Name: Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Impara la derivazione di cellule staminali embrionali umane mediante immunochirurgia per isolare la massa cellulare interna. Questo protocollo dimostra tecniche di coltura su strato alimentatore per la ricerca in biologia dello sviluppo.

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AEC è un collega della bara Jane Childs Memorial Fund per la ricerca medica e Merck Research Laboratories. Ringraziamo D. Egli e C. Cowan per la consulenza sperimentali e discussione.

<html> Congelati embrioni umani usati per staminali embrionali umane (HES) derivazione delle cellule sono stati donati per la ricerca seguenti corretto consenso informato in protocolli di ricerca che sono stati esaminati e approvati sia dal comitato per l&#39;uso di soggetti umani e sulle cellule staminali embrionali comitato di sorveglianza di ricerca presso la Harvard University . Protocollo scritto che segue si basa su parametri pubblicato riportato da Cowan et al. 2004, con lievi modifiche. Embrione Cultura Scongelare gli embrioni umani utilizzando Scongelare Quinn Advantage Kit e la cultura in gocce di medio globale integrata con il 15% Plasmanate fino allo sviluppo allo stadio di blastocisti espansa. Immunosurgery basata isolamento della massa cellulare interna Preparazione: <ol><li> Preparare le piastre per la rimozione della zona pellucida e immunosurgery (vedi sotto) attraverso la creazione di gocce di ogni soluzione in lastre di 10 cm. Sovrapposizione con olio minerale per prevenire l&#39;evaporazione. Preparare una singola riga per ogni embrione destinato derivazione. <ul><li> EmbryoMax Tyrodes acida, l&#39;uso è come. </li><li> hES derivazione delle cellule dei media: il 75% KO-DMEM, 10% KO-siero di ricambio, il 10% Plasmanate, il 2,5% delle cellule ES-testato siero fetale bovino (FBS), 2mM Glutamax-I, 1% di aminoacidi non essenziali, 50 unità / ml di penicillina, streptomicina 50μg/ml, 0.055mM b-mercaptoetanolo, 5ng/ml bFGF. </li><li> Coniglio anti-umano globuli rossi anticorpo primario, ricostituito secondo il suggerimento del produttore, diluito 1:10 con mezzi di derivazione delle cellule HES. </li><li> Cavia siero complemento, ricostituito secondo il suggerimento del produttore, diluito 1:10 con mezzi di derivazione delle cellule HES. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="574_Figure-01" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> Equilibrare tutte le piastre a 37 ° C in incubatore cultura del tessuto prima dell&#39;uso. </li><li> Tirare pipette capillari 50μl-100μl (VWR) per l&#39;utilizzo in embrioni trasferire. Tagliate le estremità con la penna di diamante e l&#39;uso con tubi in bocca pipetta dotato di filtro 0.2μm. </li></ol> Immunosurgery procedura: Note: <ul><li> In questa procedura, le cellule del trophectoderm sono distrutti da una breve esposizione di anticorpi diretti contro le cellule umane in tandem con l&#39;attività del complemento. Pertanto, il protocollo funziona meglio con alta qualità degli embrioni con un trophectoderm intatto, in quanto solo l&#39;integrità strutturale della blastocisti impedisce l&#39;ICM anche da essere suscettibile alla reazione immunologica. </li><li> Tutte le procedure eseguite utilizzando una portata dissezione dotato di palco riscaldato. </li></ul> Passi: <ol><li> Sciacquare la bocca pipetta da utilizzare per il trasferimento degli embrioni con FBS per evitare che si attacchino gli embrioni. </li><li> Trasferimento di blastocisti piatto da cultura a goccia hES detenzione di AT piatto. </li><li> Iniziare procedura di trasferimento di blastocisti da goccia hES attraverso serie di AT gocce. In calo in terzo luogo, guardare per lo scioglimento della zona pellucida (secondi di solito 5-30). Fare attenzione a non sovra-trattamento o l&#39;integrità dell&#39;embrione può essere compromessa. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure-02" width="551" height="273" /> </li><li> Blastocisti di trasferimento attraverso serie di mezzi di derivazione delle cellule hES scende a risciacquare AT. Pipetta precarico con i media si raccomanda di neutralizzare immediatamente a reazione. Blastocisti può essere ritenuto qui fino a quando tutti sono stati AT-trattati. </li><li> Trasferimento di blastocisti attraverso serie di gocce anticorpo primario, lasciando in terza goccia per 30 minuti di incubazione a 37 ° C in un tessuto culturale incubatore. </li><li> Blastocisti di trasferimento attraverso serie di mezzi di derivazione delle cellule hES scende a risciacquare primaria. </li><li> Trasferimento di blastocisti attraverso serie di gocce di complemento, lasciando in terza goccia a guardare per la lisi dei globuli trophectoderm. Osservare blastocisti per i primi 30 secondi sul palco di &quot;bolle&quot; di cellule trophectoderm come lisare. Se si osserva la lisi entro questo lasso di tempo, tenere piatto sul palco microscopio per monitorare la reazione fino al completamento. Se non bolle si osserva durante i primi 30 secondi, tornare a incubatore, controllando ogni 5 minuti fino a quando la maggior parte delle trophectoderm ha lisate. Questa operazione può durare 5-15 minuti. Monitorare attentamente la reazione di ridurre al minimo i tempi di reazione e potenziali danni alla massa cellulare interna. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure-03" width="571" height="273" /> </li><li> Blastocisti di trasferimento attraverso serie di mezzi di derivazione delle cellule hES scende a lavare via l&#39;attività del complemento. </li><li> Utilizzando una pipetta di vetro con un diametro che è leggermente più piccola della blastocisti (tirato da 10μl VWR tubi capillari), disegnare la blastocisti su e giù per spogliare la maggior parte dei trophectoderm lisate. g &quot;alt =&quot; 574_Figure-0 &quot;width =&quot; &quot;height =&quot; 577 270 &quot;/&gt; </li><li> Piastra ICM isolare su cellule feeder di fibroblasti di topo mitoticamente inattivato embrione (MEF). MEF deve essere preparato il giorno prima derivazione e passati a cellule di derivazione hES mezzi giornata di. 4-anche i piatti NUNC funzionare bene per i primi passi di derivazione. </li><li> Non disturbare piastra per i primi 1-2 giorni. Successivamente, controllare ogni giorno per conseguenza di colonie di cellule staminali embrionali (in genere evidente entro 1-2 settimane). Media dovrebbe essere cambiato in volumi di un mezzo ogni inizio altro giorno in giorno 3. </li></ol> ES escrescenza cellulare e passaging Quando la cellula escrescenza hES ha raggiunto circa 0,5 millimetri o più, è pronto per l&#39;espansione di raccolta meccanica. <ol><li> Meccanicamente disperdere la metà dei escrescenza e trasferimento in nuovi piatti contenenti alimentatori fresca. Ammassi di cellule staminali embrionali dovrebbe essere circa 30-50 cellule ciascuno. Lascia altra metà della crescita degli come back-up per il primo passaggio (p1). L&#39;escrescenza (p0) possono essere selezionati da diverse volte in quanto continua ad espandersi. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li> Colonie secondarie possono essere allo stesso modo disperso e ampliata attraverso i piatti della cultura più grande fino passaggi 3-5, momento in cui le nuove linee cellulari possono essere adattati alle passaging enzimatica con tripsina. Il contenuto siero dei media cultura dovrebbe essere gradualmente ridotta a 1% e 0% nel corso di questi passaggi iniziali per minimizzare la differenziazione delle cellule ES. </li><li> Tutti stabilito linee di cellule staminali embrionali dovrebbe essere incassato da congelamento giù una parte di passaggi presto per future espansioni. </li><li> Inoltre, ogni linea cellulare dovrebbe essere caratterizzata da analisi del cariotipo e validato da studi pluripotenza e la differenziazione in vitro e in vivo. </li></ol>

<ol><li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+ENGL+J+MED%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Il protocollo qui presentato fornisce ai ricercatori un conciso, facile da seguire schema di come derivare embrionali umane linee di cellule staminali da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.

<table><tbody><tr><td>Kit di scongelamento Quinn&amp;rsquo;s Advantage</td><td>Sage</td><td>ART-8016</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo globale</td><td>Life Global</td><td>GMGB-050</td><td></td></tr><tr><td>Plasmanate</td><td>Talecris</td><td>61325</td><td></td></tr><tr><td>Tiròde acido EmbryoMax</td><td>Chemicon International</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Sostituto del siero KO</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino testato per cellule ES, definito</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita fibroblastico basico umano ricombinante</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primario anti-globuli rossi umani da coniglio</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>109-4139</td><td></td></tr><tr><td>Siero complemento da criceto di Guinea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1639</td><td></td></tr><tr><td>Pipette capillari da 10 µL, 50 µL, 100 µL</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette orali con tubo flessibile</td><td>VWR international</td><td></td><td>fornite con pipette capillari da VWR</td></tr><tr><td>Filtro per siringa Acrodisc da 0,2 µm</td><td>Pall Corporation</td><td>PN4192</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,5%</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico Nikon SMZ1500 equipaggiato con piatto riscaldante Nikon Tokai Hit ThermoPlate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti embrionali di topo (E12,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

derivazione di cellule staminali embrionali umane da immunosurgery

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

La capacità di cellule staminali embrionali umane per auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo suggerisce che essi sono molto promettenti per le applicazioni mediche e come strumento di ricerca per affrontare questioni fondamentali per lo sviluppo e la malattia. Qui, mettiamo a disposizione una concisa, passo-passo il protocollo per la derivazione di cellule staminali embrionali umane da embrioni da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

La capacità delle cellule staminali embrionali umane di auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi cellulari dell'organismo suggerisce che esse rappresentino una grande promessa sia per...

Ciao, mi chiamo Alice Chen. Sono un'aspirante ricercatrice nel laboratorio di melting e oggi vi mostrerò come otteniamo cellule staminali embrionali da embrioni umani. Riceviamo embrioni in diverse fasi di sviluppo e li coltiviamo in vitro fino a quando non raggiungono lo stadio di blastocisti espansi adeguato.Questi sono esempi di come l'embrione si sviluppa dal primo stadio, quello a una singola cellula, fino al blastocisto iniziale e quindi al blastocisto espanso, dal quale deriviamo le cellule staminali embrionali umane. Gli embrioni di alta qualità selezionati per la derivazione vengono quindi trasferiti attraverso tre gocce di ACE roads, dove li si lascia e si osserva la dissoluzione della Zona pellucida. Il processo di immunocirurgia è un processo non specifico in cui l'anticorpo anti-uomo di coniglio si lega allo strato esterno delle cellule.In questo caso, si tratta della trifecta derm. Dopo l'applicazione del complemento sierico di criceto, tutte queste cellule con anticorpo legato saranno lisate. Per iniziare, è necessario preparare tre piastre.La prima piastra è per le ACE tyros, che utilizziamo per rimuovere lo zita. La seconda e la terza piastra sono per la chirurgia immunologica. Comincerò innanzitutto generando la piastra in cui posizioneremo le gocce di acid tyros e la derivazione da cellule staminali embrionali umane.Gocce di mezzo. Preparare tre gocce di tirosina acida sul lato sinistro della piastra e, sul lato destro della piastra, preparare tre gocce di mezzo di coltura per cellule staminali umane. La seconda piastra contiene l'anticorpo primario, ovvero un anticorpo anti-globuli rossi umani da coniglio.Anche in questo caso, il lato sinistro della piastra sarà dedicato all'anticorpo primario, tre gocce per embrione, e il lato destro della piastra sarà dedicato alla coltura di ES umane. Gocce di mezzo, ancora una volta, tre gocce per embrione per la piastra del complemento. Di nuovo, posizioneremo tre gocce di complemento sul lato sinistro della piastra e poi tre gocce di mezzo di coltura per cellule staminali umane sul lato destro della piastra.Anche in questo caso, ogni riga è dedicata a un singolo embrione. Tutte e tre le piastre sono ricoperte con olio minerale per prevenire l'evaporazione e collocate nell'incubatrice per l'equilibrazione. Si tratta di un microscopio per dissezioni posizionato all'interno di un'area di prelievo sterile dotata di flusso laminare, simile a quella utilizzata per la coltura dei tessuti, e in questo ambiente eseguiamo la maggior parte delle manipolazioni sugli embrioni umani.La prima cosa che si desidera preparare prima di iniziare a lavorare con gli embrioni è la pipetta a bocca. Questa è la comune tubatura per pipetta a bocca, ma abbiamo inserito un filtro da 0,2 micron tra la bocca e l'estremità della pipetta. Questo serve semplicemente a garantire la sterilità.Lasciatemi mostrare come tirare le pipette a bocca. Mi piace realizzare svariati diametri. È possibile ottenere tutti questi da VWR e io preferisco realizzare diametri di 10 microlitri, 50 microlitri e 100 microlitri.Ora sto usando un perno di diamante per tagliare il tubo di montaggio. Per questo primo passaggio, è necessario un diametro piuttosto grande poiché si maneggia l'intero embrione. Gli embrioni di alta qualità selezionati per la derivazione vengono quindi trasferiti attraverso tre gocce.Trasferire le gocce dalla prima alla seconda e poi alla terza goccia, dove si lascerà il campione osservando la dissoluzione della zap palita. Questo processo richiede solitamente meno di 30 secondi e si può effettivamente osservare la dissoluzione della zop palita. Quando la zap palita si è completamente sciolta.Gli embrioni vengono quindi trasferiti attraverso le tre gocce di lavaggio del mezzo di coltura per embrioni umani, passando dalla prima, alla seconda e alla terza goccia di lavaggio. Successivamente, l'embrione viene trasferito nelle gocce dell'anticorpo primario, passando nuovamente dalla prima alla seconda e alla terza goccia, dove verrà lasciato per mezz'ora di incubazione nell'incubatore per colture cellulari. La lisi della trifecta dermica diventa evidente quando si osservano bollicine sulle cellule all'esterno dell'embrione. Questo fenomeno indica l'inizio della lisi delle cellule dermiche della trifecta.Quando la lisi è evidente lungo tutto il margine esterno dell'embrione, l'embrione è pronto per essere lavato attraverso le tre gocce di mezzo di coltura humanus. Dopo l'immunosurgery, gli embrioni vengono triturati meccanicamente utilizzando una pipetta a bocca più piccola. Questa pipetta a bocca deve avere un diametro inferiore rispetto alla prima pipetta, in modo da rendere il processo di triturazione più efficiente per rimuovere la trifetta lisica.Celle dermiche. Alla fine della meccanizzazione, rimane un aggregato di cellule al centro. C'è la massa cellulare interna, che è integra.Circondato da questo, ci sono molte cellule dermiche trifetta lisate, oltre ad alcune cellule dermiche trifetta integre. L'isolato della massa cellulare interna viene quindi posizionato in una pozzetta precedentemente preparata con uno strato di cellule di sostegno di embrione murino. La piastra con lo strato di cellule di sostegno era stata preparata la sera precedente e questa mattina ho sostituito il mezzo di coltura da quello per fibroblasti embrionali murini a quello per la derivazione di cellule staminali umane.L'isolato della massa cellulare interna viene quindi trasferito dalle gocce di lavaggio dopo il complemento in questa pozzetta contenente le cellule del layer di supporto. La piastra viene quindi riposta nell'incubatrice e lasciata indisturbata per alcuni giorni per consentire l'attaccamento dell'isolato della massa cellulare interna. Questo è un esempio di come si sviluppa l'outgrowth.Quando l'espansione diventa sufficientemente grande, possiamo procedere con il primo passaggio dividendo questa espansione a metà. Sono passati 14 giorni da quando è stata effettuata la derivazione iniziale e questo è un esempio di espansione proveniente da una delle nostre derivazioni.Questo è un esempio di una di queste escrescenze da cui oggi preleverò metà dell'escrescenza. L'escrescenza verrà divisa a metà, quindi tagliata in pezzi quadrati, e ciascuno di questi pezzi verrà trasferito in una nuova pozzetta contenente cellule feeder. È consigliabile lasciare intatta metà dell'escrescenza in modo da disporre di una fonte continua di cellule a cui risalire per amplificare le cellule e per eseguire eventuali passaggi di backup.Per i primi due o tre passaggi, è consigliabile effettuare il passaggio meccanico in questo modo e, alla fine, adattare le cellule alla dissociazione enzimatica per un'impacchettamento più efficiente. Il nostro laboratorio ottiene in modo costante linee di cellule staminali embrionali umane per l'uso e la comprensione dello sviluppo e della differenziazione.Queste linee vengono inoltre distribuite a livello mondiale ai ricercatori di cellule staminali. Ritengo che esistano quattro fattori principali che influenzano il successo della derivazione. Il primo riguarda la qualità dell'embrione, che dipende anche dal background genetico, dalla qualità con cui gli embrioni sono stati congelati e scongelati, e anche dalla qualità della coltura in vitro fino alla fase di derivazione allo stadio di blastocisti.Il secondo fattore è probabilmente l'integrità qualitativa della massa cellulare interna dopo l'isolamento, e ciò può dipendere dalla tecnica utilizzata per isolare la massa cellulare interna e anche dall'esperienza e dall'abilità. Il terzo fattore è la capacità della massa cellulare interna isolata di aderire agli strati di cellule di supporto, e il quarto fattore è l'espansione dell'isolato di ICM. Non credo che si tratti tecnicamente di un processo difficile.È solo questione di un po' di pratica. In effetti, ogni passaggio è abbastanza semplice, quindi finché si è in grado di seguire il protocollo, con un po' di esercizio penso che chiunque possa farlo. Quello che abbiamo scoperto in laboratorio è che ogni linea è leggermente diversa per motivi che non comprendiamo del tutto.Ad esempio, se si volesse testare il potenziale differenziativo di 10 linee cellulari, forse due o tre di queste linee potrebbero avere maggiori probabilità di svilupparsi nel tipo di cellula di interesse. Sospetto che queste differenze siano legate allo stadio embrionale in cui le linee di cellule staminali embrionali sono state ottenute, nonché alla manipolazione manuale di queste cellule. Ritengo che talvolta la proprietà e l'eterogeneità delle linee cellulari possano cambiare, e che il loro potenziale sia un aspetto che ogni ricercatore nel campo delle cellule staminali deve tenere presente.Anche in questo caso, non so cosa causi questo fenomeno, ma certamente, a titolo di esempio per la mia ricerca, il nostro obiettivo finale è produrre cellule beta del pancreas capaci di sintetizzare insulina. Il primo passo per ottenere questo tipo di linea cellulare consiste nel generare endoderma a partire da cellule staminali embrionali; confrontando da 10 a 20 linee cellulari, abbiamo osservato che una o due di queste linee possono generare endoderma in modo efficiente, mentre circa la metà potrebbe produrlo in modo meno efficiente, e alcune non riescono affatto a generare endoderma in maniera soddisfacente. Pertanto, attraverso questo processo iniziale di selezione, scegliamo le cellule che presentano una maggiore tendenza a differenziarsi nel tipo cellulare di interesse, e proseguiamo la successiva differenziazione utilizzando queste linee cellulari.La prima derivazione di cellule staminali embrionali umane è stata riportata da Thompson et al. nel 1998 e, nel 2004, il nostro laboratorio ha riportato la derivazione di 17 nuove linee di cellule staminali embrionali umane. Modificando questi protocolli pubblicati, modifiche che avevano essenzialmente lo scopo di rendere il processo di derivazione più efficiente, si sono apportate variazioni alla composizione del mezzo, al metodo di passaggio delle cellule e al loro congelamento e scongelamento.Da allora, in ogni derivazione, cerchiamo nuovi modi per migliorare il protocollo e il tasso di derivazione. Ad esempio, il nostro laboratorio sta esplorando metodi alternativi per isolare la massa cellulare interna, senza utilizzare reagenti xenogeni come l'anticorpo di coniglio o il complemento sierico di criceto, ma piuttosto dissezionando meccanicamente la massa cellulare interna. Si spera che questi metodi portino a un metodo almeno paragonabile, se non migliore, per isolare la massa cellulare interna.

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