grafico selezionare Intensità e in Canale selezionare Tutti i canali per produrre il grafico dell'intensità del segnale. All'interno del pannello Esegui navigazione, selezionare la scheda Controllo qualità indicizzazione per trovare l'istogramma Controllo qualità indicizzazione, che si trova sul lato destro della pagina.

Dalla pagina Riepilogo esecuzione dell'ambiente di elaborazione basato su cloud, fare clic su Metriche nel pannello di navigazione Esegui per passare alle metriche di qualità. In Densità kelvin per millimetro quadrato, assicurarsi che la densità del cluster dell'esecuzione di sequenziamento rientri nell'intervallo raccomandato dal kit di arricchimento in uso. In questo caso, da 1.200 a 1.400 kelvin per millimetro quadrato.

In Percentuale totale maggiore o uguale a Q30, assicurarsi che il valore sia maggiore o uguale a 85% che rifletta la qualità delle letture di sequenziamento. In Allineato assicurarsi che il valore sia simile alla percentuale di controllo positivo inclusa nell'esecuzione della sequenziazione. Ad esempio, se è stato utilizzato un controllo positivo all'1%, la percentuale allineata prevista sarebbe di circa l'1-5% e sono accettabili variazioni entro pochi punti decimali.

Iniziare questo processo importando le letture di sequenziamento FASTQ nel software di elaborazione dati. Nell'area di navigazione, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Nuova cartella. Assegnare un nome alla cartella in modo che vi sia chiarezza sull'esecuzione della sequenza eseguita.

Dalla barra degli strumenti in alto, seleziona Importa e dall'elenco a discesa, scegli la piattaforma con cui è stata eseguita la sequenziazione. Ai fini di ONDRISeq, viene scelto l'allumina. Nella finestra di dialogo, individuare e selezionare i file FASTQ dall'esecuzione di sequenziazione in fase di elaborazione.

Dalle opzioni Generali della finestra di dialogo, fare clic sulla casella accanto a Letture accoppiate se il sequenziamento ha utilizzato sostanze chimiche accoppiate. Dalle Informazioni di lettura accoppiate della finestra di dialogo, selezionare Paired-end se il file FASTQ di lettura diretta viene visualizzato prima della lettura inversa nell'elenco dei file. Impostare la distanza minima di lettura accoppiata su uno e la distanza massima su 1000.

Dalle opzioni Ilumina della finestra di dialogo, selezionare Rimuovi letture non riuscite. Dall'elenco a discesa Punteggio di qualità, selezionare la pipeline NGS utilizzata per il sequenziamento. Selezionare Avanti nella parte inferiore della finestra di dialogo.

Selezionare Salva e Crea sottocartelle per unità batch. Selezionare Avanti nella parte inferiore della finestra di dialogo. Scegli la cartella creata in precedenza.

Qui è dove verranno importati i file FASTQ. Selezionare Fine nella parte inferiore della finestra di dialogo e attendere che i file FASTQ vengano importati. Fare clic sulla scheda Processi per visualizzare lo stato dell'importazione del file.

Successivamente, progetta un flusso di lavoro all'interno del software per eseguire la risequenziazione e la chiamata delle varianti secondo le istruzioni del produttore. La progettazione del flusso di lavoro di risequenziazione e chiamata delle varianti è l'aspetto più difficile di questa procedura. Il nostro team ha ricercato le migliori pratiche e ha utilizzato tentativi ed errori per creare il flusso di lavoro più robusto per soddisfare le nostre esigenze.

Per eseguire i file di lettura del sequenziamento FASTQ importati attraverso il flusso di lavoro bioinformatico personalizzato, iniziare identificando il flusso di lavoro nella cassetta degli attrezzi del software e facendo doppio clic su di esso. Nella finestra di dialogo visualizzata, individuare le cartelle dei file FASTQ importati nell'area di navigazione. Evidenzia tutte le cartelle selezionandole all'interno dell'area di navigazione, quindi fai clic sulla casella accanto a Batch.

Utilizzare la freccia rivolta a destra per spostare i file negli elementi selezionati. Fare clic su Avanti nella parte inferiore della finestra di dialogo. Nella finestra di dialogo, esaminare la panoramica del batch per assicurarsi che siano stati selezionati i file FASTQ corretti, quindi fare clic su Avanti.

Esaminare i passaggi del flusso di lavoro all'interno della finestra di dialogo per assicurarsi che siano stati selezionati i file e le posizioni di esportazione corretti durante la progettazione del flusso di lavoro. Questi passaggi includono il mapping delle letture alla sequenza di riferimento, la rimozione delle letture mappate duplicate, la creazione di statistiche per le aree di destinazione, l'esportazione di file BAM, l'esportazione di testo delimitato da tabulazioni, il filtro in base alla sovrapposizione e l'esportazione di file VCF. Nel passaggio finale della finestra di dialogo, Gestione dei risultati, selezionare l'opzione Salva nella cartella di input.

Fare clic su Fine nella parte inferiore della finestra di dialogo. Il passaggio finale consiste nell'eseguire l'annotazione delle varianti sul file VCF di ciascun campione, come descritto nel protocollo di testo. Le metodologie dimostrate in questo video sono state applicate a 528 campioni di DNA di partecipanti provenienti da individui che sono stati arruolati in ONDRI.

I campioni sono stati eseguiti sul pannello ONDRISeq in 22 esecuzioni di 24 campioni per corsa. Nel complesso, i dati di sequenziamento sono stati determinati come di alta qualità con una copertura media del campione di 78 volte. In media, il 95,6% delle letture è stato abbinato alla sequenza di riferimento e tutte le esecuzioni di ONDRISeq hanno avuto più del 90% delle letture mappate.

Delle letture mappate, il 92,0% e un punteggio Phred maggiore o uguale a Q30. Per dimostrare l'utilità di questo flusso di lavoro NGS mirato, viene presentato l'esempio di un uomo di 68 anni, con malattia di Parkinson, che mostra una riduzione dell'N in eccesso. Le varianze annotate sono curate per identificare quelle che hanno maggiori probabilità di essere di rilevanza clinica, come indicato dalle caselle rosse.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di adattare adeguatamente i passaggi alla piattaforma di sequenziamento, al kit di arricchimento utilizzato e alle esigenze della ricerca. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genetica per ottenere dati di alta qualità specifici per regione, pur rimanendo meno costosa delle sue controparti dell'intero esoma e dell'intero genoma.