Name: Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Scopri la registrazione ottica dei potenziali d'azione in cardiomiociti ventricolari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo metodo utilizza sensori di tensione codificati geneticamente per studiare l'elettrofisiologia cardiaca con elevata efficienza.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da German Research Foundation (Si 1747/1-1), l'altro Kröner-Fresenius-Stiftung e la Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. preparazione di cardiomiociti derivati iPSC per l'Imaging
Nota: Metodi per la differenziazione di cultura e cardiaco iPSC sono apparse prima12,13,14 e non sono discussi qui in dettaglio. La purificazione di iPSC-CMs di microdissection manuale, separazione magnetica delle cellule o selezione di lattato è raccomandata, a seconda del protocollo di differenziazione utilizzato. Per il seguente protocollo, espianti di microdissected battendo zone, generata utilizzando un protocollo di differenziazione monostrato13, erano scattate il giorno 15 di una differenziazione cardiaca e coltivate fino al giorno 30 su piastre rivestite di fibronectina, come descritto prima delle10.
<ol><li>Prendere la cella piastre di coltura fuori l'incubatrice e raccogliere manualmente gli espianti cardiaci nelle provette microcentrifuga utilizzando una pipetta 200 µ l. Dopo la sedimentazione, aspirare il supernatante di coltura delle cellule e lavare delicatamente gli espianti di equilibrato 2x con Hank sale soluzione (HBSS).</li>
	<li>Dissociare iPSC-CMs mediante aggiunta di collagenasi tipo II (430 U/mL in HBSS) e li Incubare a 37 ° C per 30 min.</li>
	<li>Dopo la sedimentazione della rimanente cella grande ciuffi, raccogliere il surnatante contenente il singolo dissociato iPSC-CMs e aggiungere questo fresco mezzo di manutenzione CM contenente una concentrazione alta di siero bovino fetale (FBS) (DMEM-F12, 20% FBS, 2mm L-Glutamine, 1: 100 MEM non essenziali aminoacidi, 100 U/mL penicillina-streptomicina e 0,1 mM β-mercaptoetanolo).</li>
	<li>Ripetere la dissociazione se restino grumi di grandi cellule. Raccogliere single iPSC-CMs di centrifugazione e risospendere li in mezzo CM contenente una bassa concentrazione di FBS (2% FBS).</li>
	<li>Reseeding singolo iPSC-CMs in una densità che permette la formazione immagine successiva delle singole cellule su un microdish cultura cellulare di 3,5 cm con fondo di vetro è stato rivestito con fibronectina (2 µ g/cm2). Ottimizzare la densità di semina prima di impegnarsi in esperimenti di alto-rendimento. Di solito, 5 – 10 espianti cardiache per ogni piatto di 3,5 cm sono sufficienti; Tuttavia, questo dipende fortemente la dimensione di espianto e la purezza.</li>
	<li>Cultura il singolo iPSC-CMs dopo la loro dissociazione in mezzo di manutenzione CM contenente il 2% FBS per almeno 48 h per garantire un sufficiente recupero. Nota: Nei passaggi successivi, l'iPSC-CMs vengono trasdotti con un lentivirus GEVI VSFP-CR sotto il controllo di un rinforzatore di MLC2v 10 per ottenere un'espressione di GEVI ventricolare specifiche di codifica. In alternativa, costrutti lentivirali che permette di esprimere la GEVI specificamente in nodale o atriale-come le cellule, o un costrutto aspecifiche che harboring il promotore PGK espressa ubiquitariamente, possa essere usate10. Plasmidi lentivirali sono disponibili su richiesta. Attenzione: Quando si lavora con particelle lentivirali, assicurarsi che l'ambiente di lavoro abbia il livello di biosicurezza adeguata, di rispettare le istruzioni di sicurezza per l'utilizzo di agenti potenzialmente infettivi e adottare le precauzioni di sicurezza necessarie.</li>
	<li>Preparare il supporto di infezione mescolando i lentivirus10-contenenti coltura cellulare surnatante, che è stata prodotta in cellule HEK293 come descritto prima15, con mezzo di manutenzione CMs (Vedi punto 1.3) in un rapporto 1:1.</li>
	<li>Aggiungere bromuro di hexadimethrine ad una concentrazione finale di 8 µ g/mL per migliorare l'efficienza di infezione. Nota: A causa dell'infezione ad alta efficienza di iPSC-CMs concentrazione preliminare di lentivirus attraverso ultracentrifugazione solitamente non è necessario.</li>
	<li>Aspirare il mezzo di manutenzione CM dal singolo iPSC-CMs e sostituirlo con il mezzo di infezione preparato durante passaggi 1.7 e 1.8. Cultura il singolo infetto iPSC-CMs nel mezzo di infezione per 12 h a 37 ° C. Aspirare il mezzo, quindi sostituirlo nuovamente con mezzo di manutenzione di CM. Nota: Un segnale di fluorescenza dalla GEVI appare 48h dopo l'infezione. Un imaging delle registrazioni di potenziale di membrana è raccomandato, 72 ore dopo l'infezione al più presto, per garantire una forza di segnale adeguato. Singola infetti iPSC-CMs possono essere coltivate per almeno 3 settimane e ripreso in modo sequenziale. In caso di vasto photobleaching durante una sessione di imaging, il segnale di fluorescenza recupera nel tempo.</li>
	<li>Prima di formazione immagine, scambiare il mezzo di coltura cellulare di soluzione di Tyrode completati con Ca2 + (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, glucosio di 10 mM, 1,8 mM CaCl2e 10 mM HEPES; pH 7,35).</li>
</ol>2. registrazioni di potenziali di membrana ottico
<ol><li>Posizionare la camera imaging contenente l'iPSC-CMs sul palco di un microscopio a epifluorescenza invertito equipaggiato con uno splitter di immagine, il set di filtri appropriati e una fotocamera (ad esempio, una fotocamera di sCMOS) in grado di imaging ad alta velocità con un elevato sensibilità. Nota: ad esempio, utilizzare un'eccitazione di 480/40 nm passa-banda filtro combinato con un 500 specchio dicroico passa-lungo nm nel microscopio e uno specchio dicroico di 568 nm long-pass combinato con 520/28 nm e 630/75 nm passa-banda emissione filtri nella barra di divisione di immagine. Per l'imaging di singola cellula, un obiettivo a immersione in olio ad alto ingrandimento, alta apertura numerica fornisce il miglior rapporto segnale-rumore.</li>
	<li>Se è necessaria la stimolazione elettrica, installare elettrodi di stimolazione nella camera di imaging e collegarli ad un generatore di stimolo. Nota: Abbiamo usato un inserto di pacing che conteneva due elettrodi di platino e montato in piastre di coltura di 3,5 cm con fondo di vetro cellulare. Le cellule situate fra gli elettrodi erano imaged. Parametri di stimolazione tipici sono impulsi rettangolari di 5 ms nella durata, con un'ampiezza di 10 V/cm di distanza dell'elettrodo.</li>
	<li>Facoltativamente, è possibile utilizzare una fase di microscopio riscaldata per garantire una temperatura stabile di iPSC-CMs durante la creazione di immagini, o anche un microscopio incubazione camera set-up, se la formazione immagine a lungo termine è destinata.</li>
	<li>Portare le cellule alla messa a fuoco e mettere una cella esprimendo la GEVI nel centro del campo di visione. Nota: Questo è più convenientemente fatto utilizzando gli oculari del microscopio utilizzando una proteina fluorescente verde (GFP) o un rosso proteina fluorescente (RFP) filtro impostato per identificare le cellule che esprimono la GEVI.</li>
	<li>Impostare il percorso ottico in modo che luce emessa viene instradato alla barra di divisione di immagine. Passare il cubo di filtro nel microscopio ad uno per essere combinati con i filtri nella barra di divisione di immagine (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Nel software di controllo della telecamera, è necessario impostare le impostazioni di acquisizione in modo che l'imaging ad alta velocità (ad esempio, 100 fotogrammi al secondo, con un tempo di esposizione di 10 ms per fotogramma) è possibile. Nota: Di solito, questo coinvolge il binning dei pixel della fotocamera (ad es., 8 x 8 pixel del chip della fotocamera sono cestinate per generare un pixel nel filmato time-lapse).</li>
	<li>Impostare l'immagine splitter secondo le istruzioni del fabbricante. Le due immagini che rappresentano le due bande di lunghezza d'onda di emissione diversi dovrebbero essere adiacente a vicenda, ognuno occupando una metà dell'immagine. Nota: Questo passaggio deve essere eseguita solo 1x all'inizio di ogni sessione di imaging.</li>
	<li>Controllare e, se necessario, regolare la messa a fuoco dell'immagine prodotta dalla fotocamera.</li>
	<li>Regolare la luminosità della luce illuminazione in modo che si evita qualsiasi saturazione dei pixel; Questo può essere fatto più facilmente utilizzando una tavolozza di colori in cui saturi pixel sono rappresentati da un unico colore. Nota: Durante tutti questi preparativi prima di formazione immagine, limitare l'esposizione del campione all'eccitazione leggero per la quantità necessaria (cioè, non lasciare la luce su per lunghi periodi di tempo) per evitare il photobleaching della GEVI.</li>
	<li>Impostare l'acquisizione delle serie temporali (ad esempio, 5.000 immagini a 100 fotogrammi al secondo per una durata di serie di 50 s). Dim la luce in camera (compreso il monitor del computer) per evitare luce diffusa che influenzano la misura. Se l'otturatore luce di eccitazione non è controllato con il software di imaging, è possibile aprirlo appena prima di iniziare l'acquisizione.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione di serie di immagini. Se si desidera la stimolazione elettrica, avviare la sequenza di stimolazione al punto di tempo appropriato, a meno che non viene automaticamente avviato dal software di imaging. Se l'applicazione di un agente farmacologico è voluto, fare questo sia manualmente (ad es., pipettaggio 100 µ l dell'agente in una concentrazione di fine dieci volte per la camera di registrazione contenente 900 µ l di tampone e mescolando delicatamente con la pipetta) o utilizzando un sistema di perfusione di flusso costante.</li>
	<li>Una volta completato l'acquisizione, chiudere l'otturatore luce di eccitazione se necessario. Salvare la registrazione sul disco rigido.</li>
	<li>Lasciando le impostazioni di registrazione (vale a dire, tempo di esposizione, frame rate e intensità luminosa) invariate, eseguire una registrazione di fluorescenza di fondo (come al punto 2.11) sopra una regione del coprivetrino non contenenti cellule o sopra un altro vetrino coprioggetti su cui non cellule sono state seminate. Nota: Se vengono effettuate misurazioni sequenziali senza modificare le impostazioni di acquisizione, un solo servizio di registrazione di fluorescenza è necessaria per tutte queste misure.</li>
	<li>Se lo si desidera, è possibile eseguire ulteriori esperimenti (passaggi 2.4 – 2,13) su diversi iPSC-CMs situato sulla stessa coprivetrino. Essere consapevoli del fatto che tutti i CMs il coprivetrino si applicherà nel caso in cui una droga è stata applicata.</li>
</ol>3. analisi
> Nota: A seconda del software di imaging utilizzata (che è in genere un pacchetto di software proprietario fornito dal produttore della fotocamera o la fluorescenza di intera sistema di imaging), può essere possibile eseguire l'analisi delle immagini acquisite in parte o anche interamente all'interno di questo pacchetto di software. Tuttavia, qui un flusso di lavoro di analisi delle immagini che possono essere eseguite con software open source (cioè, la piattaforma di analisi di immagine ImageJ)16, che può essere comodamente installato utilizzando una distribuzione come Fiji17e il pacchetto di R per calcolo statistico18 sono descritti. Brevemente, le regioni di interesse (ROI) che rappresentano celle o sfondo sono disegnate in ImageJ, e la media di fluorescenza in questi ROIs nel tempo viene esportata in un file per essere, quindi, ulteriormente analizzato R o, in alternativa, con il software del foglio elettronico.
<ol><li>Il software di imaging, salvare o esportare le serie temporali di immagine acquisita (sia la registrazione che contiene le cellule e la corrispondente registrazione di sfondo) in un formato (ad es., TIF) che può essere letto da ImageJ. In alternativa, utilizzare il plugin BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), che prevede procedure di abilitazione ImageJ leggere formati di file proprietari da diverse marche di produttori di sistemi di imaging. Nota: La procedura seguente si presuppone che gli intervalli di imaging sono le stesse in tutta la registrazione. Se questo non è il caso, potrebbe essere necessario esportare le informazioni di temporizzazione dal software di imaging e includerlo nell'ulteriore analisi.</li>
	<li>Aprire lo stack TIF contenente le celle in ImageJ.</li>
	<li>Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare un ROI sopra un fluorescente del cardiomyocyte nel canale del rosso. Assicurarsi che il ROI è abbastanza grande in modo che la cella non si muove fuori il ROI contraendo.</li>
	<li>Aprire il plugin manager di ROI ('Analyze | Strumenti | Manager di ROI') e premere il pulsante 'Aggiungi [t]' per aggiungere questo ROI come ROI1.</li>
	<li>Trascinare il ROI sulla stessa cella nel verde del canale e aggiungere questo ROI come ROI2.</li>
	<li>Nella ' analizzare | Impostare delle misurazioni menu, deselezionare tutte le opzioni ad eccezione di 'Valore grigio medio'. Nota: Questo deve essere fatto solo 1 x in una sessione di ImageJ.</li>
	<li>Nel gestore di ROI, premere il ' più | Multi misura ' pulsante. Selezionare le opzioni di 'Misurare tutte le slices' e 'Una riga per ogni fetta' e premere 'OK'. Si apre una finestra contenente un foglio di calcolo con tre righe (il numero di slice e la media di fluorescenza nella due ROIs che rappresenta la cella nel rosso e nel verde del canale, rispettivamente).</li>
	<li>Uso ' File | "Save As' per salvare il foglio di calcolo in un file di valori separati da virgola (CSV).</li>
	<li>Chiudere la finestra con lo stack di immagine e la finestra del foglio di calcolo senza chiudere la finestra di gestione di ROI. Aprire lo stack TIF contenente la misura di sfondo.</li>
	<li>Nel gestore di ROI, premere il ' più | Multi misura' pulsante. Selezionare le opzioni di 'Misurare tutte le slices' e 'Una riga per ogni fetta' e premere 'OK'.</li>
	<li>Uso ' File | "Save As' per salvare il foglio di calcolo con i dati di sfondo in un altro file CSV. Nota: I seguenti calcoli possono essere fatto con software del foglio elettronico. Abbiamo usato il software R18. Un semplice esempio di script che legge i dati di cella e lo sfondo dal file "cell.csv" e "background.csv" esegue i calcoli e traccia la rotta di tempo del segnale di potenziale di membrana viene fornito come File di codice supplementare 1.</li>
	<li>La registrazione in background, calcolare l'intensità media nel rosso e nel verde del canale. Sottrarre questo segnale di fondo dai segnali che rappresenta la cella nel canale rosso e verde per calcolare la corretta sfondo RFP e segnali GFP, rispettivamente.</li>
	<li>Come un surrogato per il potenziale di membrana, calcolare il rapporto RFP/GFP. Nota: Questo rapporto è adimensionale. In alternativa, che possa essere normalizzata al valore iniziale (cioè, ΔR/R0). Importante, informazioni utili sono contenute nei cambiamenti temporali piuttosto che in valori assoluti di questo rapporto. A causa di photobleaching irregolare la GFP e RFP, può verificarsi una deriva della linea di base in questo rapporto. Se necessario, tale una deriva della linea di base può essere corretto dalla costruzione di una curva della linea di base e sottraendo la RFP/GFP rapporto10.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo qui descritto consente una registrazione ottica di APs da un sottotipo specifico (cioè, ventricolare-come le cellule) di CMs generato da iPSCs umane. Umano iPSC-CMs sono uno strumento emergente per affrontare una grande varietà di problemi biologici e medici, e la differenziazione di diversi sottotipi di CM è un'importante fonte di variabilità sperimentale. Utilizzando elementi specifici promotore, l'espressione di un GEVI è specificamente realizzato in CMs che rappresenta il sottotipo di interesse, ch...

Cardiomiociti (CMs) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono uno strumento emergente di sezionare i meccanismi molecolari di malattia cardiaca, per studiare nuove terapie e allo schermo per avverse cardiache effetti1,2 ,3. Fin dall'inizio, malattie aritmogene quali canalopatie sono stati un fuoco importante di questa ricerca zona4. Di conseguenza, metodi per studiare elettrici fenotipi di CMs, quali aritmie o cambiamenti di morfologie di potenziale di azione (AP), sono il cuore di questa tecnologia.
Una considerazione importante nell'applicazione della iPSC-CMs è che non provochino l'attuale protocolli di differenziamento cardiaco in una popolazione omogenea delle cellule. Invece, sono piuttosto una miscela di cellule che assomigliano al nodo seno atriale e ventricolare CMs a diversi livelli di maturazione5,6,7,8. Questa eterogeneità può essere un'importante fonte di variabilità sperimentale, soprattutto se i parametri come la durata di AP (APD) sono studiati, che intrinsecamente differiscono tra sottotipi di CM (ad es., l'APD è più breve in atriale rispetto a CMs ventricolare). L'approccio convenzionale per affrontare questo problema è indagare singolo iPSC-CMs utilizzando il metodo di patch clamp e classificare ogni cella come nodale-, atriale-, o ventricolare-come, in base alle sue AP morfologia9. Qualsiasi analisi successiva possono essere quindi limitato alle cellule che rappresenta il sottotipo di CM di interesse. Il principale svantaggio di questa strategia è la limitata velocità effettiva e la mancanza di scalabilità. Inoltre, la natura invasiva della patch ed elettrofisiologia morsetto non consente l'imaging delle stesse cellule in sequenza a periodi di tempo estesi.
Qui, forniamo dettagli sperimentali su un metodo10 sviluppato per otticamente immagine APs in sottotipi specifici di iPSC-CMs. Questo supera il problema dell'eterogeneità di sottotipo e aumenta notevolmente la velocità di trasmissione rispetto ai metodi convenzionali, permettendo la rapida fenotipizzazione di iPSC-CMs che trasportano varianti genetiche o essere esposti a farmacologico agenti.
Panoramica dell'approccio imaging ottico sottotipo-specifici
Un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI), cui proprietà di fluorescenza cambi su depolarizzazione e ripolarizzazione della membrana cellulare, viene utilizzato per immagine otticamente cambiamenti del potenziale di membrana di CMs. La GEVI applicato qui è la proteina fluorescente-rilevamento della tensione VSFP-CR11, che consiste di un dominio transmembrana di rilevamento tensione fuso ad un paio di un verde (trifoglio) e una proteina fluorescente rosso (mRuby2) (Figura 1A). A causa della vicinanza di due fluorophores, l'eccitazione della proteina fluorescente verde risultati in una frazione dell'energia di eccitazione viene trasferito alla proteina fluorescente rossa tramite trasferimento di energia per risonanza (FRET). Di conseguenza, l'eccitazione della proteina fluorescente verde si traduce in un'emissione da sia il verde e il rosse proteine fluorescenti (Figura 1A, pannello superiore). Quando la cella depolarizza, si verifica una riorganizzazione strutturale nel sensore di tensione che si traduce in un riorientamento delle due proteine fluorescenti, aumentando l'efficienza FRET. Così, ancora di più l'energia di eccitazione viene trasferito dal verde alla proteina fluorescente rossa (Figura 1A, pannello inferiore). Di conseguenza, in una cella depolarizzata, l'emissione di fluorescenza verde è dimmer, e l'emissione di fluorescenza rossa è più luminoso in una cella a riposo il potenziale di membrana (Figura 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figura 1: imaging ottico della membrana potenziale con VSFP-CR. (A), A schema raffigurante l'azione della proteina fluorescente tensione sensibile CHE VSFP-CR è indicato. Al momento la depolarizzazione della membrana cellulare, una riorganizzazione strutturale nel dominio del transmembrane-rilevamento della tensione si traduce in un riorientamento del verde (GFP) e rossa proteina fluorescente (RFP), aumentando l'efficienza del Förster intramolecolare trasferimento di energia per risonanza (FRET). Sono raffigurati gli spettri (B) l'emissione di un VSFP all'eccitazione della GFP in cellule presso il potenziale di membrana di riposo (pannello superiore) e in cellule depolarizzate (pannello inferiore). Il cambiamento spettrale su depolarizzazione è esagerato per chiarezza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le modifiche dell'efficienza della FRET mirroring le fluttuazioni del potenziale di membrana sono Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con un'immagine splitter, che separa le emissioni di fluorescenza rossa e verde e li proietta su due zone adiacenti di il chip di una fotocamera sCMOS (Figura 2). Con questo set-up, l'emissione di fluorescenza a due bande di lunghezza d'onda differente possa essere registrato simultaneamente, che permette il calcolo di un rapporto di fluorescenza rosso-verde in modo da riflettere il potenziale in ogni immagine di una serie di time-lapse di membrana.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figura 2: configurazione del sistema di imaging. I componenti principali del sistema di imaging utilizzata per immagine sono raffigurati i cambiamenti spettrali della proteina fluorescente tensione-sensibili del mirroring i cambiamenti di potenziale di membrana ad alta risoluzione temporale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'espressione di VSFP-CR in CMs è raggiunto attraverso la trasduzione lentivirale. Per indirizzare l'espressione per il sottotipo di CM di interesse, il lentivirus contiene un elemento di promotore (il rinforzatore di MLC2v ) che spinge in particolare trascrizione in ventricolare-come iPSC-CMs10. Quando l'iPSC-CMs che rappresentano una miscela di cellule simil-atriale, nodale-come e ventricolare-come vengono trasdotti con questo lentivirus, VSFP-CR è espressa solo nelle cellule simil-ventricolare. Poiché l'imaging ottico potenziale d'azione dipende da questo sensore fluorescente, i potenziali di azione registrati rappresentano esclusivamente il sottotipo di CM di interesse (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figura 3: espressione del promotore-driven VSFP per l'imaging di potenziali di membrana sottotipo-specifici. (un) questo schema Mostra come sono realizzate le registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici del cardiomyocyte. (b) iPSC-CMs infettato da un VSFP sotto il controllo della ventricolare specifiche MLC2v-enhancer sono mostrati. L'espressione nel sensore di tensione è osservata solo in ventricolare-come CMs nel canale GFP (pannello di sinistra). A vostra disposizione anche il contrasto di fase (pannello centrale) e l'immagine di sovrapposizione (pannello di destra). Le linee bianche tratteggiate segnano confini delle cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>&szlig;-Mercaptoetanolo</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21331046</td><td></td></tr><tr><td>FBS (siero fetale bovino)</td><td>Invitrogen</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I Integratore</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>alternativa L-Glutammina</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di esadimetririna (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>che migliora l'infezione lentivirale</td></tr><tr><td>Micropiastre con fondo di vetro da 3,5 cm</td><td>MatTek corporation, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per microscopio</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo per microscopio</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td>HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Fotocamera</td> sCMOS ad olio <td></td></tr><tr><td></td><td>Andor Technology, Belfast, Regno Unito</td><td>Zyla V</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtrante per microscopio: filtro di eccitazione</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>ET480/40X</td><td>passa-banda 480/40</td></tr><tr><td>Cubo filtrante per microscopio: specchio dicroico</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA</td><td>Splitter di immagini T505lpxr</td><td>passa-lungo 505 nm</td></tr><tr><td></td><td> Cairn Research, Faversham, Regno Unito</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>Cubo filtro splitter di immagini: specchio dicroico</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Germania</td><td>568LPXR</td><td>passa-lungo 568 nm</td></tr><tr><td>Cubo filtro splitter di immagini: filtro di emissione 1 (emissione GFP)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Germania</td><td>520/28 BrightLine HC</td><td>passa-banda 520/28 nm</td></tr><tr><td>Cubo filtro splitter di immagini: filtro di emissione 2 (emissione RFP)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Germania</td><td>630/75 ET Passa-banda</td><td>passa-banda 630/75 nm</td></tr><tr><td>Inserto di stimolazione</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>RC-37FS</td><td></td></tr></tbody></table>

registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di pluripotent

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Cardiomiociti generati dalle cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSC-CMs) sono uno strumento emergente nella ricerca cardiovascolare. Piuttosto che essere una popolazione omogenea delle cellule, l'iPSC-CMs generati da protocolli correnti di differenziazione rappresentano una miscela delle cellule con ventricolare-, atriale-e fenotipi nodale-like, che complica l'analisi fenotipiche. Qui, un metodo per registrare otticamente i potenziali di azione in particolare da ventricolare-come iPSC-CMs è presentato. Questo si ottiene attraverso la trasduzione lentivirale con un costrutto in cui un indicatore di tensione geneticamente codificato è sotto il controllo di un elemento promotore ventricolare-specifico. Quando iPSC-CMs vengono trasdotti con questo costrutto, il sensore di tensione è espresso esclusivamente in ventricolare-come le cellule, che permette registrazioni potenziali di membrana ottico sottotipo-specifici utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse.

In Figura 4a, un singolo rappresentante iPSC-CM è raffigurato con le linee bianche tratteggiate marcatura il ROI disegnato durante l'analisi di imaging RFP (lato sinistro) e il canale GFP (lato destro). Il segnale dal canale RFP Mostra un aumento periodico intensità fluorescente durante ogni potenziale di azione (Figura 4b, pannello superiore). Come descritto nell'introduzione, questo è a causa di un crescente apprensione causata...

Qui presentiamo un metodo per immagine otticamente i potenziali di azione, in particolare in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ventricolare-come. Il metodo si basa sull'espressione di una proteina fluorescente tensione sensibile promotore-driven.

Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

I cardiomiociti generati da cellule staminali pluripotenti indotte o IPS sono sempre più utilizzati per rispondere a una varietà di domande biologiche nel campo dell'elettrofisiologia cardiaca. I principali vantaggi di questa tecnologia sono che consente un drammatico aumento della produttività e registrazioni potenziali di azione specifiche del sottotipo in ventricolari come miociti, utilizzando un elemento promotore specifico ventricolare. L'introduzione di sensori di tensione geneticamente codificati attraverso la trasduzione lentivirale consente l'imaging ottico di potenziali d'azione cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo.Inizia mescolando il supernatante di coltura cellulare contenente lentivirus con un mezzo di mantenimento dei cardiomiociti, con un rapporto uno a uno. Aggiungere bromuro di esadimetherine a una concentrazione finale di 8 microgrammi per millilitro, per migliorare l'efficienza dell'infezione. E sostituire il mezzo di mantenimento dei cardiomiociti nel piatto di coltura di cardiomiociti derivato dalle cellule IPS, con il mezzo di infezione.Coltura i cardiomiociti infetti per 12 ore a 37 gradi Celsius e sostituire il mezzo di infezione con un mezzo di mantenimento cardiomiocitario fresco. Prima dell'imaging, scambiare il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di Tyrode, integrata con calcio. Quindi posizionare i cardiomiociti in una camera di imaging sul palco di un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di uno splitter di immagini.Se è necessaria la stimolazione elettrica, installare elettrodi di stimolazione nella camera di imaging e collegare gli elettrodi a un generatore di stimolo. Mettere a fuoco le cellule e individuare una cellula che esprima l'indicatore di tensione geneticamente codificato al centro del campo visivo. Impostare il percorso ottico in modo che la luce emessa venga instradata allo splitter dell'immagine e passare al cubo del filtro al microscopio su quello da combinate con i filtri nello splitter dell'immagine.Nel software che controlla la fotocamera, impostare l'impostazione di acquisizione in modo che sia possibile l'imaging ad alta velocità e impostare lo splitter dell'immagine secondo le istruzioni del produttore. Le due immagini che rappresentano le due diverse bande di lunghezza d'onda di emissione dovrebbero essere adiacenti l'una all'altra, ognuna delle quali occupa la metà dell'immagine. Controllare e regolare la messa a fuoco dell'immagine prodotta dalla fotocamera in base alle esigenze.E regolare la luminosità della luce di illuminazione in modo da evitare la saturazione dei pixel. Impostare l'acquisizione delle serie temporali e ammazzare la luce nella stanza per evitare che la luce vagante influenzi la misurazione. Quindi aprire l'otturatore luminoso di eccitazione e iniziare l'acquisizione della serie di immagini, avviando il ritmo elettrico nel momento appropriato, come sperimentalmente appropriato.Al termine dell'acquisizione, chiudere l'otturatore della luce di eccitazione in base alle esigenze e salvare la registrazione sul disco rigido. Quindi, lasciando invariata l'impostazione di registrazione, registrare lo sfondo su un'area del coverslip senza celle. Per l'analisi delle registrazioni potenziali della membrana ottica, aprire la pila di tiff contenente le cellule in ImageJ e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare una regione di interesse su un cardiomiocita fluorescente, nel canale rosso, facendo attenzione che l'area sia abbastanza grande da non spostarsi fuori dalla regione mentre si contrae.Selezionare Analizza, Strumenti, Gestione area di interesse e Aggiungi T per aggiungere l'area come area di interesse 1. Trascinare l'area di interesse sulla stessa cella nel canale verde e aggiungere questa area come Area di interesse 2. Nei menu Analizza e imposta misure deselezionate tutte le opzioni ad eccezione del valore grigio medio.In Gestione area di interesse fare clic su Altro e misura multima misura per selezionare le opzioni Misura tutte le sezioni e Una riga per sezione e fare clic su OK. Si aprirà una finestra contenente un foglio di calcolo con le tre righe. Utilizzare File e Salva con nome per salvare il foglio di calcolo in un file di valori separato da virgole. Chiudere la finestra con lo stack di immagini e la finestra del foglio di calcolo senza chiudere la finestra Gestione area di interesse e aprire lo stack di tiff contenente la misurazione in background.In Gestione area di interesse fare clic sulle opzioni Altro e Misura multima misura per selezionare le opzioni Misura tutte le sezioni e Una riga per sezione e fare clic su OK. Quindi salvare i dati in background in un file CSV separato. Qui, viene raffigurato un singolo cardiomiocita derivato dalle cellule IPS rappresentativo con le linee tratteggiate bianche che segnano le regioni di interesse, disegnate durante l'analisi di imaging nei canali RFP e GFP. Il segnale proveniente dal canale RFP mostra un aumento periodico dell'intensità fluorescente durante ogni potenziale d'azione a causa di un crescente trasferimento forzato o di energia di risonanza causato da cambiamenti nel potenziale della membrana.Concordemente, il segnale GFP mostra una diminuzione periodica dell'intensità fluorescente. Il rapporto RFP/GFP è il segnale biologico utilizzato nelle analisi a valle, come la durata potenziale d'azione 50 e 90 misurazioni. Ad esempio, utilizzando questo metodo, i cardiomiociti derivati dalle cellule IPS di 30 giorni, posizionati a 0,5 Hertz, hanno mostrato una durata potenziale di azione media di 50 di 439 millisecondi e una durata potenziale di azione media 90 di 520 millisecondi.La stimolazione elettrica dei cardiomiociti derivati dalle cellule IPS ad aumentare i tassi di stimolazione ogni cinque battiti, ha dimostrato un progressivo accorciamento dei potenziali d'azione con l'aumento del tasso di battitura. Inoltre, il trattamento dei cardiomiociti derivati dalle cellule IPS che battono spontaneamente con isoproternolo, un agonista nonselective del recettore beta adreno, ha portato a un rapido aumento del tasso di battimento, che potrebbe essere ulteriormente aumentato con l'aumento delle dosi dell'agonista. Mentre questo metodo fornisce una produttività superiore rispetto alle misurazioni elettrofisiologiche classiche, bisogna essere consapevoli dei suoi limiti, inclusa una risoluzione temporale limitata dalle proprietà cinetiche intrinseche del sensore di tensione fluorescente.

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