Name: Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Scopri il trasferimento adottivo stereotassico di linfociti umani citotossici in modelli murini di glioblastoma ortotopico. Questo metodo dimostra l'efficacia antitumorale delle immunoterapie cellulari nel trattamento del GBM.

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Gli autori ringraziano il personale dell'ospedale universitario animale impianto (UTE) di Nantes per zootecnia e cura, il cellulare e tessutale, funzione di memoria dell'Università di Nantes (MicroPICell) di imaging per l'imaging e l'impianto di citometria (Cytocell) da Nantes per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa n #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) e il Consorzio europeo Transcan2 di ERA-Net (Immunoglio). La squadra è finanziata dalla Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Questo lavoro è stato realizzato nel contesto di LabEX IGO e i programmi di IHU-Cesti, supportato con la nazionale Ricerca agenzia Investissements d'Avenir tramite i programmi ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, rispettivamente. Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e della regione Pays de la Loire. Gli autori ringraziano Chirine Rafia per fornire aiuto nella correzione del manoscritto.

Il seguente procedura che coinvolge animali soggetti è stato eseguito secondo le linee guida istituzionali (contratto n. 00186.02; comitato etico regionale della Pays de la Loire [Francia]). PBMCs umano sono stati isolati da sangue raccolto da donatori sani informati (Etablissement Français du Sang Nantes, Francia). Tutti i passaggi sono eseguiti in condizioni di sterilità.
1. non-specifico espansione dei linfociti T citotossici effettori
<ol><li>Preparare e irradiare le cellule di alimentatore a 35 Gy. Per la stimolazione di 2 x 105 - 4 x 105 cellule effettrici, preparare 10 x 106 PBMCs e 1 x 106 BLCLs da tre distinti donatori sani.</li>
	<li>Risospendere le cellule di alimentatore sia cellule effettrici in 15 mL di RPMI completato con 10% FCS inattivati al calore, di 2 mM L-Glutammina, di penicillina (100 UI/mL) e di streptomicina (0,1 µ g/mL) e del-2 ricombinante di 300 IU/mL.</li>
	<li>Aggiungere PHA-L ad una concentrazione finale di 1 µ g/mL, mescolare accuratamente e distribuire 150 µ l della sospensione delle cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti con fondo U.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C e 5% CO2 in atmosfera umidificata.</li>
	<li>Controllare ogni giorno la piastra fino a grandi cellule ciuffi forma nei pozzetti cultura (~ giorno 7).</li>
	<li>Trasferire le cellule in un matraccio di cultura a 1 x 106 cellule/mL nel terreno di coltura fresco.</li>
	<li>Determinare il numero totale delle cellule contando (2 volte alla settimana) e mantenerli a 1 x 106 cellule/mL nel terreno di coltura fresco. Nota: Le cellule immunitarie effettrici dovrebbero essere pronte per la somministrazione terapeutica presso lo stato di riposo (di solito 3 settimane dopo stimolo di amplificazione iniziale). La purezza e la reattività di queste cellule effettrici dovrebbe essere controllati prima in vivo iniezioni (ad es., con saggi in vitro ).</li>
</ol>2. preparazione di cellule effettrici pre-operatoria
<ol><li>Dopo aver controllato il conteggio delle cellule effettrici, raccogliere le cellule effettrici in un tubo da 50 mL mediante centrifugazione (300 x g per 5 min). Nota: Per compensare eventuali perdite, preparare un eccesso di cellule (ad es., 50 x 106).</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 15 mL di PBS sterile e centrifugare per 5 minuti a 300 x g per eseguire il lavaggio.</li>
	<li>Attentamente e completamente rimuovere il supernatante e quindi risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Trasferire le cellule sedimento in una microprovetta 1,5 mL per centrifugazione a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Attentamente e completamente eliminare il surnatante pipettando lentamente.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 8 µ l di PBS sterile per topo. Nota: Questo è un passo fondamentale.</li>
	<li>Misurare il volume della sospensione cellulare utilizzando una micropipetta. Se necessario, aggiungere PBS sterile (20 x 106 cellule in 15 µ l di PBS per dose) e mescolare con cura.</li>
	<li>Controllare, usando una micropipetta, che il volume finale del mouse è tra 15 e 20 μL (imperativamente < 20 µ l).</li>
	<li>Mantenere le cellule su ghiaccio fino a iniezione stereotactic. Nota: più di 3-h punti temporali non sono stati testati.</li>
</ol>3. stereotassica iniezione
<ol><li>
Installazione dell'apparecchio
	<ol>
<li>Assemblare e calibrare una piccola cornice stereotassica animale secondo le istruzioni del produttore per garantire la precisione delle iniezioni intracraniche (ad es., siringa dimensioni, volume desiderato e tasso di iniezione). Nota: Un tasso di infusione lenta è consigliabile (cioè, 2-3 µ l/min).</li>
		<li>Installare il materiale sotto un armadietto di sicurezza microbica (MSC) per mantenere la sterilità degli strumenti e per proteggere i topi dalle infezioni. Nota: posto "blocchi isotermici" in un bagno di acqua a 37 ° C. Questo sistema limita l'ipotermia dei topi durante l'intervento chirurgico. Termofori, che sono necessari per la cura post-operatoria, deve essere usato durante il monitoraggio continuo della temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione pre-operatoria di animale
	<ol>
<li>Anestetizzare un mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (10 mg/mL) e xilazina (0,1 mg/mL) a 10 µ l/g di peso corporeo del mouse.</li>
		<li>Eseguire un test di pizzico di punta per garantire la completa anestesia e analgesia dell'animale. Nota: Ogni movimento è un'indicazione di non-profonda analgesia e, in questo caso, un paio di minuti è necessari prima di ripetere l'operazione.</li>
		<li>Una volta che il mouse è adeguatamente anestetizzato, usare le forbici per rimuovere il pelo dal sito chirurgico (tra le due orecchie, fino al naso).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione pre-operatoria delle cellule
	<ol>
<li>Attentamente risospendere le cellule con una pipetta (più volte) prima di ogni iniezione per prevenire qualsiasi cella che ragruppa.</li>
		<li>Disegnare con attenzione il volume di sospensione cellulare richiesto (15-20 µ l) nella microsiringa 22-G per evitare l'aspirazione di bolle. Nota: Questo passaggio cella-caricamento nella microsiringa è importante ridurre al minimo le variazioni nei volumi iniettati. Ricaricare le cellule per ogni iniezione individuale tra procedure per prevenire qualsiasi cella che ragruppa e garantire un numero pari di somministrazione di cellule effettrici nella coorte.</li>
		<li>Quindi, posizionare la siringa nella pompa a siringa adattato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assistenza processuale
	<ol>
<li>Disinfettare il sito chirurgico con tamponi imbevuti di soluzione al 5% povidone-iodio almeno 3 x.</li>
		<li>Posizionare una pomata oftalmica lubrificante negli occhi del mouse per evitare qualsiasi asciugatura delle cornee.</li>
		<li>Posizione del mouse anestetizzato sulla cornice stereotassica, su un blocco isotermico caldo coperto con un involucro di plastica sterile per mantenere la temperatura del mouse durante la chirurgia e limitare la mortalità. Nota: Il mouse naso e denti dovrebbero essere opportunamente posizionati sopra la barra di dente, per garantire un flusso respiratorio adeguato durante la procedura.</li>
		<li>Una volta che il mouse è posizionato sopra la barra di dente, stringere le barre di orecchio saldamente sotto le orecchie del mouse per immobilizzare la testa. Nota: Fare attenzione a non danneggiare i timpani o compromettere la respirazione.</li>
		<li>Fare un'incisione sagittale della pelle di 1-2 cm del midline con forbici sterili lungo la parte superiore del cranio dall'anteriore al posteriore per esporre il cranio.</li>
		<li>Identificare l'intersezione delle suture sagittali e coronale (Bregma) per servire come punti di riferimento per la localizzazione stereotassica prima dell'iniezione (illustrato nella Figura 1).</li>
		<li>Posto la microsiringa sopra questo punto.</li>
		<li>Spostare la microsiringa laterale di destra 2 e 0,5 mm anteriore del Bregma.</li>
		<li>Utilizzando un microdrill, fare un piccolo foro nel cranio con una punta sterile alle coordinate predeterminate. Fare attenzione a rimanere superficiale al fine di evitare qualsiasi lesione traumatica del cervello. Nota: Nel presente protocollo, le cellule immuni sono state iniettate all'interno di un tumore stabilito (una settimana dopo l'iniezione delle cellule del tumore). La pelle dovrebbe essere riaperta (cicatrice) e l'iniezione viene eseguita presso le stesse coordinate usate per l'impianto delle cellule del tumore (il foro è generalmente ancora presento fino a 2 settimane dopo l'iniezione). Le coordinate sono state selezionate per l'iniezione di cellule del tumore ed effettrici nel parenchima cerebrale13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Iniezione di cellule immunitarie effettrici
	<ol>
<li>Inserire con cautela la microsiringa nel foro e, muovendo lentamente, in avanti l'ago 3 giù nella dura e poi indietro 0,5 mm ad una profondità finale di 2,5 mm prima di iniettare le cellule effettrici.</li>
		<li>Eseguire l'iniezione di cellule effettrici a 2-3 µ l/min e monitorare i topi lungo tutto il tempo di iniezione.</li>
		<li>Una volta completata l'iniezione, ritirare l'ago per solo 1 mm e conservare la microsiringa in luogo per un ulteriore minuto prima lentamente ritirando completamente la microsiringa, per evitare eventuali perdite dalla sede di infusione. Nota: Dopo la rimozione dell'animale dal dispositivo stereotassica, pulire immediatamente l'apparecchiatura di iniezione per i prossimi esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assistenza post-operatoria e follow-up del mouse
	<ol>
<li>Rimuovere l'animale dalla cornice stereotassica e immediatamente applicare soluzione 5% povidone-iodio nel sito di incisione e chiudere la pelle con una sutura chirurgica appropriata.</li>
		<li>Applicare gel di lidocaina 2% direttamente sulla ferita e 0.15 µ g/g di buprenorfina per amministrare un'iniezione sottocutanea per analgesia post-operatoria.</li>
		<li>Posto indietro il mouse anestetizzato per sua gabbia sopra un rilievo di riscaldamento impostato a 37 ° C per mantenere la temperatura corporea di un mouse appropriato ed evitare qualsiasi ipotermia. Nota: Involucro separato non è necessario.</li>
		<li>Monitorare il mouse fino a quando non è completamente recuperato dall'anestesia e trasferirlo in una camera di alloggiamento. Nota: Ad oggi, questo protocollo è ben supportato come poche complicazioni impreviste si sono verificati (< 5% dei topi iniettati).</li>
		<li>Ogni giorno monitorare i topi e li eutanasia quando vengono osservati eventuali segni di salute in declino (ad es., postura ricurva, mobilità ridotta, prostrazione o perdita di peso significativa [≥ 15%]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Stupp, R., Roila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+glioma%3A+ESMO+clinical+recommendations+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).</li>
<li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet?</a> Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).</li>
<li>Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+brain+tumors%3A+regression+of+experimental+gliomas+by+adenovirus-mediated+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).</li>
<li>Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Cellular+Therapies+for+Glioblastoma+Multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme.</a> Cureus. 10 (3), e2305(2018).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+Therapy+of+Glioblastoma+in+a+Mouse+Model+Using+Exosomes+Derived+From+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 824(2018).</li>
<li>Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+hope+in+immunotherapy+for+malignant+gliomas%3A+adoptive+T+cell+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 326545(2014).</li>
<li>Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+cellular+immunotherapy+for+patients+with+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Developmental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma.</a> Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+of+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li>
<li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+administrations+of+allogeneic+human+Vgamma9Vdelta2+T+cells+efficiently+control+the+development+of+human+glioblastoma+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors.</a> Oncoimmunology. 5 (6), e1168554(2016).</li>
<li>Dutoit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+glioblastoma+peptidome+to+discover+novel+tumour-associated+antigens+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy.</a> Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).</li>
<li>Joalland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+Increases+the+Reactivity+of+Allogeneic+Human+Vgamma9Vdelta2+T+Cells+Against+Primary+Glioblastoma+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors.</a> Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).</li>
<li>Clemenceau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+memory+alphabeta+T+lymphocytes+can+express+FcgammaRIIIa+and+mediate+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).</li>
<li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3403(2011).</li>
<li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+depletion+followed+by+intracerebral+CpG-ODN+injection+induce+brain+tumor+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection.</a> Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy%3A+An+overview+of+obstacles+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities.</a> Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).</li>
<li>Bryant, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+immunotherapeutic+potential+of+gammadelta+T-cells+in+patients+with+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).</li>
<li>Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+of+allogeneic+innate+lymphocyte+therapy+for+glioma+patients+with+prior+cranial+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).</li>
<li>Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+responses+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune responses of the central nervous system.</a> Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
<li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+sustained+delivery+of+5-fluorouracil+from+biodegradable+microspheres+for+the+radiosensitization+of+glioblastoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study.</a> Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).</li>
<li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+implantation+of+5-fluorouracil-releasing+microspheres+in+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma.</a> Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).</li>
<li>Salot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+expansion+of+gamma+9+delta+2+T+lymphocytes%3A+Innacell+gamma+delta+cell+therapy+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product.</a> Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).</li>
<li>Bennouna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-I+study+of+Innacell+gammadelta%2C+an+autologous+cell-therapy+product+highly+enriched+in+gamma9delta2+T+lymphocytes%2C+in+combination+with+IL-2%2C+in+patients+with+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un trasferimento adottivo di selezionato nativo o cellule effettrici immuni ingegnerizzati rappresenta un promettente approccio per trattare efficacemente i tumori, quali i tumori al cervello infiltrativo, avendo cura di limitare le reattività contro le cellule non trasformate15, 16,17,18. Tuttavia, il sistema nervoso centrale, che comprende il cervello, ha una particolare condizione immune, i...

GBM (che grado astrocitoma IV), è il più frequente e aggressivo cancro cerebrali primari negli adulti. Nonostante i trattamenti aggressivi che combinano la chirurgia e la radio-chemioterapia, GBM rimane associato con una prognosi estremamente infausta (sopravvivenza mediana di 14,6 mesi e un 2-anno-mortalità > 73%)1. Questo evidenzia che pochi progressi terapeutici efficienti siano stati convalidati sopra gli ultimi dieci anni2. Tra i candidati per la progettazione delle più efficaci strategie terapeutiche3,4,5, immunoterapie6 sono attualmente esplorati per tenere traccia ed eliminare altamente tumore invasivo e radio/chemio-resistenti cellule, ritenuto sospettate per il loro contributo chiave a tumore rapido e fatale ricaduta7. Vari potenziali bersagli immunologici sono stati individuati e proposti per immunoterapie, che coinvolgano naturale o modificate αβ o linfociti T ϒδ quali antigeni tumorali specifici GBM o indotta da stress molecole8,9, 10. La possibilità di amministrare gli GBM-reattiva effettori delle cellule immuni selezionati rappresenta un'opportunità unica per fornire elevate quantità di linfociti effettori direttamente nel sito di malignità residua. Per supportare questa strategia, abbiamo recentemente dimostrato che modelli basati su topi immunodeficienti xenotrapianti GBM umani primari di orthotopic fedelmente ricapitolano lo sviluppo dei tumori cerebrali in pazienti GBM9,11. Inoltre, questi modelli sono stati utilizzati per dimostrare l'efficacia antitumorale forte dei linfociti Vϒ9Vδ2T passivamente trasferiti umani allogenici.
Questo protocollo descrive la procedura sperimentale critica per raggiungere immunoterapie stereotactic dei tumori cerebrali, come GBM, basato sul trasferimento adottivo di linfociti T allogenici. Illustrato nell'articolo: (i) l'amplificazione dei linfociti terapeutici allogenici T effettori immuni, quali linfociti umani di Vϒ9Vδ2T; (ii) la preparazione di questi linfociti T effettori per iniezione; (iii) la procedura per l'amministrazione stereotactic all'interno del cervello, vicino al tumore. Questo articolo fornisce inoltre la comprensione del comportamento di questi effettori cellulari dopo iniezione stereotactic.
L'approccio terapeutico qui presentata si basa sull'iniezione di 20 x 106 cellule effettrici per dose per ogni mouse immunodeficienti di cervello del tumore-cuscinetto. Un passo di espansione iniziale in vitro è necessaria per produrre grandi quantità di cellule del sistema immunitario. Pertanto, espansioni delle cellule aspecifiche sono effettuati usando la fitoemagglutinina (PHA-L) e irradiato le cellule allogeniche alimentatore: cellule mononucleari sangue periferico (PBMCs) da donatori sani e delle cellule B-linfoblastoidi Epstein Barr Virus EBV-trasformati linee (BLCLs), derivati da PBMCs di infezione in vitro con EBV-contenente cultura surnatante dalla linea cellulare Marmoset B95-8, in presenza di 1 µ g/mL ciclosporina-A.
Le cellule immunitarie effettrici reattive GBM sono rispetto e selezionate da in vitro saggi9. Queste cellule effettrici sono attivate e amplificato mediante protocolli standard, secondo la loro natura (ad es., umano Vγ9Vδ2 T linfociti9 o umano anti-herpes virus αβ T linfociti12) con una purezza minima di > 80%, come ordinariamente controllato dall'analisi cytometric. La procedura di espansione delle cellule riportata di seguito si applica a varie sottopopolazioni di linfociti umani.

<table><tbody><tr><td>PBMC</td><td></td><td></td><td>da 3 diversi donatori sani</td></tr><tr><td>BLCL</td><td></td><td></td><td>da 3 diversi donatori</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleuchina</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per mouse per fotogramma stereotassico&nbsp; &nbsp;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>iniettore pompa microsiringa&nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>Siringa NanoFil</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>NSG topi</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Merial</td><td>Imalg. ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2%</td><td></td></tr> <tr><td>Forbici</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xilocaina</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti multiforme di glioblastoma umano ortotopico

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Multiforme di glioblastoma (GBM), il cancro primario del cervello più frequenti e più aggressivo negli adulti, è generalmente associato con una prognosi difficile, e sono state proposte terapie efficienti scarse nell'ultimo decennio. Tra i candidati promettenti per la progettazione di nuove strategie terapeutiche, immunoterapie cellulari sono stati designati per eliminare altamente invasive e chemio-radioresistenti cellule del tumore, probabilmente coinvolti in una ricaduta rapida e mortale di questo cancro. Così, somministrazioni di trapianto allogeneic GBM-reattiva effettori delle cellule immuni quali linfociti T Vϒ9Vδ2 umani, in prossimità del tumore sarebbe rappresenta un'opportunità unica per fornire efficiente e altamente concentrato agenti terapeutici direttamente nella sito di tumori maligni del cervello. Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept preclinici per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di questi cellulari immunoterapie che si basano sulle iniezioni di stereotactic dei linfociti umani allogenici all'interno letti tumore intrabrain.

Questo studio descrive la strategia del trasferimento adottivo di cellule effettrici immuni cellulari all'interno del cervello di topi portatori di tumore, basato su stereotactic iniezioni eseguite direttamente all'interno della base del tumore.
Per ridurre al minimo qualsiasi rischio di ferita di cervello connessa con un volume di grande iniezione, la sospensione di cellule effettrici deve essere concentrato (20 x 106</sup...

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Il glioblastoma multiforme rimane il tumore cerebrale primario più frequente e aggressivo negli adulti. Nonostante i trattamenti aggressivi basati sulla chirurgia seguita da radio e chemioterapia, il GBM è associato a una prognosi estremamente infausta e a una sopravvivenza mediana inferiore a 15 mesi. Poiché nell'ultimo decennio sono stati compiuti pochi progressi terapeutici, le immunoterapie cellulari sono attualmente in fase di studio per eliminare le cellule GBM altamente invasive e resistenti probabilmente coinvolte in una rapida recidiva tumorale.La somministrazione di fattori immunotossici citotossici reattivi al GBM selezionati in prossimità del tumore potrebbe rappresentare un'opportunità unica per somministrare l'immunoterapia cellulare concentrata, direttamente nel sito di malignità residua. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che i topi immunodeficienti portatori di xenotrapianto di GBM umano primario ortotopico ricapitolano il GBM a un maggiore sviluppo nei pazienti. Questi modelli di GBM sono stati utilizzati per valutare l'efficacia degli effettori immunitari citotossici sulle iniezioni intratumorali.Questo protocollo descrive il nostro processo terapeutico basato innanzitutto sull'isolamento e l'amplificazione di cellule effettrici immunitarie reattive al GBM. In secondo luogo, la propagazione di queste cellule effettrici per l'iniezione intercranica. E in terzo luogo, la loro iniezione stereotassica nel sito del tumore all'interno del cervello del topo.È stato studiato anche il comportamento dell'effettore immunitario dopo l'iniezione ortotopica. Tre settimane dopo la stimolazione fetale con PHA, le cellule effettrici, che formano un grumo di cellule sul fondo del pallone, dovrebbero essere tornate allo stato di riposo e pronte per essere utilizzate. Dopo aver controllato la conta delle cellule effettrici, risospendere e raccogliere le cellule in una provetta da 115 millilitri e centrifugarle.Rimuovere con cura e completamente un surnatante. E risospendere le cellule in PBS sterile e centrifugare per lavarle. Rimuovere con cautela e completamente il surnatante.E poi risospendere le cellule in un millilitro di PBS sterile. Trasferimento di cellule in una microprovetta per la centrifugazione. Anche in questo caso, rimuovere con attenzione e completamente il surnatante pipettandolo lentamente.Il passo successivo è fondamentale, risospendere le cellule in metà del volume finale di PBS sterile e omogeneizzare delicatamente e con attenzione. Verificare il volume finale con micropipetta, il volume finale per topo deve essere compreso tra 15 e 20 microlitri per 20 milioni di cellule. Assicurati che non superi i 20 microlitri per topo.Mantenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione. Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato con un pizzico di dita dei piedi e quindi rimuovere il pelo dal sito chirurgico, tra le due orecchie e fino al naso. Risospendere lentamente le cellule per evitare la formazione di grumi e caricare la sospensione della cella nella siringa con grande cura per evitare la presenza di bolle.Quindi, posizionare la siringa nella pompa a siringa adattata. Disinfettare il sito chirurgico con sale e soluzione di iodio povidone al 5% e posizionare un unguento oftalmico lubrificante negli occhi del topo per prevenire l'essiccazione della cornea. Quindi, posizionare il mouse anestetizzato sul telaio stereotassico su un blocco caldo.Posizionare in modo appropriato il naso e i denti del mouse sopra la barra dei denti. Stringere saldamente le barre auricolari nelle orecchie del mouse per immobilizzare la testa. Fare attenzione a non danneggiare i timpani, compromettere la respirazione e assicurarsi che la testa sia ben immobilizzata.Praticare un'incisione cutanea sagittale sulla linea mediana con forbici sterili lungo la parte superiore del cranio per esporre il cranio. Identificare l'intersezione delle strutture sagittale e coronale che fungano da punti di riferimento per la localizzazione stereotassica e posizionare la siringa sopra questo punto. Muovere la siringa alle coordinate predeterminate.Due millimetri lateralmente a destra e 0,5 millimetri davanti al Utilizzando un microtrapano, praticare un piccolo foro nel cranio con una punta da trapano sterile. Fai attenzione a rimanere superficiale per evitare lesioni cerebrali. Inserire con cautela la siringa nel foro praticato.Spostare lentamente l'ago in avanti di tre millimetri verso il basso nella dura dura, quindi indietro di 0,5 millimetri fino a una profondità finale di iniezione di cellule di 2,5 millimetri. Eseguire l'iniezione cellulare a due o tre microlitri al minuto e monitorare i topi per tutto il tempo di iniezione. Una volta completata l'iniezione, estrarre l'ago per un solo millimetro e tenere la siringa in posizione per un altro minuto prima di estrarre lentamente completamente la siringa per evitare perdite dal sito di infusione.Rimuovere con cautela l'animale dal telaio stereotassico. Chiudere la pelle con un'appropriata sutura chirurgica e applicare il gel di lidocaina al 2% direttamente sulla ferita. Trasferire il mouse anestetizzato nella rispettiva gabbia sopra il termoforo impostato a 37 gradi Celsius per mantenere la temperatura corporea del mouse appropriata fino al completo recupero dall'anestesia.Poiché la sospensione è molto concentrata, sono state verificate la vitalità e la reattività cellulare. Le cellule effettrici sono state caricate in una siringa per imitare l'iniezione in vivo. Le cellule sono state raccolte immediatamente o 10 minuti dopo e sono state analizzate mediante citometria a flusso per la colorazione con ioduro di propidio.Come si può vedere, la preparazione e il carico non hanno influito sulla vitalità delle celle effettrici a 24 ore. Anche la reattività contro le cellule tumorali del glioblastoma è stata verificata utilizzando cellule non preparate o effettori preparati e sono rimasti tre ore sugli occhi. La reattività è monitorata mediante colorazione positiva del marcatore di attivazione CD107A.Questi risultati dimostrano che la reattività delle cellule effettrici non è stata influenzata dal preparato. Sette giorni dopo l'iniezione delle cellule effettrici, i cervelli dei topi sono stati raccolti, sezionati e colorati per la colorazione ematica per consentire l'identificazione della struttura del tumore. Quindi la colorazione anti-umana del CD3 ha permesso la localizzazione delle cellule effettrici.È interessante notare che le cellule effettrici sono state trovate intorno al tumore e nel nucleo del tumore, ma anche nell'emisfero controlaterale. Le cellule T effettrici umane isolate dal cervello di topo 48 ore dopo l'iniezione rappresentano il 2% delle cellule cerebrali. Erano ancora in grado di proliferare in presenza di PHA, alimentatori e stimolazione di IL2, con una purezza del 99% dopo l'amplificazione.Grazie a questo protocollo, le cellule effettrici umane a riposo possono sopravvivere e pattugliare con un parenchima cerebrale di topo per diversi giorni dopo l'iniezione stereotassica. In conclusione, il trasferimento adottivo di cellule effettrici umane mediante iniezioni stereotassiche rappresenta approcci promettenti per trattare efficacemente i tumori cerebrali maligni infiltrativi con limitati effetti deleteri sulle cellule sane. Questa via di somministrazione sfrutta il fatto che le cellule umane vengono consegnate vicino al sito del tumore, limitando la loro diluizione all'interno dei tessuti e dell'organismo.Qui abbiamo descritto la procedura che segue il rilascio di una grande quantità di cellule immunitarie all'interno del tumore cerebrale senza effetti dannosi sulle cellule effettrici e, soprattutto, senza alcun effetto deleterio visibile sui topi. Inoltre, le cellule immunitarie iniettate localmente nel cervello di topo non solo sono in grado di sopravvivere e mantenere la loro capacità di essere attivate e amplificate ex vivo, ma anche di eliminare le cellule tumorali disseminate nel tessuto cerebrale circostante. Collettivamente, queste caratteristiche sono essenziali per consentire l'eliminazione di forti cellule tumorali infiltrative che caratterizzano i tumori GBM.Questo protocollo apre nuove opportunità per la creazione di una procedura di trasferimento adottivo in modelli murini di tumore cerebrale. Passaggio essenziale prima di considerare la MC clinica.

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Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

Questo video dimostra una tecnica di iniezione stereotassica per la somministrazione di linfociti T effettori umani in un modello murino portatore di un tumore cerebrale umano. Dopo aver posizionato un topo anestetizzato portatore di tumore su un telaio stereotassico e aver creato un foro di bava nella posizione di iniezione sul cranio, i linfociti T effettori vengono iniettati nel sito del tumore.

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Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico (Video) | JoVE Journal

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

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