Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9
10 aprile 2018
Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di ottenere una distruzione genica rapida ed efficiente attraverso CRISPR/Cas9 e le cellule progenitrici ematopoietiche primarie utilizzando un approccio ribonucleoproteico. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dell'emopoiesi normale e maligna, come ad esempio quali sono le conseguenze molecolari e fenotipiche della perdita del gene X. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è estremamente facile, veloce ed economica. Il tempo stimato necessario dall'ideazione dell'esperimento all'esecuzione è inferiore a una settimana.
Sebbene questo metodo sia stato ottimizzato per le cellule progenitrici ematopoietiche, può essere applicato ad altri tipi di cellule, come le cellule T primarie, le linee cellulari ematopoietiche umane e di topo e i campioni di leucemia primaria. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto di come altri approcci di somministrazione CRISPR/Cas9, inclusi plasmidi e virus, fossero tossici per le nostre cellule o avessero tempi di consegna lenti. Per progettare RNA a guida singola di interesse, è necessario accedere al sito Web CRISPRscan.
In base alla cella di interesse, premere il pulsante del mouse o dell'umano, quindi immettere il gene di interesse nella casella di ricerca UCSC e fare clic su Vai. Quindi, ingrandisci l'esone che desideri prendere di mira. Controlla se ci sono sequenze bersaglio di RNA a guida singola elencate sotto l'intestazione CRISPRscan predictions on Genes.
Quindi, fai clic su un RNA a guida singola target etichettato come un rettangolo verde e copia la sequenza completa visualizzata sotto la sequenza Oligo. Quindi incolla la sequenza in un documento di testo. Successivamente, aggiungi i nucleotidi ATAGC alle tre estremità prime della sequenza.
Effettua l'ordine per l'intera sequenza di lunghezza. Ora, per sintetizzare il modello di DNA per l'RNA a guida singola, sciogliere e quindi diluire l'RNA a guida singola in avanti e i primer inversi universali. Quindi aggiungere tutti i reagenti in una provetta per PCR per eseguire la PCR sovrapposta.
Dopo aver costituito la reazione PCR, posizionare la provetta in un termociclatore ed eseguire il programma. Una volta terminato il programma, purificare il prodotto PCR utilizzando colonne di purificazione del DNA. Diluire il DNA in 11,5 microlitri di tampone di eluizione.
Quindi, utilizzare il tampone di eluizione come bianco sullo spettrofotometro. Misurare la concentrazione del DNA del campione sullo spettrofotometro. Innanzitutto, mescolare il DNA eluito, i deossinucleotidi fosfati, il tampone di reazione e la miscela di enzimi RNA polimerasi T7 nelle provette della striscia PCR.
Quindi incubare il campione a 37 gradi Celsius per quattro ore. Quindi, applicare il detergente RNasi per rimuovere la RNasi dai guanti in uso. Quindi, regolare il volume di ciascun campione di RNA a 50 microlitri con acqua priva di nucleasi.
Purificare l'RNA seguendo le istruzioni del produttore. Infine, eluire l'RNA in 50 microlitri di acqua priva di nucleasi. Per prima cosa, utilizzare l'acqua priva di nucleasi per cancellare lo spettrofotometro e quindi misurare la concentrazione dell'RNA eluito.
Utilizzare l'esclusione del blu di tripano per contare il numero di celle. Per ogni replica, raccogliere 200.000 cellule vitali per replica, quindi aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato per lavare le cellule. Quindi centrifugare il tubo a 300 volte g per sette minuti.
Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante. Durante il corso della centrifugazione, incubare 1,5 microgrammi di Cas9 con un microgrammo di RNA monoguida totale in provetta PCR per 20-30 minuti. Questo serve a preparare i complessi RNP Cas9-sgRNA per ogni replica.
Dopo aver calcolato il volume del tampone di risospensione T richiesto, sciogliere il pellet cellulare ottenuto nel tampone di risospensione T.Quindi aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare disciolta nella provetta PCR con i complessi RNP Cas9-sgRNA. Quindi, accendere l'unità di elettroporazione. Far scorrere la cuvetta nel supporto della cuvetta.
Quindi aggiungere tre millilitri di tampone E.Impostare le condizioni sul dispositivo di elettroporazione. Per eseguire l'elettroporazione, tenere prima la pipetta per elettroporazione, quindi estendere l'artiglio e afferrare il disco all'interno del puntale della pipetta, quindi premere con decisione la pipetta verso il basso per fissare il puntale. Quindi, mescolare il campione pipettandolo su e giù 10 volte.
Aspirare 10 microlitri di campione e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria. Quindi, inserire la punta direttamente nel tampone elettrolitico nella cuvetta di elettroporazione. Quindi premi Start sullo schermo.
Lascia che il messaggio completo appaia sullo schermo. Quindi rimuovere la pipetta dalla cuvetta. Quindi, erogare il contenuto dalla cuvetta nel pozzetto riempito con il nuovo terreno di coltura HSPC.
Per studiare l'efficacia dell'elettroporazione dell'RNP Cas9-sgRNA, le HSPC isolate dai topi vengono elettroporate con RNasi a guida singola che ha come bersaglio GFP o tdTomato. Queste HSPC esprimevano ubiquitariamente GFP o tdTomato. L'analisi citofluorimetrica mostra circa il 75 e il 74% di perdita di espressione di GFP o tdTomato nelle HSPC a livello proteico.
Quindi, il test basato sull'endonucleasi T7 viene eseguito con DNA amplificato PCR dal locus GFP delle cellule elettroporate. Questo per quantificare l'efficienza di distruzione genica della GFP. Il software ImageJ viene utilizzato per calcolare il rapporto tra le intensità delle bande scisse e quelle non scisse per calcolare la percentuale di scissione.
L'efficienza di tre diversi RNA a guida singola che hanno come bersaglio il CD45 umano è stata testata nella linea cellulare HL-60 AML. La citometria a flusso mostra che l'RNA1 a guida singola è il più efficiente, con un'efficienza di knockout del 98% rispetto al controllo. Quindi, il knockout per CD45 viene eseguito anche nelle HSPC CD34 positive al sangue cordonale umano primario utilizzando RNA1 a guida singola.
L'analisi della citometria a flusso mostra quasi l'80% delle cellule con perdita di CD45 senza alterazione dell'espressione di CD34 rispetto al solo Cas9. Al fine di studiare l'attecchimento di HSPC knockout per CD45 umani, le cellule del midollo osseo e della milza vengono raccolte da topi NSG trasfettati retro-orbitalmente CD34 positivi per l'analisi, mostrando cellule modificate come HLA-ABC positive e CD45 negative. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in tre giorni, se eseguito corretto.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutte le superfici e i reagenti privi di RNasi, verificare l'efficiente disgregazione genica con più tecniche e utilizzare i controlli sperimentali appropriati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare, sintetizzare e trasfettare le ribonucleoproteine Cas9-sgRNA in cellule progenitrici ematopoietiche per ottenere una distruzione genica rapida ed efficiente.
Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per l'interruzione genica rapida mediata da CRISPR/Cas9 in cellule ematopoietiche primarie di topo e umane, utilizzando un approccio basato su ribonucleoproteine. Il metodo consente elevate efficienze di editing con tempi e costi minimi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Modifica genetica
- Biologia delle cellule ematopoietiche
- Tecnologia CRISPR/Cas9
Sfondo
- CRISPR/Cas9 è uno strumento potente per l'interruzione genica.
- Le cellule ematopoietiche primarie sono fondamentali per lo studio dell'ematopoiesi.
- I metodi tradizionali di somministrazione del CRISPR possono essere tossici o lenti.
- Questo protocollo mira a migliorare l'efficienza e ridurre i costi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido ed efficiente per l'interruzione genica.
- Studiare gli effetti della perdita genica in cellule progenitrici ematopoietiche.
- Fornire un protocollo applicabile a diversi tipi cellulari.
Metodi Utilizzati
- Progettazione di RNA guida singoli utilizzando CRISPRscan.
- Sintesi di RNA e preparazione di complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA.
- Elettroporazione di cellule ematopoietiche primarie con i complessi RNP.
- Valutazione dell'efficienza di interruzione genica mediante citometria a flusso e saggi con endonucleasi T7.
Risultati principali
- Riduzione approssimativa del 75% dell'espressione del gene bersaglio nelle cellule progenitrici ematopoietiche (HSPCs).
- Efficacia del knock-out dimostrata al 98% nella linea cellulare HL-60 di leucemia mieloide acuta (AML).
- Interruzione genica efficace dimostrata in cellule primarie di sangue del cordone umano.
- Confermato l'attecchimento delle cellule modificate nei topi NSG.
Conclusioni
- Il protocollo è efficiente e può essere completato in meno di una settimana.
- È applicabile a vari tipi di cellule ematopoietiche.
- Mantenere condizioni libere da RNasi è fondamentale per il successo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'interruzione efficiente dei geni nelle cellule ematopoietiche primarie consente una rapida validazione degli obiettivi e una riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci ematologici. L'approccio CRISPR/Cas9 basato sul ribonucleoproteina riduce l'incertezza biologica garantendo alte efficienze di knockout senza l'uso di DNA esogeno, offrendo maggiore affidabilità predittiva nella selezione precoce dei bersagli. Questo flusso di lavoro accelera i tempi di scoperta nei programmi di oncologia e immunologia fornendo un metodo scalabile ed economico per la genomica funzionale in sistemi ematopoietici rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'inattivazione rapida di geni in cellule progenitrici ematopoietiche primarie murine e umane.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico raggiungendo un'efficienza di inattivazione fino al 98% in linee cellulari di LMA e fino all'80% in cellule HSPC primarie umane provenienti da sangue del cordone ombelicale.
- Valore strategico: Favorisce la conferma dell'obiettivo e la selezione del portafoglio consentendo una valutazione rapida dei fenotipi associati alla perdita genica in sistemi pertinenti alla malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara cellule ematopoietiche knockout validate per lo screening di composti e saggi fenotipici successivi.
- Valore operativo: Fornisce un'interruzione genica standardizzata e riproducibile mediante elettroporazione di complessi RNP, con letture quantitative tramite citometria a flusso e saggio dell'endonucleasi T7.
- Valore strategico: Consente un utilizzo scalabile della piattaforma su cellule primarie, linee cellulari e campioni primari di leucemia, per una validazione coerente dei bersagli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra l'attecchimento di CSE umane modificate in topi NSG, sostenendo la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro semplificato di tre giorni, compatibile con le tempistiche precliniche per studi di validazione del bersaglio.
- Valore strategico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei bersagli ematopoietici, consentendo decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio nei percorsi di oncologia e immunologia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto iniziale, consentendo una rapida validazione funzionale di bersagli ematopoietici prima dello screening dei composti.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l’interruzione genica efficiente in cellule ematopoietiche primarie.
- Screening: Fornisce modelli di knock-out pronti per saggi con alta riproducibilità e output quantitativi per una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Genera misurazioni dell’efficienza di editing mediante citometria a flusso e saggi con endonucleasi T7, consentendo l’analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca Translazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica attraverso l’engraftment dimostrato di HSPC modificate in vivo.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di RNP CRISPR/Cas9 applicabile a diversi modelli ematopoietici, riducendo lo sviluppo ridondante di protocolli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica e interruzione genica ad alta fedeltà senza integrazione del DNA.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della modifica genica in cellule ematopoietiche primarie e trasformate.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi farmacologici ematologici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su dati rapidi e ad alta efficienza di knockout dell'obiettivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in clonaggio molecolare, manipolazione dell'RNA e tecniche di elettroporazione.
- È subordinato all'accesso a termociclatore, spettrofotometro, unità per elettroporazione e citometria a flusso per la validazione.
- Necessita di ambienti privi di RNasi e di una manipolazione standardizzata dei reagenti per garantire la stabilità del complesso RNP e l'efficienza della modifica genica.
- Richiede l'adattamento della progettazione dell'RNA guida e l'ottimizzazione per diversi modelli ematopoietici e geni bersaglio.
- Limite pratico: l'efficienza può variare in base al tipo cellulare e al locus bersaglio, richiedendo una validazione empirica per ogni gene di interesse.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
sgRNA Fwd Primer Design, DNA Template Synthesis, and ln Vitro Transcription of sgRNA
3:38
Cas9-sgRNA Complexing and Electroporation
5:45
Results: Use of Cas9-sgRNA Electroporation Protocol to Study Efficient Knockout of Target Gene
7:48
Conclusion
