Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

Ciao, mi chiamo Alice Chen. Sono un postdoc nel laboratorio di fusione e oggi vi mostrerò come deriviamo le cellule staminali embrionali da embrioni umani. Riceviamo embrioni in tutte le diverse fasi di sviluppo e li coltiviamo in vitro fino a quando non raggiungono il corretto stadio di blasti espansi.

Questi sono esempi di come l'embrione si sviluppa dal primo, lo stadio di una cellula fino all'inizio dell'esplosione assistita, e poi l'esplosione espansa da cui deriviamo le cellule staminali embrionali umane. Gli embrioni di alta qualità scelti per la derivazione vengono poi trasferiti attraverso tre gocce di strade ACE dove lo lascerai e osserverai la dissoluzione della Z di lucita. Il processo di neurochirurgia è un processo non specifico in cui l'anticorpo anti-umano del coniglio si legherà allo strato esterno delle cellule.

In questo caso, è la tripletta dermica. Dopo l'applicazione del complemento di siero di cavia, tutte queste cellule con anticorpi attaccati verranno lisate. Per iniziare, vogliamo preparare tre piatti.

La prima piastra è per ACE tyros, che usiamo per rimuovere la zita. La seconda e la terza piastra sono per la chirurgia immunologica. Per prima cosa inizierò generando la piastra dove posizioneremo le gocce di acido tyros e la derivazione delle cellule staminali embrionali umane.

I media calano. Prepara tre gocce di acido tiros sul lato sinistro della piastra e sul lato destro della piastra preparerai tre gocce di terreno di coltura ES umano. La seconda piastra è costituita dall'anticorpo primario, che è un batterio rosso di coniglio anti-umano.

Anche in questo caso, il lato sinistro della piastra sarà dedicato all'anticorpo primario, tre gocce per embrione, e il lato destro della piastra sarà dedicato alla coltura di ES umana. Il terreno rilascia, di nuovo, tre gocce per embrione per la piastra di complemento. Anche in questo caso, posizioneremo tre gocce di complemento sul lato sinistro della piastra e poi tre gocce di terreno di coltura ES umano sul lato destro della piastra.

Anche in questo caso, ogni fila è dedicata a un embrione. Tutte e tre le piastre sono ricoperte di olio minerale per evitare l'evaporazione e poste nell'incubatore per l'equilibratura. Si tratta di un cannocchiale di dissezione all'interno di un prodotto di prelievo in cui c'è un flusso laminare, proprio come per una coltura di tessuti, ed è qui che eseguiamo la maggior parte della nostra manipolazione ana.

La prima cosa che vuoi preparare prima di iniziare con i tuoi embrioni sono le pipette orali. Questo è il tubo standard per pipette per bocca, tranne per il fatto che abbiamo inserito un filtro da 0,2 micron tra la bocca e il punto in cui andrebbe la pipetta. E questo solo per garantire la sterilità.

Lasciate che vi dimostri come estrarre le pipette per la bocca. Mi piace tirare una varietà di dimensioni. È possibile ottenere tutti questi da VWR e a me piace tirare diametri da 10 microlitri, 50 microlitri e 100 microlitri.

Ora sto usando un perno diamantato per tagliare il tubo di montaggio. Per questo primo passo, vuoi un diametro piuttosto grande perché stai maneggiando l'intero embrione. Gli embrioni di alta qualità scelti per la Derivazione vengono poi trasferiti attraverso tre gocce.

Strade Ofci che transitano dalla prima goccia alla seconda goccia alla terza goccia dove la lascerai e guarderai per la dissoluzione della zap palita. Questo processo richiede di solito meno di 30 secondi e puoi effettivamente vedere la zop palita dissolversi. Quando la palita si è completamente sciolta.

Gli embrioni sono stati poi trasferiti attraverso le tre gocce di lavaggio dei terreni di coltura Es umana che transitano attraverso la prima, la seconda e la terza goccia di lavaggio. Quindi l'embrione viene trasferito nell'anticorpo primario, scende di nuovo, transitando dalla prima goccia alla seconda goccia alla terza goccia dove lo lascerai per mezz'ora di incubazione nella lisi dell'incubatore di coltura tissutale della tripletta, il derma diventa evidente quando vedi il gorgogliare delle cellule all'esterno dell'embrione. Questo è l'inizio della tripletta delle cellule dermiche che iniziano a mentire.

Quando la lisi è evidente in tutto il bordo esterno dell'embrione, allora l'embrione è pronto per essere lavato attraverso le tre gocce di terreno di coltura humanus. Dopo l'intervento di immunosologia, gli embrioni vengono triturati meccanicamente utilizzando una pipetta orale più piccola. Questa pipetta per la bocca deve avere un diametro inferiore rispetto alla prima pipetta, in modo da poter rendere il processo di sterilizzazione più efficiente per la rasatura della tripletta di lis.

Cellule dermiche. Alla fine dell'azione meccanica, ti rimane un gruppo di cellule al centro. C'è la massa cellulare interna, che è intatta.

Intorno a questo, c'è, ci sono molte cellule dermiche di lys trifecta, così come alcune cellule dermiche di trifecta intatte. Questo isolato di massa cellulare interna viene quindi posto in un pozzetto che è stato preparato con cellule di strato di alimentazione di embrioni di topo. La piastra di cellule dello strato di alimentazione è stata preparata la sera prima, e questa mattina ho cambiato il terreno da terreno di fibroblasti embrionali di topo a terreno di derivazione umana dell'es.

L'isolato di massa cellulare interna viene quindi trasferito dalle gocce di lavaggio dopo il complemento in questo pozzetto contenente le cellule dello strato di alimentazione. Questo piatto viene quindi rimesso nell'incubatore e lasciato intatto per un paio di giorni per consentire l'adesione della massa cellulare interna isolata. Questo è un esempio di come si sviluppa la crescita.

Quando la crescita diventa abbastanza grande. Quindi possiamo iniziare il primo passaggio dividendo questa escrescenza a metà. Ora, sono passati 14 giorni dalla derivazione originale, ed ecco un esempio di una conseguenza di una delle nostre derivazioni.

Questo è un esempio di una di queste escrescenze in cui oggi sto per eliminare metà delle escrescenze. Questa escrescenza verrà divisa a metà e poi tagliata in pezzi quadrati, e ognuno di questi pezzi verrà trasferito in un nuovo pozzetto contenente celle di alimentazione. È una buona idea lasciare intatta metà della crescita in modo da avere una fonte continua di cellule a cui tornare per amplificare le cellule e sostenere tutti i passaggi che si eseguono.

Per i primi due o tre passaggi. È una buona idea passare meccanicamente in questo modo ed eventualmente adattare le cellule alla dissociazione enzimatica per un imballaggio più efficiente. Il nostro laboratorio Deriva costantemente linee di cellule staminali embrionali umane per l'uso e la comprensione dello sviluppo e della differenziazione.

Queste linee sono distribuite anche in tutto il mondo ai ricercatori di cellule staminali. Penso che ci siano quattro fattori principali che influenzano il successo della derivazione. Il primo ha a che fare con la qualità dell'embrione, che dipende anche dal background genetico, dalla qualità con cui gli embrioni sono stati congelati e scongelati, e anche dalla qualità della coltura in vitro fino alla fase di derivazione all'assistenza alla sabbia.

Il secondo fattore è probabilmente l'integrità qualitativa della massa cellulare interna dopo l'isolamento, e questo può dipendere dalla tecnica utilizzata per isolare la massa cellulare interna e può anche dipendere dall'esperienza e dall'abilità. Il terzo fattore è la capacità della massa cellulare interna isolata di attaccarsi agli strati di alimentazione e il quarto fattore è la crescita di questo isolato ICM. Non credo che sia tecnicamente un processo difficile.

Ci vuole solo un po' di pratica. In effetti, ogni passaggio è abbastanza semplice, quindi finché riesci a seguire il protocollo con un po' di pratica, penso che chiunque possa farlo. Quello che abbiamo scoperto in laboratorio è che ogni linea è un po' diversa per ragioni che non siamo del tutto sicuri di capire.

Ad esempio, se dovessi testare il potenziale di differenziazione di 10 linee, forse due o tre di quelle linee potrebbero avere maggiori probabilità di svilupparsi nel tipo di cellula che ti interessa. Sospetto che queste differenze abbiano a che fare con lo stadio in cui si trovavano le cellule, le linee di cellule staminali embrionali sono derivate dallo stadio dell'embrione, così come nella manipolazione manuale di queste cellule. Penso che la loro proprietà a volte cambi l'eterogeneità delle linee cellulari e il loro potenziale è qualcosa che ogni ricercatore di cellule staminali deve tenere a mente.

Ancora una volta, non so cosa causi questo, ma certamente come esempio per la mia ricerca, il nostro obiettivo finale è quello di produrre insulina per produrre cellule beta del pancreas. Il primo passo verso la creazione di questo tipo di linea cellulare è quello di generare endoderma da cellule staminali embrionali, e in un confronto tra 10 e 20 linee, quello che abbiamo scoperto è che una o due di queste linee possono generare endoderma in modo efficiente, mentre la metà di esse forse può generare endoderma in modo meno efficiente, e alcune di esse non possono generare endoderma molto bene. Quindi, attraverso questo processo di screening iniziale, selezioniamo le cellule che hanno una maggiore tendenza a formare il tipo di cellula di interesse e perseguiamo la differenziazione rimanente utilizzando questi tipi di cellule.

La prima derivazione di cellule staminali embrionali umane è stata riportata da Thompson Etal nel 1998 e nel 2004 il nostro laboratorio ha riportato la derivazione di 17 nuove linee di cellule staminali embrionali umane. Modificando questi protocolli pubblicati, queste modifiche erano in realtà solo per rendere il processo di derivazione più snello. Consistono in cambiamenti nella composizione dei media, nel modo in cui le cellule vengono fatte passare e nel modo in cui vengono congelate e scongelate.

Da allora, in ogni derivazione, cerchiamo nuovi modi per migliorare il protocollo e il tasso di derivazione. Ad esempio, il nostro laboratorio sta esplorando modi alternativi per isolare la matematica della cellula interna, non utilizzando reagenti xeno come l'anticorpo del coniglio o il complemento sierologico del porcellino d'India, ma sezionando più meccanicamente la massa cellulare interna. Si spera che questi metodi portino almeno a un modo comparabile, se non migliore, di isolare la massa cellulare interna.