Name: Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri un metodo rapido non enzimatico per isolare cellule gliali enteriche dalla submucosa intestinale del topo. Questa tecnica utilizza incubazioni sequenziali con EDTA per ottenere colture altamente arricchite per analisi funzionali.

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Gli autori desiderano riconoscere sostegno da DK045729 R37 (a JLM), AR060837 R01 (a HX) e l'Università del Michigan gastrointestinale Research Center molecolare Core P30 DK034933.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dalla Commissione dell'Università del Michigan per l'uso e la cura degli animali.
1. preparazione di soluzioni di laminina e Sterile poli-D-lisina (PDL)
<ol><li>Almeno un giorno prima dell'isolamento delle cellule, preparare poli-D-lisina (PDL) e laminin rivestito di piastre. Nota: Sia 6 pozzetti e 12-pozzetti piatti erano preparati a seconda degli obiettivi sperimentali. In genere, sono stati utilizzati 12-pozzetti per l'analisi quantitativa mediante western blot; considerando che, in piastre da 6 pozzetti sono state utilizzate per tenere sterilizzato nell'autoclave (sterile) vetrini coprioggetto per immunoistochimica. piastre da 24 pozzetti sono state utilizzate per cultura EGCs per Ca2 + imaging di cambiamento continuo.</li>
	<li>Diluire le soluzioni di riserva con il grado di coltura tissutale ultrapura, privo di DNasi e RNAsi-libera dell'acqua in una cappa di coltura del tessuto con aria filtrata HEPA.</li>
	<li>
Lamelle di vetro di sterilizzazione
	<ol>
<li>Tenere il coprioggetto con pinze sterili e immergere i vetrini coprioggetti in un becher di etanolo al 100% per 15 min. Consenti l'etanolo evaporare nella coltura del tessuto cappa e poi posto nella piastre da 6 pozzetti.</li>
		<li>In alternativa, posizionare diverse lamelle individualmente su 2 mm spessore carta assorbente in un contenitore di plastica e poi autoclave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rivestimento piastre
Nota: eseguire questi passaggi sotto cappa a flusso laminare sterili per coltura.
<ol><li>Scongelare 1 mg/mL di brodo di PDL e diluire 01:10 con acqua grado di coltura del tessuto sterile, in modo che la concentrazione finale è 100 µ g/mL. Uso 2 mL ogni pozzetto per rivestire piastre da 6 pozzetti, 1ml per coprire un pozzetto di una piastra 12-pozzetti e 0,5 mL per un pozzetto delle piastre a 24 pozzetti. Memorizzi il rimanente PDL diluito nelle 12 mL aliquote a-20 ° C.</li>
	<li>Dopo aver lasciato il PDL rivestire i pozzetti per almeno 1 h, rimuovere il PDL con una pipetta sterile. Le piastre per aria, lasciare asciugare completamente sotto cappa a flusso laminare di coltura del tessuto. Nota: Dopo aver rimosso la soluzione PDL con una pipetta sterile, può essere usato due volte più entro 1 settimana dopo passando attraverso un filtro da 0,22 µm e conservazione a 4 ° C.</li>
	<li>Scongelare il brodo laminin sul ghiaccio per evitare la formazione di un gel. Nota: Non diluito laminin diventa solido quando riscaldato sopra 8 ° C.</li>
	<li>Diluire la laminina stock (0,5 mg/mL) 01:50 con sterile di Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) per ottenere una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Memorizzi la laminina diluito nelle 12 mL aliquote a-20 ° C.</li>
	<li>Aggiungere laminin diluiti nei pozzetti contenenti secchi PDL. Usare 1 mL per coprire la superficie di 6 pozzetti e 0,5 mL per coprire il fondo delle piastre 12-pozzetti. Per vetrini coprioggetti, aggiungere 400 µ l di laminina diluito a lamelle per ottenere copertura di superficie.</li>
	<li>Incubare le piastre a 37 ° C per 2 h, se la piastra viene utilizzata lo stesso giorno (rivestimento rapido). In caso contrario, sigillare le piastre con involucro di plastica e conservare durante la notte a 4 ° C (rivestimento lento). Nota: Sigillatura è fondamentale per evitare l'essiccazione e la contaminazione.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di laminina accuratamente con una pipetta per evitare di graffiare la superficie. Lavare delicatamente i pozzetti tre volte con DPBS sterile.</li>
	<li>Aggiungere media crescita gliale completa a ciascun bene e mantiene le piastre a 37 ° C fino al momento di aggiungere la sospensione EGC. Nota: Poly-D lisina e laminin rivestito lastre possono essere conservati per 3 giorni a 4 ° C. Ungere le piastre diversi giorni di anticipo e quindi conservare a 4 ° C, lavare i piatti con DPBS sterile tre volte. Aggiungere 2 mL di DPBS sterile ad ogni pozzetto dopo il lavaggio finale. Sigillare la piastra con parafilm e conservare a 4 ° C. È essenziale per garantire che il laminin non si asciughi.</li>
</ol>3. preparazione delle soluzioni di isolamento
<ol><li>Preparare la soluzione di EDTA/HEPES/DPBS dissociazione. Per 500 mL di soluzione, è necessario utilizzare DPBS sterile (senza calcio e magnesio) per ottenere una soluzione finale di 10 mM HEPES e 5mm EDTA. A 490 mL della DPBS, aggiungere 5 mL di tampone HEPES 1 M e 5 mL di soluzione madre di EDTA 0.5 M. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Preparare il supporto di risospensione delle cellule glial utilizzando i reagenti elencati nella tabella 1.</li>
	<li>Preparare i supporti di crescita gliale utilizzando i reagenti elencati nella tabella 2. Nota: Supporto di crescita gliale contenente GDNF possa essere memorizzati per una settimana a 4 ° C.</li>
</ol>4. rimozione del segmento intestinale
Topi sono stati ammessi Accesso gratuito per il cibo e l'acqua prima del euthanization dal metodo di caduta di isoflurano e rimozione di un organo vitale. Sono stati utilizzati topi C57BL/6 maggiori di 8 settimane di età. Entrambi i sessi sono stati utilizzati senza notevoli differenze nella preparazione.
<ol><li>Eutanasia il mouse con un sovradosaggio di isoflurane e posto in posizione supina in un vassoio per dissezione. Appuntare le estremità e sterilizzare l'addome con etanolo al 70%. Tenda la pelle con il forcipe e quindi aprire l'addome con le forbici.</li>
	<li>Sollevare il fegato e identificare il distale dello stomaco/piloro. Quindi rimuovere 7 centimetri di intestino prossimale. Fare attenzione a non lacerare l'intestino.</li>
	<li>
Tenere premuto il piloro con forcipe mentre cattura distanza mesentery.
	<ol>
<li>Utilizzare una dissezione smussa con il dorso della forbice per raschiare via pancreas aderente.</li>
		<li>Inserire il segmento intestinale in DPBS ghiacciata senza Ca2 + o Mg2 + (Figura 1A). Nota: Altri segmenti dell'intestino o del colon possono essere rimosso anche utilizzando la stessa tecnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usare una siringa da 5 o 10 mL attaccata ad un ago di 20 G di estremità smussata per scovare il contenuto fecale con ghiaccio freddo DPBS (Figura 1B).</li>
	<li>Dividere l'intestino in segmenti di 3cm per rimuovere il muscolo longitudinale utilizzando la tecnica descritta inizialmente da Smith et al. 12 e modificati nel Sundaresan et al. 10. Nota: Segmenti intestinali da fino a due topi sono utilizzati per 30 mL di soluzione di isolamento di HEPES/EDTA/DPBS.</li>
	<li>Rompere fuori circa 4 cm per separare il bastone di legno dalla punta di cotone. Immergere il bastone di legno in DPBS (Figura 1).</li>
	<li>Infilare uno dei segmenti intestinali senza intoppi sulla chiavetta bagnata (Figura 2A-C).</li>
	<li>Rimuovere il mesentere aderente ancora attaccato utilizzando pinze becchi (Figura 2D).</li>
	<li>
Utilizzare una lama di rasoio pulita o bisturi per rendere due Nick longitudinale lungo l'intestino dove il mesentere è stato attaccato (Figura 2E).
	<ol>
<li>Bagnate la punta di cotone con DPBS. Strofinare la punta di cotone bagnato longitudinalmente lungo il muscolo per allentare longitudinale del muscolo/mienterici (LMMP). Quindi spostare la punta di cotone orizzontalmente per stuzzicare via il LMMP dal muscolo circolare lungo la lunghezza del segmento intestinale durante la rimozione di LMMP.</li>
		<li>Tenere la punta del bastone tra il pollice e l'indice mentre stabilizzando il segmento con il dito medio e quarto (Figura 2F). Al termine, il LMMP si staccano facilmente il segmento intestinale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scartare il LMMP spogliato dal tubo intestinale e collegato al tampone di cotone, a meno che la raccolta di EGCs dal plesso mioenterico è desiderato.</li>
	<li>Utilizzare una lama di rasoio per flay Apri il segmento intestinale in senso longitudinale per togliere il bastone di legno.</li>
	<li>Conservare il tessuto intestinale spogliato (prevalentemente mucosa e sottomucosa più muscolo circolare) in DPBS sul ghiaccio. Ripetere i passaggi 4.4 – 4,11 per tutti i segmenti intestinali sono preparati.</li>
</ol>5. rimozione della Mucosa epiteliale
<ol><li>Tagliare l'intestino in piccoli pezzi di ~0.5 cm con forbice.</li>
	<li>Posizionare il tessuto in una provetta conica per centrifuga sterile 50 mL contenente 30 mL di soluzione di EDTA/HEPES/DPBS ghiacciata.</li>
	<li>Roccia la soluzione contenente tessuto a 4 ° C per 10 min a ~ 60 si inclina al minuto.</li>
	<li>Inumidire preventivamente una pipetta di plastica da 5 mL pipettando il buffer EDTA/HEPES/DPBS su e giù per una sola volta e quindi utilizzare la pipetta pre-umidificata per pipettare il tessuto e tampone sospensione su e giù (triturazione) 20 volte per sloggiare il mucosa epiteliale.</li>
	<li>Raccogliere il tessuto dall'incubazione di EDTA versando il composto attraverso un colino di cella di 100 µm in nylon. Scartare il torbido muco-riempita flusso continuo (Figura 3).</li>
	<li>Posizionare il tessuto conservato nel colino in una nuova provetta conica per centrifuga di 50 mL contenente 30 mL di ghiaccio freddo EDTA/HEPES/DPBS utilizzando pinze becchi.</li>
	<li>Ripetere l'incubazione di EDTA/HEPES/DPBS una seconda volta da dondolo il tessuto a 4 ° C per 10 min a ~ 60 si inclina al minuto per rimuovere disattivare ulteriore mucosa epiteliale.</li>
	<li>Inumidire preventivamente una pipetta da 5 mL con il buffer e quindi dispensare la sospensione di tessuto su e giù per 20 volte per sloggiare le cellule mucose. Nota: Il tessuto tende a bastone all'interno della pipetta come più dell'epitelio viene rimosso.</li>
	<li>Raccogliere il tessuto dopo la seconda incubazione versando il composto attraverso un colino di cella in nylon di 100 µm e scartare il flusso attraverso. Il secondo passaggio dovrebbe essere notevolmente meno torbido rispetto alla prima (Figura 3).</li>
	<li>Ripetere le incubazioni di EDTA 10 min fino a quando la soluzione è quasi chiaro (incubazioni di circa 3 o 4 a seconda della quantità di tessuto e l'efficacia della triturazione) (Figura 3).</li>
</ol>6. raccolta di cellule gliali enteriche dalla Lamina Propria e sottomucosa
<ol><li>Trasferire il tessuto dal filtro in nylon in una provetta conica per centrifuga 15 mL contenente 5 mL della soluzione di recupero cellulare disponibile in commercio e rock per 25-30 min a 4 ° C.</li>
	<li>
Triturare delicatamente 10x per dissociare le cellule di gliale enteriche da lamina propria.
	<ol>
<li>Filtrare su un filtro di 40 µm e raccogliere il filtrato in una provetta pulita 50 mL.</li>
		<li>Sciacquare il tessuto sul filtro in nylon con 1 mL di DPBS.</li>
		<li>Scartare il tessuto e trasferire i ~ 5 – 6 mL del filtrato in una provetta conica per centrifuga pulito da 15 mL.</li>
		<li>Girare il filtrato a 2.000 x g in una centrifuga di Benna oscillante per 5 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet contenente delle cellule gliale in almeno 1 mL di tampone di risospensione pipettando delicatamente la pallina su e giù con una punta di pipetta 500 µ l. Evitare l'introduzione di bolle. Nota: Regolare il volume di risospensione per il numero di pozzi e piastre. Ad esempio, 1,2 mL per una piastra a 6 pozzetti; 2,4 mL per due piastre da 6 pozzetti; 2,4 mL per una piastra 12-pozzetti.</li>
	<li>Dispensare 200 µ l di sospensione cellulare in ciascun pozzetto del 6 pozzetti o 100 µ l per un PDL-laminina rivestito a 12 pozzetti contenenti glial crescita media.</li>
	<li>Non disturbare i piatti dopo aver aggiunto le cellule per le piastre e immissione nell'incubatore 37 ° C per consentire il massimo numero delle cellule di aderire. Nota: Una preparazione sana delle cellule verrà allegare all'interno di 6 – 8 h ma attendere almeno 24 ore prima di cambiare i media pipettando delicatamente fuori i media insieme a cellule non aderenti.</li>
	<li>Utilizzare le celle per gli esperimenti di 3 – 4 giorni dopo che essi sono posti in coltura (Figura 4). Eseguire analisi immunofluorescente usando gli anticorpi di interesse per specifiche proteine marker (tabella 3). Ad esempio, GFAP, S100b e p75NTR o Sox10 è stata usata qui. E-caderina o anticorpi dell'actina del muscolo liscio alfa sono stati utilizzati per valutare il grado di contaminazione da altri tipi di cellule.</li>
</ol>7. immunofluorescenza colorazione
<ol><li>I media fuori le culture di aspirare e lavare due volte con PBS.</li>
	<li>Difficoltà le culture per 20 min a temperatura ambiente con paraformaldeide al 4%.</li>
	<li>Rimuovere il fissativo e poi lavare 3 volte con PBS.</li>
	<li>Permeabilize le cellule con PBS contenente 0,2% Triton X-100 a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le cellule permeabilized con soluzioni blocchi composto da anti-pollo IgY, anti-coniglio o anti-IgG di topo per 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>
Incubare le cellule con anticorpi primari durante la notte, per esempio, GFAP (1:1, 000).
	<ol>
<li>Sciacquare le cellule 3 volte con PBS. Se l'esecuzione di colocalizzazione procedere a passo 7.7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare la prossima serie di anticorpi primari per almeno 2 ore a temperatura ambiente, ma preferibilmente durante la notte a 4 ° C. Utilizzare una diluizione di 1: 1000 di coniglio anti-S100 o una diluizione di 1: 500 di topo anti-p75NTR. Nota: Tutti gli anticorpi vengono diluiti in PBS.</li>
	<li>Sciacquare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere gli anticorpi primari. Incubare le cellule risciacquate con gli anticorpi secondari etichetta fluorescente appropriati per 2 h a temperatura ambiente (tabella 3).</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS per rimuovere gli anticorpi secondari.</li>
	<li>Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini utilizzando 1-2 gocce di mezzi di montaggio con DAPI e Mostra le cellule sotto un microscopio a fluorescenza.</li>
</ol>8. flusso Cytometry
<ol><li>Rimuovere le cellule gliale aderenti per citometria a flusso, risciacquando le cellule una volta con DPBS e quindi aggiungere 0,25% tripsina-EDTA secondo il protocollo del produttore. Incubare le cellule nella soluzione a 37 ° C per 3 min. Terminate la digestione della tripsina-EDTA raccogliendo le cellule nei media di crescita delle cellule di glial completa.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 5 min e quindi risospendere le cellule in PBS.</li>
	<li>Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 min e poi permeabilize con 0,2% Triton X-100 in PBS come descritto nel punto 7.4.</li>
	<li>Bloccare le cellule con PBS contenente BSA 1% e l'immunoglobulina specifica del tessuto per 20 min, per esempio, asino anti-pollo IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) o asino anti-capra IgG (H + L) (1:1, 000).</li>
	<li>Incubare le cellule con gli anticorpi primari GFAP (1:2, 000), E-caderina (1: 400), l'actina del muscolo liscio come α (1: 500) o PGP 9.5 (1: 500) durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>
Lavare via l'anticorpo con PBS.
	<ol>
<li>Incubare il complesso antigene-anticorpo con anticorpi secondari fluorescente contrassegnati incubati a temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Utilizzare un'aliquota separata di cellule incubate con anticorpo secondario per servire come il controllo di isotipo. Entrambe le popolazioni delle cellule sono lavate e risospesi in PBS prima della citometria a flusso.</li>
		<li>Analizzare le due popolazioni di cellule su un citometro a flusso di gating su cellule vive.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. preparazione del Mouse tessuti dalla hGFAP-Cre:tdTomato topi
Nota: Il cDNA di Lox-STOP-Lox-tdTomato è espresso dal ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) e genera endogeno fluorescenza quando allevato per un mouse che esprimono la Cre ricombinasi (hGFAP-Cre). Analisi in situ viene eseguita mediante la generazione di sezioni di tessuto congelato.
<ol><li>Difficoltà tessuto intestinale in paraformaldeide al 4% per 1 h e quindi disidratare una notte in 1 M saccarosio in PBS.</li>
	<li>Incorporare il tessuto in commercialmente acquistato tessuto di taglio ottimale (OCT) composto composto da 10% di alcool polivinilico e 4,2% polietilene glicole e poi lo snap congelamento in azoto liquido.</li>
	<li>Preparare 5 µm cryosections e poi montare utilizzando un antifade montanti con DAPI.</li>
	<li>Per citometria a flusso, preparare EGCs dalla hGFAP-Cre:tdTomato+ topi come descritto ai punti 4.1 – 6,5.</li>
	<li>Tripsinizzano le cellule dalla piastra dopo 3 giorni nelle colture in passo 8.1 e quindi difficoltà per 10 min in paraformaldeide al 4%.</li>
	<li>Analizzare le cellule isolate da topi Cre negativo in parallelo con cellule isolate dalla hGFAP-Cre:tdTomato+ topi su un citometro a flusso. Nota: I cancelli sono stati costruiti per evitare i detriti e le cellule morte.</li>
</ol>10. Ca2 + Imaging di flusso
<ol><li>Incubare EGCs placcato su una piastra a 24 pozzetti con 3 µM Fluo-4-AM a 37 ° C per 30 min.</li>
	<li>Immagine il segnale di Ca2 + in soluzione di Tyrode commercialmente acquistati utilizzando un microscopio confocale del disco rotante e una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm (F480) dopo l'aggiunta del peptide CCK o gastrina. Analisi delle immagini è stata segnalata in Sundaresan et al. 10 .</li>
</ol>

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<li>Boyen, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+enteric+glia+and+GDNF+during+gut+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation.</a> BMC Gastroenterology. 11, 3(2011).</li>
<li>Rosenbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Myenteric+Glia+during+Acute+Inflammation+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo.</a> Public Library of Science One. 11 (3), e0151335(2016).</li>
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<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Kabouridis, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+keeps+enteric+glial+cells+on+the+move%3B+prospective+roles+of+the+gut+epithelium+and+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system.</a> Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).</li>
<li>Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+neurally+related+laminin+binding+protein+by+neural+crest-derived+cells+that+colonize+the+gut%3A+relationship+to+the+formation+of+enteric+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia.</a> The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

EGCs svolgono un ruolo importante nell'omeostasi dell'intestino, ed è essenziale per isolare e studiarle in vitro. In questo protocollo, un metodo semplice per l'isolamento di EGCs da lamina propria dell'intestino topo adulto è stata introdotta per studiare la funzione gliali enterico.
Rimuovendo il mesentere aderente e LMMP con un tampone di cotone rimuove alcune delle glia inter-myenteric che risiedono tra il muscolo longitudinale e circolare, aumenta l'accessibilità dei buffer alla...

Interesse per la funzione delle cellule gliali enteriche (EGCs) sono costantemente aumentata a causa del loro ruolo riconosciuto in intestino l'integrità e l'omeostasi1,2. Inoltre, EGCs variano in base alla loro posizione lungo la lunghezza del tratto GI3,4. EGCs rilasciare vari fattori trofici, compreso il fattore neurotrofico delle cellule gliali (GDNF), contribuiscono a sventrare motilità1,5 e rispondere a sottoprodotti microbici6,7. Gli studi hanno indicato che la popolazione di EGC è eterogenea e che la loro funzione varia a seconda che siano submucosal o risiedono all'interno del plesso mioenterico1,7. Ad esempio, EGCs all'interno del submucosa contribuiscono a giunzioni strette8. Espressione di GFAP e fosforilazione in EGCs differenziale sono stati collegati alla malattia di Parkinson, suggerendo loro possibile legame con il fenotipo di intestino di questo disordine9. Recentemente, è stato osservato che la perdita della proteina nucleare menin in culture isolate di EGCs da submucosa intestinale prossimale era sufficiente per indurre l'espressione dell'ormone gastrina10. Di conseguenza, è stato proposto che EGCs potrebbe essere l'origine dei gastrinomi duodenali, un tipo di tumore neuroendocrino10. Collettivamente, questi esempi sottolineano l'importanza di studiare il comportamento e la funzione di EGCs isolato in disturbi neuropatici e cancro11.
La sfida nel campo rimane come isolare e studiare uno o entrambi EGC popolazioni in vitro. Lignaggio traccia esperimenti hanno dimostrato che EGCs nel submucosa e della lamina propria provengono da cellule progenitrici nel plesso myenteric7. Anche se ci sono parecchi protocolli di isolamento pubblicati disponibili per generare colture di myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, nessuno è destinato in particolare isolamento della popolazione EGC submucosal/lamina propria. Protocolli esistenti per l'isolamento di EGC, in particolare, utilizzare una combinazione di separazione meccanica o il microdissection del muscolo liscio combinato con dissociazione enzimatica, scartando alla fine lo strato delle cellule della mucosa.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di illustrare i passaggi per isolare non-enzimatico primario EGCs da lamina propria per gli studi in vitro . Poiché non ci sono indicatori che specificamente distinguono myenteric EGCs da quelli nel submucosa, la separazione spaziale della mucosa epiteliale da muscolo liscio è stata sfruttata per isolare EGCs submucosal. Inoltre, combinando chelazione EDTA con dissociazione non enzimatica, EGCs sono stati isolati da sottomucosa in contrasto con il muscolo liscio, che è stato scartato insieme il EGCs inter-myenteric associato. Si è verificato ulteriore separazione della sottomucosa e della lamina propria EGCs coltivando le cellule glial cell-friendly substrati, ad es., poli-D-lisina e laminina.

<table><tbody><tr><td>Poli-D lisina (1 mg/mL stock)</td><td>Sigma</td><td>A-003-E</td><td>Diluire 1:10</td></tr><tr><td>Laminina (0,5 mg/mL stock)</td><td>Sigma</td><td>L4544</td><td>Diluire a 10 & micro; g/mL su ICE</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Lonza</td><td>51201</td><td>Diluire 1:100 in DPBS</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning</td><td>36216004</td><td>Diluire 1:100 in DPBS</td></tr><tr><td>Soluzione di recupero cellulare</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/mL stock)</td><td>Life Technologies</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>GDNF (10 &; micro; g stock)</td><td>Sigma</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM stock)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-GFAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-10004</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-a-Smooth Muscle Actin&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab112022</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Pgp9.5&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-1160</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-E-caderina&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio S100&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab34686</td><td></td></tr><tr><td>Mouse p75 NTR&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MAB5592</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra Anti-Pollo IgY</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino Anti-Capra IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Capra Anti-Topo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Asino Anti-Coniglio IgG</td><td>Invitrogen</td><td>R-37119</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade Reagente con DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (Amfotericina B) 250 &micro; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>L-Fura-2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>CCK peptide</td><td>Anaspec, Fremont, CA</td><td>AS-20741</td><td></td></tr><tr><td>Peptide di gastrina (gastrina-17)</td><td>Abbiotec, Bloomington, IN</td><td>350188</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Celll Strainer (100 &micro; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Filtro in Nylon Mesh Celll (40 & micro; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica monouso 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule glial enteriche da submucosa e lamina propria del topo adulto

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

Il sistema nervoso enterico (ENS) è costituito da neuroni e cellule gliali enteriche (EGCs) che risiedono all'interno della parete del muscolo liscio, sottomucosa e della lamina propria. EGCs svolgono un ruolo importante nell'omeostasi dell'intestino attraverso il rilascio di vari fattori trofici e contribuire all'integrità della barriera epiteliale. Maggior parte degli studi delle culture primarie di gliale enteriche utilizzare cellule isolate dal plesso mioenterico dopo dissociazione enzimatica. Qui, un metodo non-enzimatici per isolare e cultura EGCs da submucosa intestinale e della lamina propria è descritto. Dopo la rimozione manuale dello strato muscolare longitudinale, EGCs furono liberati dalla lamina propria e sottomucosa utilizzando sequenziale incubazioni tamponata HEPES EDTA seguite da incubazione in soluzione di recupero di cella non enzimatici commercialmente disponibile. Le incubazioni di EDTA sono stati sufficienti per la maggior parte della mucosa epiteliale dalla lamina propria, permettendo la soluzione di recupero di cella liberare il EGCs submucosal della striscia. Qualsiasi residuo di lamina e muscolo liscio è stato scartato insieme glia myenteric. EGCs facilmente sono stati identificati dalla loro capacità di esprimere la proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Solo circa il 50% della sospensione delle cellule contenute cellule GFAP + dopo aver completato le incubazioni tessuto e prima della placcatura sul substrato di poli-D-lisina/laminin. Tuttavia, dopo 3 giorni di coltura le cellule in fattore neurotrophic derivato da cellule gliali (GDNF)-contenenti terreni di coltura, la popolazione delle cellule aderenti alle piastre rivestite con substrato composto da > 95% glia enterica. Abbiamo creato una linea di topo ibrido allevando un mouse hGFAP-Cre per la linea di reporter ROSA-tdTomato di monitorare la percentuale di cellule GFAP + usando la fluorescenza delle cellule endogene. Così, non-myenteric glia enterica può essere isolato dai metodi non-enzimatici e coltivata per almeno 5 giorni.

Le preparazioni sono state considerate infruttuosi se cellule GFAP + non aderire e diffondere all'interno di 24 h (Figura 4A). Il numero di cellule gliali non potrebbe essere determinato fino a dopo 24 h quando le cellule hanno aderito e hanno mostrato la prova della diffusione in aggregati piatti (Figura 4B). Celle al bordo dei cluster tendevano ad estendere i processi lunghi ed espresso classici marcatori gliali, ad es.,</e...

Qui, descriviamo l'isolamento di cellule glial-enterico dal submucosa intestinale utilizzando le incubazioni EDTA sequenziale per chelare cationi bivalenti e quindi l'incubazione in soluzione di recupero delle cellule non-enzimatici. La sospensione cellulare risultante su poli-D-lisina e laminin di placcatura si traduce in una cultura altamente arricchita delle cellule glial submucosal per l'analisi funzionale.

Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, in particolare riguardo alla funzione del sistema nervoso enterico. Il principale vantaggio della tecnica è che si tratta di un metodo rapido e non enzimatico per isolare cellule enteriche dalla lamina propria e dalla sottomucosa, piuttosto che dal muscolo liscio. Iniziare identificando lo stomaco distale e il piloro.Tenere il piloro con le pinzette mentre si taglia il mesentere. Quindi utilizzare una dissezione ottusa con il dorso delle forbici per rimuovere il pancreas aderente. Successivamente, usare le forbici per asportare sette centimetri dell'intestino prossimale senza strappare.Posizionare il segmento intestinale in DPBS freddo senza calcio o magnesio. Successivamente, utilizzare una siringa da cinque o 10 millilitri collegata a un ago senza punta di calibro 18-20 per lavare via il contenuto fecale con DPBS freddo. Dividere l'intestino in segmenti di tre centimetri per rimuovere il muscolo longitudinale.La rimozione rapida del mesentere e del muscolo longitudinale è essenziale per isolare glia enterica sana dalla lamina propria e dalla sottomucosa. Successivamente, prendere un ba

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Biologia

Il video dimostra una tecnica per isolare la microglia dalla corteccia del cervello di un topo adulto. In primo luogo, la corteccia subisce la segmentazione e l'omogeneizzazione per rimuovere i neuroni e altre cellule gliali, preservando la microglia. Successivamente, la sospensione cellulare viene esposta a microsfere magnetiche anti-mielina e a un campo magnetico, separando efficacemente le microglia e le cellule mieloidi dai detriti di mielina e dalle cellule contenenti mielina.

Isolamento della microglia dalla corteccia di un cervello di topo adulto

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule gliali enteriche dalla sottomucosa e dalla lamina propria dell'intestino del topo. Delinea le fasi coinvolte nell'estrazione della sottomucosa e del tessuto della lamina propria, isolando le cellule gliali enteriche da esse e coltivando le cellule su una piastra a pozzetti rivestita per stabilire una coltura di cellule gliali enteriche.

Isolamento delle cellule gliali enteriche dalla sottomucosa e dalla lamina propria di un topo

Il video ha dimostrato il metodo di isolamento e coltura delle cellule dal cervello di un topo neonatale. Ha comportato la dissociazione enzimatica e meccanica del cervello, seguita dalla coltura in terreni di crescita privi di fattore di crescita neuronale per ottenere una popolazione gliale mista.

Ottenimento di una coltura di cellule gliali miste da un cervello di topo neonatale

Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia,...

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

La ghiandola lacrimale (LG) ha due tipi di cellule che esprimono α-liscio muscolo actina (αSMA): cellule miepiteliali (MECs) e pericytes. I MECs sono di origine ectodermica, trovati in molti tessuti ghiandolari, mentre i periciti sono cellule muscolari lisce vascolari di origine endodermica. Questo protocollo isola i MECs e i periciti di murine LGs.

Isolamento delle cellule Miepiteliali da adulti murina lacrimale e ghiandole sottomandibolari

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Scopri un metodo rapido non enzimatico per isolare cellule gliali enteriche dalla submucosa intestinale del topo. Questa tecnica utilizza incubazioni sequenziali con EDTA per ottenere colture altamente arricchite per analisi funzionali.

Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto

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