Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fedeltà dei polimeri di DNA e della riparazione del DNA, come i metodi di correzione di bozze e l'analisi e nella definizione del patch di riparazione del DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto specifica, semplice, rapida e facile da eseguire. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della loro capacità di replicazione del DNA e il campo di riparazione potrebbe non avere familiarità con la strumentazione della spettrometria di massa e l'interpretazione dei dati.

Penso che la cosa più importante sia che la dimostrazione visiva sia molto critica in quanto possiamo mostrare come la nostra spettrometria di massa sviluppata commercialmente per applicazioni cliniche come la mutazione e la deputazione possa essere convenientemente adattata per la correzione di bozze del DNA e lo studio di riparazione. A dimostrare la procedura saranno gli studenti laureati Rong-Syuan e Kuei-Ching del mio laboratorio. Iniziare questa procedura con la preparazione del primer e del modello come descritto nel protocollo di testo.

Ad esempio, utilizzare una mancata corrispondenza TG del substrato P21 con T28 per la correzione di bozze. Diluire il primer P21 e il modello T28 a 12,5 picomoli per microlitro con acqua. Quindi, trasferire 12 microlitri del primer diluito e 12 microlitri del modello diluito in una provetta da microcentrifuga sterilizzata da 1,5 millilitri.

Dopo aver chiuso bene la provetta, incubare la provetta per 30 minuti in un bagno d'acqua coperto a 65 gradi Celsius. Quindi, incubare per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. E, infine, posizionare il tubo sul ghiaccio per garantire una corretta ricottura.

A una provetta per microcentrifuga sterilizzata da 1,5 millilitri, aggiungere otto microlitri di primer e miscela di mascherine, due microlitri di tampone di reazione di correzione di bozze 10x, quattro microlitri di miscela 4ddNTP e acqua fino a 18 microlitri. Muovi il tubo per mescolare. Diluire la DNA polimerasi in un tampone di reazione di correzione di bozze 1x ghiacciato alla concentrazione desiderata.

Conservare sempre l'enzima diluito in ghiaccio. Preriscaldare la provetta per microcentrifuga con la miscela di substrato alla temperatura di reazione desiderata. Quindi, trasferire due microlitri di DNA polimerasi diluita nella miscela di substrato preriscaldata e agitare la provetta per miscelarne il contenuto.

Centrifugare le provette con l'enzima e il substrato per alcuni secondi a 3200 volte la gravità a temperatura ambiente per far girare i componenti delle reazioni. Trasferire immediatamente la reazione in un blocco riscaldante o in un bagno d'acqua alla temperatura di incubazione desiderata. Per terminare la reazione, aggiungere un volume uguale di fenolo tamponato e mescolare la reazione agitando per alcuni secondi.

Quindi, centrifugare la reazione in una microcentrifuga a 3200 volte la gravità a temperatura ambiente per cinque minuti. Trasferire la fase acquosa in una provetta da microcentrifuga pulita e aggiungere un volume uguale di cloroformio. Dopo averlo miscelato agitandolo per alcuni secondi, centrifugare il campione in una microcentrifuga a 3200 volte la gravità a temperatura ambiente per tre minuti.

Trasferire la fase acquosa in una provetta da microcentrifuga pulita. Dopo aver incubato la reazione a 95 gradi Celsius per cinque minuti, posizionare la provetta sul ghiaccio. Successivamente, eseguire l'aggiunta di resina per eliminare la contaminazione salina in una piastra a 384 pozzetti, come descritto nel protocollo di testo.

Posizionare le piastre del campione nell'erogatore di nanolitri. Posizionare il chip della matrice e la piastra a 384 pozzetti preparata nel vassoio corrispondente. Azionare il nano-dispenser per individuare i prodotti di reazione al chip.

Premere il pulsante di esecuzione sul touch screen del nano-dispenser per iniziare. Controllare l'immagine acquisita automaticamente dei punti campione contenente informazioni sulla saturazione sullo schermo per assicurarsi che il volume complessivo individuato sul chip sia compreso tra cinque e 10 nanolitri. Ripetere l'individuazione del campione se il volume è insufficiente.

Preparare un file in formato Excel contenente le informazioni sul segnale previste per l'importazione. Creare e definire un nuovo test nel programma applicativo facendo clic con il pulsante destro del mouse su Importa gruppo di saggi in formato designer e selezionare il file Excel. Stabilire la piastra di analisi target tramite l'albero delle opzioni della piastra del progetto del cliente sul lato sinistro dello schermo facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla parte superiore dell'albero e assegnandogli un nome file.

Selezionare il tipo di piastra a 384 pozzetti e premere OK. Apparirà una targa vuota. Selezionare il test appropriato sul lato sinistro dello schermo. Assegnare il test selezionato per ogni posizione del campione individuato sul chip evidenziando il pozzetto e facendo clic con il pulsante destro del mouse per selezionare aggiungi plex.

Successivamente, prepara un elenco di lavoro di tutti i test sul chip in formato Excel senza intestazione. Importa la lista di lavoro tramite l'opzione Aggiungi nuovo progetto di esempio. Assegnare il test e la lista di lavoro a ciascuna posizione del test P21T28 e scegliere facendo clic con il pulsante destro del mouse.

Collegare lo spettrometro di massa al chip utilizzando il programma applicativo. Seleziona l'impostazione predefinita sul lato destro dello schermo. Inserire il nome del test e l'ID del chip nell'angolo del chip.

Salvare le impostazioni e avviare il programma di controllo MS. Premere il pulsante in/out ed estrarre la piastra scout. Posizionare il chip macchiato sulla piastra scout e premere il pulsante in/out per far entrare il chip macchiato nello spettrometro di massa.

Fare clic sul pulsante di acquisizione del programma applicativo per avviare la spettrometria di massa e acquisire i dati. Aprire il programma per l'analisi dei dati. Sfoglia l'albero del database nell'angolo in alto a sinistra e seleziona l'ID del chip.Apri il file di dati sul lato destro dello schermo.

Fare clic sull'icona dello spettro per visualizzare lo spettro di massa. Per ritagliare un intervallo specifico di sovraccarico di massa, fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare la finestra di dialogo di personalizzazione. Nella nuova finestra, fare clic sull'asse x e impostare il limite superiore e inferiore desiderato, quindi premere OK per visualizzare l'intervallo specificato dello spettro.

Esporta lo spettro per la conservazione dei registri facendo clic con il pulsante destro del mouse su Esporta. Seleziona il tipo di file JPEG, fai clic sulla destinazione, seleziona Sfoglia disco, digita il nome del file, quindi fai clic su Esporta. Per la quantificazione dei dati, utilizzare il cursore e fare clic sul picco per visualizzare l'altezza del picco nell'angolo in alto a sinistra.

Nella MALDI-TOF MS esiste una relazione inversa tra l'intensità di picco nella massa degli oligonucleotidi. Gli oligonucleotidi da 17 a 24 nucleotidi sono stati sottoposti a un'analisi MS. Le intensità relative del segnale sono state calcolate e potrebbero essere utilizzate per la quantificazione della correzione di bozze o del test di riparazione.

Sia i segnali stampo che quelli primer potrebbero essere trovati nello spettro di massa. A causa delle differenze dimensionali, i segnali provenienti dai modelli e dai loro prodotti di degradazione parziale non specifici erano ben separati dai primer e dai prodotti corretti in modo errato. Qui è mostrata una correzione di bozze di un terminale a tre numeri primi TG.At cinque minuti, il prodotto corretto era del 23% contro il 17% per il prodotto di escissione.

Questa differenza ha continuato ad aumentare al 69% rispetto al 14% a 20 minuti. Si noti l'alta risoluzione di MS che separa chiaramente i segnali sub-rettilinei e del prodotto con una differenza di sovraccarico di massa di soli 32. Facilmente risolvibili erano anche due forme di prodotti di escissione per una correzione di bozze TG definitiva a penna.

L'intermedio di escissione di un nucleotide e due prodotti di escissione nucleotidica. La correzione di bozze di discrepanze interne ha mostrato una chiara tendenza nell'efficienza della correzione di bozze. Come evidenziato da un ampio linguaggio di prodotti corretti, è stata osservata una maggiore efficienza quando i subretti avevano discrepanze all'ultimo, penultimo, terzo e quarto nucleotide dal terzo primo estremo, rispetto alle discrepanze in altre posizioni.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre applicazioni come lo screening dell'heapiter di correzione di bozze polimeriche per scoprire e inventare nuovi farmaci per la ricerca farmaceutica. Questa tecnica apre anche la strada ai ricercatori nel campo della replicazione e riparazione del DNA per ottenere maggiori informazioni sulla medicina dello gnomo e sulla sua fedele replicazione per tutti gli organismi viventi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la correzione di bozze del DNA e il test di riparazione utilizzando l'analisi di spettrometria di massa MADI-TOF. Non dimenticare che lavorare con lo sfeno-cloroformio può essere pericoloso e le precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale, devono essere sempre prese durante l'esecuzione della procedura. Il protocollo alternativo nel testo potrebbe essere considerato un sostituto più sicuro.