Name: CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri la tecnica CLOuD9 per la riorganizzazione reversibile dei loop di cromatina mediante CRISPR-dCas9. Questo metodo consente di modulare selettivamente l'espressione genica e studiare la dinamica della struttura cromosomica.

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Ringraziamo H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo e l'intero laboratorio di Wang per supporto tecnico e lettura critica del manoscritto. S.l.m. è stata sostenuta in questo lavoro attraverso la NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) e il National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. è supportato da un premio alla carriera per gli scienziati medici del Burroughs Wellcome fondo ed è un Donald E. e Delia B. Baxter Fondazione facoltà studioso.

1. gRNA Design
<ol><li>Selezionare uno strumento di progettazione gRNA standard per progettare la guida RNAs10. Utilizzare coppie complementari di CLOuD9 costrutti precedentemente sviluppato9 (cioè, almeno 1 S. aureus (CSA) e 1 S. pyogenes (CSP) costruire) per ogni esperimento.<ol>
<li>All'interno dello strumento di progettazione on-line selezionati, utilizzare la sequenza di Protospacer adiacente Motif (PAM) "NGG" con una lunghezza di guida di 20 bp per CSP e il PAM di sequenza "NNGRRT" con una lunghezza di guida di 21 per CSA.</li>
		<li>Scegliere Guide basate sulla specificità Punteggio ottenuto e guide su entrambi i fili per massimizzare le probabilità di ottenere una guida di lavoro di progettazione.</li>
		<li>Ordinare 2 oligonucleotidi per guida da un produttore di oligo: per oligo avanti, aggiungere "caccg" all'estremità 5' della sequenza guida e per l'oligo inversa, aggiungere "aaac" all'estremità 5' e "c" all'estremità 3' prima di ordinare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inizialmente, progettazione gRNAs di 3-5 per ogni area di interesse, si sviluppa su un'area di bp 250-1000. Valutare il gRNA targeting efficienza come segue:<ol>
<li>GRNAs clone identificato in un plasmide Cas9 attivo (Vedi punto 3) e transitoriamente transfect in cellule 293T (Vedi punto 4)11.</li>
		<li>Crescere le cellule per 2-3 d in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (streptococco di penna), poi raccolto ed estrarre genomic DNA12.</li>
		<li>Amplificare regioni mirate da reazione a catena della polimerasi (PCR). Eseguire prodotti su un gel di agarosio 1.5% e purificare bande appropriati.</li>
		<li>Eseguire un'analisi di endonucleasi T7 come descritto in Guschin, et al. protocollo n.13,14. Nota: Guide efficienti sono quelli determinati per tagliare il DNA presso il sito di destinazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. coltura cellulare
<ol><li>Mantenere le cellule in una sana e dividono attivamente stato.<ol>
<li>Per K562s, cultura media di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 10% FBS e 1% penna dello streptococco.<ol>
<li>Crescere K562s in un pallone di collo inclinato 25 cm2 per manutenzione e regolare la densità delle cellule a 400.000 cellule per mL ogni giorno.</li>
			<li>Dopo K562s sono state trasdotte con costrutti di CLOuD9, aggiungere 2 con puromicina µ g/mL e 100 µ g/mL igromicina per mezzi di manutenzione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per 293Ts, cultura in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 10% FBS e 1% penna dello streptococco.<ol>
<li>Crescere 293Ts in piatti da 10 cm2 e dividere quando confluenti.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Miniprep e gRNA inserimento15
Nota: Le mappe di plasmide sono disponibili nell'appendice e primer utilizzati negli esperimenti di esempio sono disponibili in supplementari nella tabella 1.
<ol><li>Mix 5 µ g del plasmide CRISPR lentivirale con 3 µ l di BsmBI, 3 µ l della fosfatasi alcalina, 6 µ l di tampone 10x e 0,6 µ l di preparata 100 mM DTT. Portare il volume totale a 60 µ l con ddH2O e incubare a 37 ° C per 30 min a digerire e dephosphorylate il plasmide.</li>
	<li>Gel di purificare il plasmide digerito ed eluire ddH2O.</li>
	<li>Mescolare 1 µ l di ciascuna delle guide accoppiate a 100 µM con 1 µ l di 10 x T4 legatura Buffer, 6,5 µ l di ddH2O e 0,5 µ l T4 PNK, raggiungere 10 µ l di volume totale. Incubare a 37 ° C per 30 min, poi a 95 ° C per 5 min, poi la rampa fino a 25 ° C a 5 ° C/min. Nota: Questo verrà tempri la coppia di guide.</li>
	<li>Diluire 1: 200 guide ricotto (dal punto 3.3) in ddH2O.</li>
	<li>Mescolare 1 µ l del plasmide digerito dal passaggio 3.2 con 0,5 µ l delle guide dei diluito dal passaggio 3.4, 2,5 µ l di 2 x Buffer, 1 µ l di ddH2O e 0,5 µ l di ligasi, per rendere una reazione totale di 5,5 µ l. Questo Incubare a temperatura ambiente per 10 min legare le guide per il plasmide BsmBI digerito.</li>
	<li>Trasformare il plasmide appena legato da passo 3.5 Stbl3 batteri e amplificare utilizzando qualsiasi metodo di preparazione del plasmide.</li>
</ol>4. lentivirus produzione
<ol><li>Conteggio 750.000 293T cellule per pozzetto per un sei-pozzo piastra utilizzando un emocitometro e semi in DMEM con 10% FBS e 1% penna dello streptococco. Usarla bene per ogni costrutto.</li>
	<li>24 h dopo la semina, cambiare supporto a fresco privo di antibiotico DMEM con 10% FBS.</li>
	<li>In una provetta, diluire 11 µ l di reagente di transfezione basata sui lipidi con 150 µ l del OptiMEM medium, per reazione11.</li>
	<li>In un tubo separato, diluire 2 µ g del plasmide vettore lentivirale CLOuD9 dal punto 3.6, 0,35 µ g di pMDLg/pRRE, 1 µ g di OSPRO-Rev e 0,65 µ g di pMD2.G con 150 µ l del OptiMEM medium, per reazione11.</li>
	<li>Per ogni reazione, aggiungere le miscele di plasmide lentivirali diluito per il reagente di transfezione basata sui lipidi diluito con un rapporto 1:1 e incubare per 5 min11.</li>
	<li>Aggiungere l'intero volume di ciascun complesso misto dal passaggio 4.5 nei relativi pozzetti delle cellule 293T privo di antibiotico dalla fase 4.2.</li>
	<li>48 ore più tardi, raccogliere produzione virale media pipettando in una nuova provetta e spin giù a 300 x g per 5 min. Dopo la centrifugazione, spostare il surnatante in una nuova provetta per rimuovere i detriti residua della cellula.</li>
	<li>Usare mezzi di produzione virale immediatamente per la trasduzione delle cellule bersaglio o congelare a-80 ° C per un uso futuro.</li>
</ol>5. lentivirus trasduzione delle cellule
<ol><li>Aggiungere 250 µ l di ogni costrutto virale di interesse (composto da complementari CLOuD9 plasmidi) in una provetta conica 15 mL contenenti 80.000 cellule per l'applicazione di CLOuD9.</li>
	<li>Portare il volume totale dei media in ogni conica a 1 mL con media senza Antibiotico e aggiungere polybrene a una concentrazione finale di fra 1-8 µ g/mL (la concentrazione massima di polybrene tollerato dal tipo cellulare utilizzato dovrà essere determinata sperimentalmente).</li>
	<li>Girare le cellule a 800 x g per 30 min a temperatura ambiente, quindi risospendere pipettando senza rimuovere il surnatante virale. Spostare la sospensione dell'intera cella in una piastra di coltura delle cellule.</li>
	<li>24h post-traduzionali, cellule di spin giù a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare il surnatante virale e risospendere le cellule in terreno di coltura delle cellule normali.</li>
	<li>Il giorno successivo, aggiungere con puromicina (1 µ g/mL per cellule 293T) e igromicina (25 µ g/mL per cellule 293T) al medium della coltura cellulare per selezionare per cellule doppiamente trasdotte. Determinare sperimentalmente le concentrazioni adeguate di con puromicina e igromicina per un tipo di cella specificata prima dell'inizio degli esperimenti.</li>
	<li>Mantenere le cellule nei media di selezione per almeno 3 d prima eventuali esperimenti a valle e mantenere in media di selezione, per la durata di tutti gli esperimenti.</li>
</ol>6. la dimerizzazione e Wash Out delle cellule
<ol><li>Aggiungere 1 mM acido abscissico (ABA) o un volume equivalente di solfossido dimetilico (DMSO) per i controlli alla coltura delle cellule a dimerizzano il CLOuD9 selezionato e trasdotte cellule. Utilizzare ABA entro 6 mesi dalla data di ricevimento, mantenere il freddo e proteggerlo dalla luce nell'uso. 2 mM ABA può essere utilizzato se necessario.<ol>
<li>Cambiare supporto ogni giorno per fornire fresco ABA (o DMSO per controlli) per la durata degli esperimenti. Nota: Nessun limite per la lunghezza di dimerizzazione ancora è stato osservato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Invertire la dimerizzazione attraverso la rimozione di supporti contenenti ABA e cellule di lavaggio con sufficiente tamponato fosfato salino (PBS) per coprire la superficie della piastra, due volte. Da allora in poi, cellule di cultura in media senza ABA per mantenere uno stato di non-dimerizza.</li>
</ol>7. immunoprecipitazione e Co-immunoprecipitazione
Nota: Assicurarsi di tutti i buffer fresco e immediatamente prima dell'uso.
<ol><li>Dopo il completamento degli esperimenti di dimerizzazione, raccogliere e rotazione verso il basso le celle, quindi aspirare il surnatante.</li>
	<li>Crosslink e congelare giù le cellule<ol>
<li>Fare un magazzino fresco di formaldeide 1% in PBS a temperatura ambiente, utilizzando materiali freschi. Per ogni 2 milioni di cellule, Risospendere delicatamente con 1 mL di formaldeide 1% a temperatura ambiente per esattamente 10 min, durante la rotazione. Nota: Utilizzare un volume minimo di 10 mL per reticolazione inferiore a 10 milioni di cellule.</li>
		<li>Placare la reticolazione con l'aggiunta di glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M, seguita da incubazione per 5 min a temperatura ambiente, durante la rotazione.</li>
		<li>Rotazione verso il basso le cellule e lavare 1-2 volte con PBS ghiacciata. Palline delle cellule possono essere quindi snap congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C o utilizzato immediatamente. Nota: Calore invertirà le reticolazioni formaldeide. Se si precipitò, le cellule possono essere memorizzate direttamente a-80 ° C senza congelare lo snap.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il coniugato anticorpo/tallone Nota: Condizioni di ottimizzazione per l'anticorpo selezionata (cioè, test di buffer di lisi diverse per lisi cellulare e l'esecuzione di IP) possono essere utile. Due comuni buffer, buffer di lisi di Farnham e buffer RIPA per volta, può avere un effetto significativo sull'efficienza IP ed efficienza di sonicazione. Tutte le composizioni di buffer possono essere trovate nella Tabella materiali. Inoltre, tenete a mente che cromatina sonicazione può richiedere diverse ore per completare.<ol>
<li>Risospendere le perline nel Vortex brevemente come appropriato per l'anticorpo selezionata.</li>
		<li>Trasferire una quantità appropriata di perline per l'esperimento in una provetta da 1,5 mL. Come punto di partenza, è possibile utilizzare 20 µ l di perline per ogni 1 µ g di anticorpo. Non aggiungere ancora dell'anticorpo. Nota: Utilizzare 10 µ g anticorpo con 200 µ l di perline per 1 mg di totale lysate come punto di partenza, a meno che non è noto che l'anticorpo è più o meno efficiente di quanto ciò implicherebbe. Per le proteine di abbondanza bassa, questo rapporto potrebbe essere necessario essere regolata.</li>
		<li>Se si utilizza il buffer di lisi di Farnham, lavare 3x in tampone di diluizione di IP. Se si utilizza il buffer di lisi RIPA, lavare 3x in tampone di lisi RIPA.</li>
		<li>Risospendere le perline in un volume finale dello stesso buffer dal punto 7.3.3 (diluizione di IP o buffer di RIPA) che è > 1 x e < 5 volte il volume iniziale. vale a dire Per 100 µ l di perlina iniziale, utilizzare tra 100 e 500 µ l di risospensione finale.</li>
		<li>Aggiungere anticorpo lavato beads ora a una concentrazione appropriata. Per un buon anticorpo HA o bandiera ai costrutti di CLOuD9 IP, usare gli anticorpi alle 01:50 (µ g proteine: µ g lisato proteico) ed incubare tra 8 + h e durante la notte a 4 ° C, durante la rotazione. In alternativa, incubare per 2-4 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante da perline e scartare.</li>
		<li>Perle di lavare 3 volte con il tampone di lavaggio.</li>
		<li>Risospendere in un volume minimo del buffer utilizzato per pernottamento incubazione con l'anticorpo (diluizione di IP o RIPA buffer). Mantenere il freddo fino a quando combinato con lisato proteico.</li>
	</ol></li>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni della cromatina<ol>
<li>In primo luogo lisare cellule con l'aggiunta di gonfiore buffer per palline delle cellule in ghiaccio per 10 min, sfogliando le cellule ogni pochi minuti per evitare la sedimentazione. Nota: In genere, 500 µ l di tampone di gonfiore è aggiunto alle cellule di 25 milioni e scalati da lì, ma fare uso minore di 500 µ l tampone per < 25 milioni di cellule.</li>
		<li>Lisata manualmente in senso orario e antiorario, 13 x ciascuno.</li>
		<li>I nuclei di spin giù a 4 ° C per 5 min a 1.500 x g. aspirare il supernatante completamente e ripetere la procedura per rimuovere il surnatante rimanenti, poi pesano il pellet cellulare in mg.</li>
		<li>Aggiungere l'inibitore della proteasi al buffer di lisi di nuclei (Farnham buffer o RIPA buffer, sopra, scegli uno).</li>
		<li>Aggiungere 10 x quantità di tampone di lisi di nuclei ai nuclei pellettati per risospendere (ad esempio, aggiungere 1 mL di tampone di lisi di nuclei per un pellet di 0,100 g). Brevemente vortice e lyse per 10 min sul ghiaccio. Nota: Tenere presente la dimensione del tubo sonicazione. Volume ideale è spesso < 1 mL, quindi potrebbero essere necessario essere diviso se pellet sono molto grandi campioni.<ol>
<li>Per Co-IP, Sonicare nuclei brevemente per solubilizzare materiale e dissetare SDS ad un livello che consente di immunoprecipitazione con 2-3 volumi di tampone di diluizione, quindi procedere con il passo 7.4.6. Per gli anticorpi molto sensibili, aggiungere più tampone di diluizione per ridurre ulteriormente la concentrazione di SDS. Nota: Interrompere sonicazione quando Cancella lisato; che passa da un opaco/traslucido bianco a completamente trasparente. I campioni possono essere freddo come possibile e non oltre Sonicare.</li>
			<li>Per il ChIP, accuratamente Sonicare DNA per ottenere frammenti di DNA di 150-1000 bp, quindi procedere con il passo 7.4.6.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Filare fuori materiale insolubile alla massima velocità per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Trasferire il materiale solubile in una nuova provetta.</li>
		<li>Per Co-IP, misurare la concentrazione di proteina e procedere con il pulldown al punto 7.5.</li>
		<li>Per il ChIP, rimuovere un'aliquota di 10 µ l di deselezionata lisato e aggiungere 40 µ l IP buffer di eluizione e 6 µ l 5 M NaCl a quella per un totale di 56ul. Far bollire per 15 min a 95 ° C, aggiungere 5-10 µ l di 3M NaOAc pH 5 e ripulire in una colonna di purificazione di PCR. Misurare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza a 260 nm e standardizzare i campioni. Quindi procedere al pulldown al punto 7.5. Nota: Extra lisato può essere snap congelato a-80 ° C e utilizzato in un secondo momento, ma i migliori risultati sono ottenuti dal fresco lisato. Se il congelamento, non gelo/disgelo lisato di più di una volta.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulldown<ol>
<li>Trasferire una quantità appropriata di lisato proteico in una nuova provetta. Se si utilizza il buffer di lisi di Farnham, diluire in 2,1 volumi di tampone di diluizione IP (Vedi sopra).</li>
		<li>Mettere da parte 100 µ l del surnatante per controllo di input e conservare a 4 ° C fino al giorno successivo.</li>
		<li>Aggiungere tallone/anticorpo coniugato dal passaggio 7.3.8 ai campioni.</li>
		<li>Ruotare i campioni a 4 ° C durante la notte e garantire che c'è abbastanza volume per movimento liquido in provette da 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare ed eluire<ol>
<li>Dopo la rotazione durante la notte, è possibile salvare il surnatante come la frazione non vincolante. Quindi lavare perline 3-5 volte in tampone di diluizione di IP.</li>
		<li>Preparare il tampone di eluizione di IP a temperatura ambiente, senza inibitori.</li>
		<li>Eluire complessi con 50 µ l di tampone di eluizione scosso su un vortex a 67 ° C per 15 min. eluizione di trasferimento ad un nuovo tubo e ripetere con un altro 50 µ l. combinarli entrambi per un totale eluizione di 100 µ l. Nota: Se c'è troppa background di questa procedura di eluizione, calore può essere ridotto o eliminato durante l'agitazione/incubazione. Questo in genere riduce il rendimento della proteina bersaglio, ma diminuire significativamente sullo sfondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Invertire le reticolazioni riscaldando a 67 ° C per > 4h. Nota: Questo non è strettamente necessario per co-IPs, ma può essere utile.<ol>
<li>Per Co-IP, per garantire piena dimerizzazione tra le destinazioni di interesse, eseguire eluati su un gel di SDS-page e sonda con gli anticorpi contro il tag HA o Flag, come indicato, tutto a 1: 1.000. Quindi procedere al passaggio 8.</li>
		<li>Per ChIP-qPCR, per garantire la corretta localizzazione e ottimizzazione di ogni componente di CRISPR-dCas9, pulire eluizione prodotto su una colonna ed eluire in 10 µ l. eseguire in tempo reale quantitativa polymerase chain reaction (qPCR) di DNA purificato. Primer utilizzati nei dati presentati sono disponibili in supplementari nella tabella 1. Quindi procedere al passaggio 8.</li>
	</ol></li>
</ol>8. estrazione e del RNA PCR quantitativa
<ol><li>Per studiare i cambiamenti nell'espressione genica indotta da CLOuD9, in primo luogo, di isolare e purificare il RNA totale da controllo cella pellet e pellet dimerized cella.</li>
	<li>Rendere il DNA complementare (cDNA) dal RNA purificato da trascrizione inversa17 ed eseguire analisi qPCR. Gli iniettori sono disponibili in supplementari nella tabella 1.</li>
</ol>9. cromosoma conformazione Capture Assay
<ol><li>Per osservare i cambiamenti nella frequenza di contatti di loci genomici indotti da CLOuD9, eseguire cromosoma conformazione acquisizione (3C) saggi8.</li>
	<li>Quantificare i prodotti di legatura 3C in due insiemi di duplicati per ciascuno dei tre replicati biologici mediante PCR quantitativa in tempo reale. Normalizzare i campioni per i segnali di 3C dal locus di tubulina. Gli iniettori sono disponibili in supplementari nella tabella 1.</li>
</ol>

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<li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li>
<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le fasi critiche in CLOuD9 cromatina loop sono: 1) progettazione o utilizzando il gRNAs corretto, media 2) cambia ogni giorno sulle cellule trasdotte CLOuD9, tra cui ABA o DMSO, 3) mantenendo la freschezza dell'ABA e 4) esecuzione accurate e attenta valutazione di conformazione della cromatina.
I limiti di CLOuD9 risiedono principalmente nella capacità di progettare guide alla regione di destinazione della scelta. Guida RNAs eseguire l'importante compito di localizzare i componenti di dCas9 a regioni del DNA bersaglio per essere dimerized e l'efficacia delle guide si basano sul loro sito di destinazione specifica. Senza i componenti gRNA corretto, il sistema non sarà in grado di formare reversibilmente CLOuD9 indotto loop. Così, di progettare più guide per ogni area di interesse e diffondendo le guide in una regione di 250-1000 bp, sarà assicurata almeno una guida di successo. Posizione di guida è anche parte integrante risultati accurati. È importante evitare guide situate in siti di legame del fattore di trascrizione o altre regioni critiche per evitare effetti di sfondo come verso l'alto o verso il basso regolazione della trascrizione. Inoltre, l'ubicazione precisa del costrutto CLOuD9 può influire leggermente trascrizione del gene dell'obiettivo. Questo sottolinea l'importanza dei test più coppie di guide per ogni regione di destinazione, per identificare la coppia più robusta per scopi sperimentali. Ulteriormente, ogni coppia di regioni di destinazione, il costrutto CSA dovrebbe essere destinato con gRNAs S. aureus, e il costrutto CSP dovrebbe essere mirato con gRNAs per S. pyogenes per il targeting di specificità.
Per garantire risultati accurati e corretta dimerizzazione, è anche importante mantenere la freschezza degli ambienti cellulare seguendo la trasduzione dei costrutti di CLOuD9. Supporto giornaliero di modifica e l'aggiunta di dimerizer fresco (o controllo) assicura che i costrutti complementari rimarrà in prossimità e preservare la conformazione della cromatina alterata. Inoltre, garantendo l'ABA è fresco ed è stata conservata in modo appropriato secondo il protocollo del produttore (aperto entro 6 mesi, freddo, mantenuti protetti da luce) è essenziale per ottenere risultati autentici.
In particolare, il dimerizer di ABA per CLOuD9 è stato utilizzato con le proteine di dimerizzazione di ABI e PYL, piuttosto che più comunemente utilizzato sistema FRB e FKBP. La necessità di un rapalog per il sistema FRB/FKBP avrebbe limitato l'applicabilità di CLOuD9, a causa della tossicità per le cellule tumorali. Il sistema alternativo di ABI/PYL aggirato questa limitazione, abilitando in modo efficiente CLOuD9 essere più largamente utilizzabili.
Collettivamente, abbiamo sviluppato CLOuD9, una tecnologia unica e robusta che può con la forza ma reversibilmente creare contatti tra loci genomici destinazione a lungo raggio. Through inducendo cromatina loop, inoltre dimostriamo che CLOuD9 possono essere utilizzati per modificare l'espressione genica nel contesto cellulare appropriato. L'adattabilità della tecnologia consente lo studio senza restrizione delle interazioni tra qualsiasi due loci genomici, senza richiedere una conoscenza preventiva del ripetere le regioni o meccanismi di ciclo. Inoltre, unico reversibilità dimostrata di CLOuD9 un'ulteriore esame dei meccanismi loop in malattia e lo sviluppo. Mentre gli effetti su bersaglio di cromatina loop sono stati dimostrati chiaramente, c'è ancora di essere dati offrendo comprensione negli effetti di loop fuori bersaglio e il conseguente impatto sui cicli on target.
I nostri dati illustra solo alcune applicazioni di questo strumento, ma implica l'idea di fondo importante che la disposizione della cromatina è indicativa dell'espressione genica. La nostra tecnologia può essere utilizzata per studiare e rivelare le sfumature della struttura della cromatina nella regolazione genica, migliorando la comprensione globale del ruolo della cromatina pieghevole nella trascrizione dei geni. Una migliore comprensione delle sottigliezze di transcriptional dinamiche possono aprire la strada nella ricerca e nel trattamento di cancro, malattie ereditarie e disordini congeniti, in cui cromatina distinta Assemblea senza dubbio altera gene espressione20, 21,22,23. Lavori successivi utilizzando la tecnologia di CLOuD9 illuminerà ulteriori dettagli circa la disposizione e la dinamica della cromatina domini e come guidano pieghevole per sostenere l'espressione genica stabile in sviluppo e la malattia.

Il rapporto tra cromatina pieghevole nel nucleo e l'organizzazione specifica del genoma ha raccolto significativo interesse negli ultimi anni, come è stato dimostrato essere associato molto attentamente con gene expression1,2. Mentre il rapporto preciso fra attività genica e modulazione della struttura della cromatina rimane poco chiaro, è stato ipotizzato che le interazioni tra contatti cromosomiche come risultato di organizzazione dinamica della cromatina tridimensionale servano un gene funzione regolativa3. Infatti, tale effetto è stato ben dimostrato al luogo del gene della globina umana, dove la regione di controllo del locus (LCR) regola l'attività dei geni della globina in modo inerente allo sviluppo specifico creando un ciclo di cromatina tra le due regioni4. Tuttavia, in questa e altre regioni, non è chiaro se cromatina looping è una causa o una conseguenza delle alterazioni nell'espressione genica.
Fino ad ora, le sfide a studiare questo fenomeno sono rimaste irrisolte. Per esempio, altri tentativi di indurre cromatina loop coinvolto modifica della sequenza di DNA lineare o procedure complesse che richiedono un'abbondanza di conoscenza di base sugli elementi specifici che facilitano il loop5,6, 7,8. Inoltre, mentre il lavoro precedente ha suggerito che cromatina loop auto espressione genica in un contesto specifico e limitato7,8, il livello al quale cromatina looping colpisce trascrizione a livello globale è incerto. Se interesse l'impatto di looping a lungo raggio sull'espressione del gene è cresciuta costantemente negli ultimi anni, domande senza risposta circa stabilendo e mantenendo contatti della cromatina per modificare l'attività del gene persistono.
La tecnologia che abbiamo progettato impiega nucleasi carenti cluster ripetizioni brevi palindromi regolarmente intercapedine (CRISPR) - CRISPR - associati proteina 9 (dCas9), per consentire il targeting ampiamente applicabili di qualsiasi loci genomici9. Questa tecnologia elimina le complesse problematiche relazionate a modifiche della sequenza del DNA lineare ed è accessibile senza significativa conoscenza preliminare di determinati componenti di loop. In particolare, lo strumento è universale e ampiamente applicabili agli anelli di cromatina riconosciuti in sviluppo, nonché una varietà di malattie, come il cancro. Il potere di CLOuD9 è dimostrato reversibilmente alterando la struttura di loop a efficacemente modulano l'espressione genica.

<table><tbody><tr><td>Terreni RPMI 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Per colture cellulari K562</td></tr><tr><td>Terreni DMEM Life</td><td>Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, per colture cellulari 293T</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene plasmide</td><td>#52961</td><td>Per lo sviluppo di plasmidi CLOuD9</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene plasmide</td><td>#12253</td><td>Per la produzione di lentivirus</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12259</td><td>Per la produzione di lentivirus</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12251</td><td>Per la produzione di lentivirus</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>Per la produzione di lentivirus</td></tr><tr><td>anticorpi anti-HA</td><td>Cell Signaling</td><td>3724</td><td>Per l'immunoprecipitazione</td></tr><tr><td>anticorpi anti-Flag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Per immunoprecipitazione</td></tr><tr><td>DNeasy Sangue e Tessuto Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Per l'estrazione del DNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>Per l'estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Per l'estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>Per cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>Per analisi qPCR</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>Per analisi qPCR</td></tr><tr><td>anticorpo anti-H3K4me3</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>Per ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>anti-RNA Anticorpo Pol-II</td><td>Motivo attivo</td><td>61083</td><td>Per ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi libera EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Per proteine estrazione</td></tr><tr><td>4-12% Tris Glycine gel</td><td>Biorad</td><td></td><td>Qualsiasi dimensione, Per western blot</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Rabbit HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>anticorpi anti-topo HRP</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>7076S</td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>K562 e H3K293 Dati ChIP-Seq</td><td>Codifica</td> ENCSR000AKU <td>Per l'analisi ChIP-seq</td><td></td></tr><tr><td>K562 e H3K293 Dati ChIP-Seq</td><td>Codifica</td><td>ENCSR000APE Per l'analisi</td><td>ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 e H3K293 Dati ChIP-Seq</td><td>Codifica</td> ENCSR000FCJ <td>Per l'analisi ChIP-seq</td><td></td></tr><tr><td>K562 e H3K293 Dati ChIP-Seq</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>Per l'analisi ChIP-seq</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A per l'immunoprecipitazione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>Per l'immunoprecipitazione</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G per </td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>per immunoprecipitazione</td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentratore-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>Per la purificazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeide Senza metanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Per la reticolazione</td></tr><tr><td>PX458 Plasmide</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>Plasmide Cas9 attivo suggerito per il clonaggio del gRNA, ma qualsiasi plasmide Cas9 attivo funzionerà</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Per la purificazione</td></tr> <tr>PCR<td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>Per RNA guida di clonazione</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>Per RNA guida di clonazione</td></tr><tr><td>10X FastDigest Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>Per RNA guida di clonazione</td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Per RNA guida di clonazione</td></tr><tr><td>10X T4 Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Per RNA guida di clonazione</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Per RNA guida di clonazione</td></tr><tr><td>2X Quick Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>Per RNA guida di clonazione</td></tr> Quick <tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>Per RNA guida di clonazione RNA</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham lysis buffer</td><td></td><td></td><td>Tris-Cl pH 8,0 all'1%, SDS all'1%, soluzione acquosa di inibitore della proteasi all'1% (non EDTA) e 1 mM di EDTA in acqua Tampone</td></tr><tr><td></td><td></td><td>RIPA modificato</td><td>1% NP40/Igepal, desossicolato di sodio 0,5%, SDS 0,1%, EDTA 1 mM e soluzione acquosa di inibitore della proteasi all'1% (non-EDTA) in PBS pH 7,8 o 7,4 Tampone</td></tr><tr><td></td><td></td><td>di diluizione IP</td><td>0,01% SDS, Triton-X 100 all'1,1%, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl, inibitore della proteasi 0,1x</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40 e 1% desossicolato di sodio Tampone</td></tr><tr><td></td><td></td><td>di rigonfiamento</td><td>0,1 M Tris pH 7,5, 10 mM acetato di potassio, 15 mM acetato di magnesio, 1% NP-40</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di diluizione <td>0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris pH 8 e 167 mM NaCl</td></tr><tr><td>IP tampone di eluizione</td><td></td><td></td><td>1% SDS, 10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

crispr-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina loop

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recenti studi hanno chiaramente dimostrato che a lungo raggio, tridimensionale della cromatina looping gioco interazioni un ruolo significativo nella regolazione dell'espressione genica, ma se il ciclo è responsabile o il risultato di alterazioni nell'espressione genica è ancora sconosciuto. Fino a poco tempo, come ciclo di cromatina colpisce la regolamentazione delle attività genica e la funzione cellulare è stato relativamente ambigua, e limitazioni nei metodi esistenti per manipolare queste strutture ha impedito una esplorazione approfondita di queste interazioni. Per risolvere questa incertezza, abbiamo progettato un metodo per ri-organizzazione di cromatina selettivo e reversibile ciclo utilizzando CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Il dinamismo del sistema CLOuD9 è stato dimostrato dal successo della localizzazione dei costrutti di CLOuD9 a loci genomici per modulare la conformazione della cromatina locale di destinazione. D'importanza, è stata confermata anche la possibilità di invertire il contatto indotto e ripristinare la conformazione cromatinica endogeno. Modulazione dell'espressione genica con questo metodo costituisce la capacità di regolare l'espressione genica cellulare e sottolinea il grande potenziale per le applicazioni di questa tecnologia nella creazione di loop di cromatina che influenzano marcatamente gene stabile de novo espressione nei contesti di cancro e di sviluppo.

Cromatina loop gioca un ruolo significativo nella regolazione genica; Tuttavia, non ci sono stati nessun progressi tecnologici che consentono di modifica selettiva e reversibile della cromatina con passanti. Qui descriviamo un potente sistema per ri-organizzazione di cromatina ciclo usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9), ha dimostrato di selettivamente e reversibilmente modulare l'espressione genica a mirati loci.

CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Questo metodo potrebbe aiutarci a rispondere a domande chiave relative all'espressione genica che ci mostrano esattamente come la struttura della cromatina influisce sull'espressione genica e su come l'organizzazione della cromatina regola la dinamica trascrizionale. Abbiamo sviluppato questa tecnologia perché volevamo essere in grado di alterare controllabilmente l'architettura cromosomica per consentire la creazione di loop di cromatina a lungo raggio. Mentre allo stesso tempo hanno la capacità di invertire il contesto cromatico per ripristinare la struttura cromosomica endogena.Questo metodo è stato progettato per la facilità d'uso e l'ampia applicabilità. Abbiamo approfittato di un dimerizzatore atossico e di specie ortogonali di dcas9 per consentire un uso più ampio del sistema. Abbiamo sviluppato questo metodo perché volevamo essere in grado di rispondere alla domanda di lunga data su se l'espressione genica genera architettura cromosomica o se la struttura cromosomica porta a cambiamenti nell'espressione genica.La progettazione delle sequenze di RNA crispr-guide e il mantenimento delle colture cellulari sono descritti nel protocollo di testo. Le mappe plasmidiche e i primer utilizzati sono elencati lì. Iniziare la preparazione plasmide mescolando cinque microgrammi del plasmide CRISPR lentivirale con tre microlitri di BsmB1 tre microlitri di fosfatasi alcalina sei microlitri di tampone di digestione 10x e 0,6 microlitri di 100 millimolare di DTT appena preparato.Portare il volume totale a 60 microlitri di acqua distillata doppia e incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti per digerire e de-fosforilato il plasmide. Quindi, gel purificare il plasmide digerito nel plasmide ad anello e nell'acqua distillata doppia. Successivamente, preparare le reazioni di ricottura per le coppie di RNA guida.Combinare un microlitro di ogni RNA guida a 100 micromolari con un microlitro di tampone di legatura T4 10x 6,5 microlitri di acqua distillata doppia e 0,5 microlitri di T4 PNK per un volume di reazione totale di 10 microlitri. Per ricottura le coppie di RNA guida alle loro sequenze bersaglio incubare le miscele a 37 gradi celsius a 30 minuti seguito da un'incubazione a 95 gradi celsius per 5 minuti, quindi ridurre gradualmente la temperatura a 25 gradi Celsius diminuendola di cinque gradi Celsius al minuto. Successivamente, diluire gli RNA guida ricotta a uno o duecento in acqua distillata doppia.Ora, preparate le due reazioni di legazione. Mescolare un microlitro del plasmide digerito con 0,5 microlitri di una guida perivaneale diluita RNAse 2,5 microlitri di tampone di legatura 2x un microlitro di acqua distillata doppia e 0,5 microlitri di ligasi. Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 10 minuti per ligare le guide BsmB1 plasmide digerito.Quindi trasformare il plasmide appena legato in tre batteri stabili e amplificare i batteri utilizzando qualsiasi metodo di preparazione del plasmide. Su un piatto di sei porri, per pozzo, seme 750.000 2n3 Tcells in DMEM con 10%FBS e 1% pen strep. Utilizzare un pozzo per ogni costrutto e incubare le cellule per 24 ore.Il giorno dopo, cambia l'antibiotico medio-fresco free-DMEM con 10%FBS. Subito dopo aver cambiato il mezzo per ogni pozzo di cellule placcate preparare un tubo di miscela di produzione di Lentivirus. Per ogni reazione, diluire 11 microlitri di reagente di trasfezione lipidico-base con 150 microlitri del mezzo Opti-MEM per ogni reazione.Quindi in tubi separati preparare il DNA. Unire due microgrammi del plasmide vettoriale lentivirale CLOud9 con due microgrammi degli altri componenti di imballaggio lentivirale. Diluire questa miscela in 150 microlitri del mezzo Opti-MEM.Quindi combinare volumi uguali della miscela plasmide lentivirale diluita nel reagente di trasfezione diluito a base lipidica e incubare le miscele per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi ad ogni pozzo di cellule aggiungere un tubo delle miscele preparate e continuare l'incubazione. 48 ore dopo, trasferire i mezzi di produzione virali dai pozzi della piastra in conici e farli girare verso il basso a 300 g per cinque minuti.Quindi trasferire il supernatante in tubi freschi per scartare i detriti pelletati. Ora, usa immediatamente il supporto di produzione virale per trasdurre le cellule bersaglio o congelarlo a 80 gradi Celsius per un uso futuro. Inizia aggiungendo 250 microlitri di ogni costrutto virale di interesse, che in questo caso è composto da plasmidi CLOud9 complementari a un tubo conico da 50 millilitri contenente 80.000 cellule.Quindi aggiungere abbastanza Polibrene in modo che sia compreso tra uno e otto microgrammi per millilitro in soluzione. Quindi regolare il volume totale in ogni tubo su un millilitro utilizzando mezzi senza antibiotici. Ora per aumentare il contatto tra le particelle virali e le cellule girare le cellule a 800 g per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi sospendere di nuovo le celle al supernatante pipettando. Quindi, caricare la sospensione delle cellule sulle piastre di coltura e incubarle per 24 ore. Il giorno seguente, raccogliere le cellule.Centrifugarli a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente e sospenderli di nuovo in mezzo normale. Il giorno dopo, aggiungere puromicina e igromicina al mezzo per selezionare le cellule doppiamente trasdutte. L'appropriata concentrazione di antibiotico deve essere determinata in anticipo per ciascun tipo di cellula.Quindi, incubare le cellule nel supporto di selezione per almeno tre giorni prima di procedere con le applicazioni a valle e continuare a mantenere le cellule e i mezzi di selezione. Per dimerizzare le cellule selezionate e trasdutte CLOud9 aggiungere un ABA millimolare al piatto di coltura. Per i controlli, aggiungere DMSO, quindi mantenere le celle con ABA o DMSO per tutta la durata dell'esperimento.Per invertire la dimerizzazione, lavare le celle con abbastanza PBS per coprire la superficie della piastra due volte. Successivamente, le cellule di coltura nei supporti senza ABA per mantenerle in uno stato non dimerizzato. L'uso appropriato del sistema CLOud9 induce un contatto reversibile dei costrutti complementari CSA e CSP CLOud9 attraverso l'aggiunta o la rimozione dell'ABA ai mezzi di coltura cellulare.I costrutti CSA e CSP sono localizzati in regioni genomiche appropriate utilizzando la guida CRISPR standard RNAse. L'immunoprecipitazione della cromatina seguita dalla PCR quantitativa è stata utilizzata per garantire l'accurata localizzazione nel targeting di ogni componente CLOud9. Inoltre la coimmunoprecipazione con e senza dimerizzazione CSA e CSP verificata dall'ABA in presenza del ligando e la reversibilità in assenza del ligando.Dopo la dimerizzazione dell'ABA, un maggiore contatto tra la beta-globina e l'LCR è stato misurato dalla cattura di conferma cromosomica. Tuttavia, ciò non è stato osservato nei controlli contenenti solo il CSA o solo il costrutto CSP. La creazione dell'interazione beta-globina LCR non eliminò completamente il contatto endogeno di globina LCR.È stato aggiunto solo al contatto originale. L'aumento dei contatti LCR beta-globina è stato osservato attraverso 72 ore di dimerizzazione indipendentemente dalla regione esatta all'interno della LCR mirata o della regione promotrice beta-globina. Infine, la reversibilità del sistema è stata confermata con la cattura di conferma cromosomica dopo aver rimosso l'ABA.Ciò ha portato al completo rinnovo della conferma endogena. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di cambiare i supporti e aggiungere nuove celle trasdutte CLOud9 dimerizzate ogni giorno. Non dimenticare che lavorare con il lentivirus può essere estremamente pericoloso e tutte le precauzioni utilizzate in BSL 2 devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.

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