Name: Profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle Candida albicans per analisi istologiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Impara un protocollo di iniezione intradermica di Candida albicans per analisi istologiche della pelle. Questo metodo preserva l'architettura tissutale e permette di localizzare le cellule immunitarie durante le infezioni fungine.

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FG è supportato da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fondazione Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB). IZ è supportato da NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton trovato, CCFA Senior Research Awards (412708), il Eleanor e il Miles Shore 50 ° anniversario Fellowship Program e la Fondazione Cariplo ( 2014-0859).

Tutte le procedure sono state approvate sotto l'istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e operate sotto la supervisione del dipartimento di risorse animali ai bambini dell'ospedale (arco) al Children Hospital di Boston o sono stati approvati dall'italiano Ministero della salute e realizzata sotto il Comitato istituzionale di Animal Care presso l'Università di Milano-Bicocca.
1. preparazione di albicans del c.
<ol><li>Cultura C. albicans, ceppo CAF3-113, in provette contenenti medium ricco (lievito estratto peptone destrosio (YEPD), Estratto di lievito 1% (p/v), 2% (p/v) di Bacto Peptone, 2% (p/v) di glucosio) completate con uridina (50 mg/L) a 25 ° C. In queste condizioni, albicans del c. si sviluppa come un lievito. Nota: Altri ceppi di c. albicans possono essere utilizzati, come la clinica isolare c. albicans SC5314 ceppo13. Dal momento che recentemente abbiamo dimostrato che il processo ulceroso è indotta dall'attivazione del sistema immunitario innato14, teoricamente ogni ceppo di c. albicans che mantiene le sue componenti della parete cellulare e la struttura, così come il capacità di produrre proiezioni ifale, potrebbe essere utilizzato.</li>
	<li>Monitorare la cultura contando la concentrazione cellulare utilizzando un analizzatore di contatore delle cellule.</li>
	<li>Raccogliere la cultura quando raggiunge una concentrazione di circa 8 x 106 cellule/mL. In alternativa, è possibile utilizzare uno spettrofotometro per misurare il OD600. Nota: Di solito, un valore di OD600 = 1 corrisponde ad una concentrazione di lievito di 3 x 107 cellule/mL, ma si raccomanda una titolazione.</li>
	<li>Risospendere la cultura nel mezzo YEPD-uridina, utilizzando HEPES (50 mM, pH 7.5) come agente tampone e incubare la coltura a 37 ° C per indurre la formazione di ife. Verifica ifale formazione sotto un microscopio a 100 ingrandimenti. Formazione ifale è visibile 5 h dopo la coltura a 37 ° C; Tuttavia, utilizzare le celle 16 h dopo incubazione a 37 ° C quando la percentuale ifale raggiunge quasi il 95% della coltura totale.</li>
	<li>Per arricchire ulteriormente la preparazione in concentrazione ifale, centrifuga aliquote della cultura a 3.300 x g per 5 min. eliminare il supernatante e risospendere il pellet in PBS sterile ad una concentrazione di 1 x 108 IFE/mL.</li>
</ol>2. cutanea profonda iniezione
<ol><li>24 h prima della procedura di infezione, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e poi radere il fianco dei topi utilizzare un tagliacapelli elettrico. Nota: Dopo qualsiasi procedura che coinvolge l'anestesia, posizionare i topi sotto una lampada di riscaldamento fino a quando non hanno recuperato in modo efficiente.</li>
	<li>Riposare i topi per 24 h evitare qualsiasi infiammazione dovuto il processo di rasatura.</li>
	<li>24 h dopo la procedura di rasatura, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).</li>
	<li>Controllare il riflesso di zampa per garantire che i topi sono anestetizzati. Valutare il riflesso di zampa pinzando saldamente la zampa. Se l'anestesia è raggiunto, l'animale non sente dolore e non si muove.</li>
	<li>Iniettare albicans del c. IFE nel derma profondo utilizzando una siringa da insulina 0,3 mL con un ago di 30 x 8 mm in un volume finale di 50 µ l/iniezione, corrispondente a 5 x 106 IFE/iniezione.<ol>
<li>Tendere la pelle del fianco rasato utilizzando due dita al fine di iniettare il volume direttamente nel derma profondo. Inserire l'ago con un angolo di 10-15° con la smussatura dell'ago rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Con questa angolazione, l'agente patogeno sarà iniettato con una profondità di circa 300-500 µm. Per garantire che l'iniezione è ben eseguita, verificare che la forma volume iniettato un bump che è assorbita qualche min dopo l'iniezione. Nota: L'urto formata dopo l'iniezione sarà di circa 1 cm2. Questa è l'area che verrà rimosso al punto di tempo designato per l'analisi molecolare o istologica.</li>
		<li>Per intervalli di tempo di meno di 24 h (consigliato) è possibile delimitare la zona di infezione con un pennarello, poiché l'urto formata con l'iniezione persiste per alcuni minuti, dopo di che viene assorbito. Per intervalli di tempo di 24 ore o più, questo passaggio non è necessario, perché o un'ulcera o una ciste sarà chiaramente visibile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. raccolta e preparazione per colorazione istologica del campione
<ol><li>Eutanasia i topi secondo procedure istituzionali.</li>
	<li>Utilizzando pinze chirurgiche, tirare la pelle al confine del sito iniettato, precedentemente contrassegnato con il pennarello. Utilizzando le forbici chirurgiche, accise sul sito infetto dal taglio di pelle che segue la linea tracciata. Nota: Fare attenzione a separare la pelle dal peritoneum usando le forbici punta rotonda.</li>
	<li>Immergere la pelle in uno stampo di base USA e getta riempito con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto, con il lato interno della pelle rivolto verso l'alto. Congelare il campione in azoto liquido fino a quando il composto diventa bianco. Non lasciate che l'azoto liquido coprire il campione prima di esso è completamente congelato come questo danneggerebbe il campione. Nota: attenzione! Durante la fase 3.3, indossare una maschera facciale per la protezione da azoto liquido.</li>
	<li>Se gli esempi non vengono utilizzati immediatamente per la preparazione del vetrino, memorizzarle rapidamente a-80 ° C. Nota: Campioni possono essere conservati a-80 ° C a tempo indeterminato.</li>
</ol>4. preparazione dei vetrini
<ol><li>Tagliare il campione a metà per preparare le fettine per istologia a partire dal centro del campione.</li>
	<li>Tagliare fette spesse 5-µm con un criostato. Nota: Per campioni di pelle, la temperatura del criostato deve non essere supera a-25 ° C. Un' più alta temperatura causerebbe una fusione parziale di H-personalizzazione e pertanto i campioni sarebbero non essere mantenuti nella giusta posizione durante la procedura di taglio.</li>
	<li>Utilizzare vetrini caricati positivamente per raccogliere le fette.</li>
	<li>Se le fette raccolte non vengono utilizzate subito dopo la preparazione, li conservare a-20 ° C. A questo punto, fette possono essere memorizzati a-20 ° C a tempo indeterminato.</li>
</ol>5. ematossilina ed eosina
<ol><li>Macchia le diapositive mediante immersione in ematossilina di Gill per 4 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.</li>
	<li>Macchia che le diapositive mediante immersione in soluzione di eosina Y per 1 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min, sciacquare le diapositive utilizzando acqua distillata prima di continuare il protocollo.</li>
	<li>Disidratare mediante immersione in aumento in serie delle concentrazioni delle soluzioni di etanolo (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Immergere i vetrini per 15 s in ogni soluzione di etanolo.</li>
	<li>Cancellare le diapositive per almeno 2 min per immersione in un agente di compensazione istologico.</li>
	<li>Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e vetrini coprioggetto.</li>
	<li>Acquisire immagini delle diapositive con scanner per diapositive un microscopio a un ingrandimento 40x.</li>
</ol>6. acido periodico di Schiff (PAS) colorazione
<ol><li>Difficoltà le diapositive con ≥ 99.5% acetone a temperatura ambiente per 1 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 1 min.</li>
	<li>Macchia le diapositive mediante immersione in soluzione di acido periodico (1 g/dL) per 5 min, lavare i vetrini in 3 cambi di acqua distillata.</li>
	<li>Macchia le diapositive per immersione nel reattivo di Schiff per 15 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.</li>
	<li>Colorare i vetrini mediante immersione in ematossilina di Gill per 5 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 30 s.</li>
	<li>Disidratare i vetrini mediante immersione in 3 cambi di etanolo al 100%. Immergere i vetrini per 15 s ogni volta.</li>
	<li>Cancellare le diapositive per almeno 2 min per immersione in un agente di compensazione istologico.</li>
	<li>Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e vetrini coprioggetto.</li>
	<li>Acquisire immagini delle diapositive con scanner per diapositive un microscopio.</li>
</ol>7. raccolta e preparazione per estrazione del RNA del campione
<ol><li>Eutanasia i topi secondo procedure istituzionali. Rimuovere i campioni di pelle come descritto al punto 3.2.</li>
	<li>Immergere i campioni in una provetta da 2 mL-salvapercussore con 1 mL di reagente per l'estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium acido. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e i campioni possono essere conservati a-80 ° C.</li>
	<li>Tagliare il campione in pezzi di circa 0,2 cm2 utilizzando pinze chirurgiche. Nota: attenzione! La maggior parte dei reagenti per isolamento del RNA sono tossiche e mutagene. Punti 7.3 e 7.4 deve essere fatto sotto una cappa aspirante.</li>
	<li>Smash il campione con un laminatoio del branello ad una velocità di 20 oscillazioni/s per 20 min. in alternativa, un vasaio meccanico possa essere utilizzato.</li>
	<li>Controllare l'effettiva omogeneizzazione dei campioni cercando la presenza di parti intatte della pelle. Ripetere questo passaggio se i campioni non sono completamente omogeneizzati.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 16.000 x g per 1 min. tenere i surnatanti estrazione del RNA e scartare il pellet. Questo passaggio viene eseguito per eliminare peli e detriti che potrebbero bloccare le colonne di estrazione.</li>
	<li>Procedere con l'estrazione di RNA mediante RNA purificazione colonne14.</li>
	<li>Utilizzare uno spettrofotometro per valutare la concentrazione e purificazione di RNA. Se RNA estratti non vengono utilizzati immediatamente per la preparazione di cDNA, conservare i campioni a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li>
<li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178391">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li>
<li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals%3A+Analysis+of+24%2C179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Romani, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14661066">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Candida+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li>
<li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li>
<li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li>
<li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+%28B7-2%29%2C+but+not+CD80+%28B7-1%29%2C+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li>
<li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li>
<li>Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+role+of+immune-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li>
<li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li>
<li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li>
<li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/infectdis/Abstract/2010/07000/Candida_albicans_Skin_Abscess_in_a_Heart.6.aspx">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li>
<li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+theory%3A+20+years+later%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287(2012).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui abbiamo descritto un metodo di c. albicans infezione per studiare il processo infiammatorio che è iniziato al fungina ingresso nel derma profondo.
Anche se la formazione di ascesso della pelle è un evento relativamente raro su c. albicans infezione15, iniezione del fungo direttamente nel derma profondo permette non solo lo studio della formazione di ascesso fungoso-driven, ma anche l'analisi di specifici immune cellule che partecipano per contenere...

Il corpo umano è ricoperto da un numero estremamente elevato di microrganismi. La superficie della pelle è l'habitat di quasi 1 milione di batteri per centimetro quadrato1. Questo numero, tuttavia, non riflette la varietà di microrganismi che colonizza la pelle. Oltre ai batteri, il corpo umano è colonizzato da numerose specie fungine, tra cui c. albicans, che è in grado di sopravvivere sia presso le mucose e la pelle livello2.
Negli ultimi anni, la percentuale di persone con diagnosticata di infezioni fungine è enormemente aumentato. Ciò è dovuto principalmente al maggior numero di persone immunocompromised, cioè, pazienti HIV-positivi e pazienti che sono passati attraverso la chemioterapia o farmaci immunosoppressori dopo trapianto3. In uno studio di sorveglianza effettuato negli Stati Uniti, Wisplinghoff et al hanno mostrato che il 9,5% delle infezioni nosocomiali flusso sanguigno erano causati da Candida specie4. Dovuto il caso aumentato di infezioni fungine e soprattutto per l'elevata percentuale di specie di Candida trovate durante infezioni del torrente sanguigno, capire come questo agente patogeno sfugge al controllo del sistema immunitario è estremamente importante.
C. albicans è un fungo dimorphic che cresce in diverse forme morfologiche come lievito, blastospores, pseudoife ed ife a seconda le condizioni ambientali5. Nella sua forma ifale, albicans del c. dimostra la sua capacità di invasività più alto e ha la capacità di penetrare l' epitelio6.
Infezioni da c. albicans sono stati studiati utilizzando diversi approcci sperimentali. Il modello più comune di infezione è l'iniezione endovenosa di c. albicans lievito7. Tuttavia, questo modello non prendere in considerazione tutti i processi che accadono prima il fungo riesce a diffondersi nel flusso sanguigno. Un altro modello sfrutta la capacità dei albicans del c. di invadere l'epitelio. Questo metodo, noto anche come la carta vetrata modello8, è stato sviluppato da Gaspari, et al. , 1998,9e consiste nell'usare la carta vetrata per abradere la pelle, eliminando così lo strato corneo prima di applicare i albicans del c.. Questa procedura permette al fungo di penetrare l'epitelio, consentendo così l'analisi delle capacità invasiva di questo agente patogeno. Infine, altri modelli di infezioni per la gastrointestinale10 e respiratorie11 sono stati utilizzati in diversi studi.
La formazione di una ferita (come nel modello di carta vetrata) provoca l'attivazione di parecchie vie, compreso il reclutamento delle cellule immuni e attivazione, al fine di promuovere la guarigione di processo12. Questo può alterare o mascherare la risposta immunitaria in particolare contro l'agente patogeno, così conducendo alla confusione risultati.
Qui descriviamo un metodo di infezione della pelle che evita la formazione di ferita iniziale e l'induzione di un ambiente infiammatorio basale. Per mantenere la struttura epiteliale intatta, iniettiamo direttamente albicans del c. nella sua forma ifale nel derma profondo. Anche se una singola iniezione può suscitare lieve infiammazione, la quantità di infiammazione è limitata e limitata rispetto alla formazione di una ferita aperta come nel modello di carta vetrata. L'approccio che descriviamo qui permette lo studio della risposta immunitaria all'infezione fungina e diffusione, evitando l'ambiente infiammatoria eccessiva e preesistente causata da danni meccanici.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone ECB4053L</td><td></td><td>caldo in 37 gradi C bagno prima dell'uso</td></tr><tr><td>Composti H-OCT</td><td>laboratori histo-line</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxilyn</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di eosina Y,</td><td>laboratori isto-line</td> alcolici <td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr>laboratori<td></td><td></td> <td>Citro-HISTOCLEAR histo-lineR0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, terreno di montaggio</td><td>bio-optica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>sistema di colorazione PAS</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Estratto di lievito</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio anidro per biologia</td> <td>molecolareApplichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Provette Safe-Lock 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Tossico, corrosivo e mutageno. Utilizzare tutte le precauzioni necessarie</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>azoto</td><td></td><td></td> liquido <td>Indossare una protezione per gli occhi</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Conteggio delle controparticelle</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtome Cryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,3 ml Siringa da insulina con ago da 30 G x 8 mm...</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiche</tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiche</tr><tr><td>Stampo base monouso</td><td>laboratori histo-line</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per biomicroscopio</td><td>bio-optica</td> caricati positivamente <td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 24 x 50 mm</td><td>termo scientifici</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle candida albicans per analisi istologiche

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

La pelle è un organo estremamente esteso del corpo e, a causa di questa grande superficie, è continuamente esposto a microrganismi. Danni alla pelle possono portare facilmente a infezioni nel derma che può, a sua volta, provoca la diffusione di agenti patogeni nel sangue. Comprendere come il sistema immunitario combatte le infezioni allo stadio molto precoce e come l'host può eliminare gli agenti patogeni è un passo importante per impostare la base per futuri interventi terapeutici. Qui descriviamo un modello di infezione dei albicans del Candida che può visualizzare i processi che si verificano precocemente durante un'infezione, anche quando l'agente patogeno ha superato la barriera epiteliale, come pure la risposta immunitaria da albicans del c. invasione. Abbiamo usato questo modello di infezione per eseguire analisi istologiche che mostrano le cellule immunitarie che infiltrano la pelle così come la presenza e la localizzazione dell'agente patogeno. I campioni raccolti dopo l'infezione possa essere elaborato per l'estrazione di RNA.

Attraverso l'iniezione dell'agente patogeno direttamente nel derma profondo, la morfologia strutturale del tessuto rimane intatto (Figura 1A).
Il mantenimento dell'integrità strutturale della pelle permette la rilevazione delle cellule immuni e loro localizzazione presso il sito di infezione. Il maggiore ingrandimento mostrato in Figura 1B rivela che l'ascesso si compon...

Qui descriviamo un protocollo che permette l'analisi istologica e molecolare dei campioni della pelle dopo iniezione intradermica di Candida albicans . Questo protocollo mantiene l'integrità strutturale della pelle e permette per la localizzazione di cellule del sistema immunitario del tessuto-residente o recentemente reclutate come pure la distribuzione di agente patogeno.

Profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle Candida albicans per analisi istologiche

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'attivazione del sistema immunitario durante le infezioni della pelle iniettando Candida albicans per preservare l'architettura della pelle e la localizzazione di specifiche cellule immunitarie e non immunitarie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo immunologico come la natura e la localizzazione delle cellule immunitarie reclutate durante le infezioni cutanee e i principali mediatori coinvolti. Il vantaggio principale di questa tecnica è il mantenimento dell'architettura strutturale della pelle dopo l'iniezione fungina che ci permette di comprendere la localizzazione di ogni tipo di cellula immunitaria.A dimostrare parte della procedura sarà Giulia Stamerra, dottoranda del laboratorio della professoressa Marina Vai. Per iniziare, inoculare il ceppo CAF3-1 di C.Albicans in provette contenenti un terreno ricco integrato con 50 milligrammi per litro di uridina e coltura a 25 gradi Celsius. In queste condizioni, il C.albicans cresce come lievito.Monitorare la coltura utilizzando un analizzatore di contatori cellulari o uno spettrofotometro per misurare la concentrazione cellulare. Quando la coltura raggiunge otto volte 10 al sesto di cellule per millilitro, raccogliere il campione. Utilizzare il terreno di uridina YEPD con Hepes come agente tampone per risospendere le cellule e incubarle a 37 gradi Celsius per indurre la formazione di ife.Dopo cinque ore di coltura, quando le ife dovrebbero essere visibili, al microscopio con ingrandimento 100X controllare la formazione delle ife. Coltura delle cellule per un totale di 16 ore, momento in cui il 95% della coltura avrà formato ife. Per arricchire ulteriormente la concentrazione di ife, centrifugare le aliquote della coltura a 3.300 volte g per cinque minuti.Scartare il surnatante e utilizzare PBS sterile per risospendere il pellet a una concentrazione di una volta 10 per l'ottava ifa per millilitro. Dopo aver anestetizzato un topo rasato secondo il protocollo di testo, controlla il riflesso della zampa per assicurarti che l'animale sia profondamente sedato. Per iniettare le ife di C. albicans nel derma profondo, utilizzare due dita per tendere la pelle del fianco rasato, quindi inserire un ago da otto millimetri calibro 30 collegato a una siringa da insulina da 0,3 millilitri con un angolo da 10 a 15 gradi, con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto, e iniettare un volume finale di 50 microlitri corrispondente a cinque volte 10 alla sesta ifa.Se l'angolo di iniezione è superiore a 15 gradi, l'agente patogeno verrà iniettato troppo in profondità nel derma, rischiando di danneggiare il peritoneo e, soprattutto, perdendo la possibilità di studiare le infezioni in modo specifico a livello cutaneo. A questo angolo, l'agente patogeno verrà iniettato a una profondità di circa 300-500 micron. Per assicurarsi che l'iniezione sia ben eseguita, verificare che il volume iniettato formi una protuberanza che viene assorbita dopo pochi minuti.Per punti temporali inferiori a 24 ore, utilizzare un pennarello per contrassegnare l'area dell'infezione, poiché la protuberanza formata con l'iniezione persiste per alcuni minuti. Per i punti temporali di 24 ore o più tardi, questo passaggio non è richiesto, perché un'ulcera o una cisti saranno chiaramente visibili. Dopo l'eutanasia dei topi utilizzando le linee guida istituzionali, con una pinza chirurgica tirare la pelle al bordo del sito iniettato precedentemente segnato con il pennarello, quindi, utilizzando le forbici chirurgiche, asportare il sito infetto tagliando la pelle seguendo la linea segnata.Immergere la pelle con il lato interno rivolto verso l'alto in uno stampo di base monouso riempito con composto O.C.T. Congelare il campione in azoto liquido fino a quando il composto diventa bianco. Non lasciare che l'azoto liquido copra il campione prima che sia completamente congelato, poiché ciò danneggerebbe il campione.Per preparare i vetrini, partendo dal centro del campione tagliare il campione a metà per preparare le fette per l'istologia, quindi, utilizzando un criostato, tagliare fette spesse cinque micron. Utilizzare vetrini da microscopio caricati positivamente per raccogliere le fette. Per eseguire la colorazione H&E, immergere i vetrini nell'ematossilina di Gill per quattro minuti, quindi lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti.Immergere i vetrini in una soluzione di eosina-Y per un minuto, lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti, quindi utilizzare acqua distillata per sciacquare i vetrini. Successivamente, disidratare i campioni immergendoli in una serie di etanolo per 15 secondi ciascuno. Per pulire i vetrini, trasferirli in un agente di pulizia istologica per almeno due minuti, quindi utilizzare il mezzo di montaggio e i vetrini coprioggetti per montare i campioni.Utilizzare uno scanner per vetrini da microscopio con ingrandimento 40X per visualizzare i vetrini. Eseguire la colorazione con soluzione acida mestruale o PAS utilizzando acetone a temperatura ambiente per fissare i vetrini per un minuto, quindi utilizzare acqua corrente del rubinetto per lavare i vetrini per un minuto. Immergere i vetrini in PAS per cinque minuti, quindi utilizzare tre cambi di acqua distillata per lavare i campioni.Quindi immergere i vetrini nel reagente di Schiff per 15 minuti, quindi utilizzare acqua corrente del rubinetto per lavare i vetrini per cinque minuti. Immergere il campione nell'ematossilina di Gill per cinque minuti per colorarli, quindi lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per 30 secondi. Disidratare i campioni mediante immersione in tre cambi di etanolo al 100% per 15 secondi ciascuno, quindi immergere i vetrini in un agente di pulizia istologica.Con il mezzo di montaggio e i vetrini coprioggetto, montare i campioni eliminati, quindi utilizzare uno scanner per vetrini da microscopio per visualizzare i campioni. Dopo l'eutanasia dei topi e la rimozione dei campioni di pelle come dimostrato in precedenza in questo video, immergere i campioni in una provetta da due millilitri con tappo a scatto con un millilitro di reagente per l'estrazione acida di guanidinio tiocianato fenolo cloroformio. Usa una pinza chirurgica per tagliare il tessuto in pezzi di 0,2 centimetri quadrati.Con un mulino a perline, frantumare i campioni a 20 oscillazioni al secondo per 20 minuti. Se sono ancora presenti pezzi di pelle intatti, ripetere la frantumazione fino a quando il campione non è completamente omogeneizzato. Centrifugare i campioni a 16.000 volte g per un minuto.Conservare i surnatanti per l'estrazione dell'RNA e scartare il pellet. Questo passaggio viene eseguito per eliminare peli e detriti che potrebbero interferire con il processo di estrazione. Dopo aver estratto l'RNA con una colonna di purificazione, utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA.Il mantenimento dell'integrità strutturale della pelle consente la rilevazione delle cellule immunitarie e la loro localizzazione nel sito di infezione. Questo elevato ingrandimento rivela che l'ascesso è composto principalmente da PMC che contengono la diffusione dell'agente patogeno attraverso il suo confinamento nel sito di infezione. Anche le aree circostanti l'ascesso sono arricchite da PMC.In questa figura, la colorazione PAS, che conferisce al fungo un colore viola-magenta, mostra chiaramente che il patogeno è confinato all'interno dell'ascesso formato dal reclutamento dei granulociti. C. albicans è chiaramente visibile a un ingrandimento più elevato e sembra essere circondato da cellule necrotiche e immunitarie. All'inizio del processo di infezione, il reclutamento delle cellule immunitarie porta alla formazione dell'ascesso.Da 48 a 72 ore dopo l'infezione, sono state visualizzate la rottura delle strutture cutanee e la formazione di una cicatrice a causa della fase di guarigione successiva all'espulsione dell'agente patogeno. Come mostrato qui, i topi wild type mostrano un processo ulcerativo che aumenta nel tempo. In seguito a trattamenti specifici o carenze genetiche, la formazione dell'ulcera può essere ridotta e/o abrogata.In alcuni casi, invece di un'ulcera, si formerà una cisti come si vede qui. Dopo questa procedura di infezione, è possibile eseguire altri metodi come l'estrazione di proteine per rispondere a ulteriori domande come l'attivazione di specifici percorsi intracellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come eseguire l'iniezione di C.Albicans nella pelle per studiare il coinvolgimento del sistema immunitario durante l'infezione microbica senza interrompere l'architettura dell'epitelio.Non dimenticare che lavorare con i reagenti per le estrazioni di RNA può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di una cappa aspirante.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra lo sviluppo di un modello murino in vivo per studiare la formazione di biofilm di Candida albicans nel tessuto sottocutaneo. L'esperimento prevede l'impianto di dispositivi infetti da Candida nella regione posteriore dell'animale per lo sviluppo del biofilm.

Candida albicans Formazione di biofilm in un modello murino in vivo

In vivo le interazioni spazio-temporali del patogeno e delle difese immunitarie a livello della mucosa non sono facilmente visualizzabili negli ospiti vertebrati esistenti. Il metodo qui presentato descrive una piattaforma versatile per studiare la candidosi mucosa nei vertebrati vivi utilizzando la vescica natatoria del giovane zebrafish come sito di infezione.

Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

Presentiamo una procedura sperimentale di sviluppo del biofilm di Candida albicans in un modello sottocutaneo murino. I biofilm fungini sono stati quantificati determinando il numero di unità formanti colonie e mediante un imaging a bioluminescenza non invasivo, in cui la quantità di luce prodotta corrisponde al numero di cellule vitali.

Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

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Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare Candida albicans forma cellulare e localizzazione nel tratto gastrointestinale dei mammiferi.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

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Uso dell'imaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero

L'infezione dell'articolazione periprotesica (PJI) causata da agenti patogeni pericolosi è comune in ortopedia clinica. I modelli animali esistenti non sono in grado di simulare accuratamente la situazione reale della PJI. Qui, abbiamo stabilito un modello murino di PJI associato al biofilm di Candida albicans per la ricerca e lo sviluppo di nuove terapie per la PJI.

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Stabiliamo un modello murino di infezione correlata al catetere (CRI) associata a C.albicans, in cui si forma un biofilm sul catetere e l'interazione tra C.albicans e l'ospite è ben correlata con l'IRC clinico. Questo modello aiuta a selezionare le terapie per l'IRC associato al biofilm di C.albicans , gettando le basi per la trasformazione clinica.

Un modello di infezione da Candida albicans correlato al catetere nel topo

Questo protocollo descrive l'applicazione della terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) in un modello murino di candidosi orale. L'aPDT è stata eseguita utilizzando una miscela solubile in acqua di curcuminoidi e luce LED blu.

Terapia fotodinamica antimicrobica mediata da curcuminoidi su un modello murino di candidosi orale

Il presente protocollo descrive un modello murino che impiega l'impianto dorsale sottocutaneo per studiare le infezioni associate all'impianto, consentendo un'indagine completa dei meccanismi fisiopatologici e supportando lo sviluppo di criteri diagnostici con strategie terapeutiche mirate.

Modello animale di infezioni associate all'impianto nei topi

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Profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle Candida albicans per analisi istologiche

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