Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent

I cardiomiociti generati da cellule staminali pluripotenti indotte o IPS sono sempre più utilizzati per rispondere a una varietà di domande biologiche nel campo dell'elettrofisiologia cardiaca. I principali vantaggi di questa tecnologia sono che consente un drammatico aumento della produttività e registrazioni potenziali di azione specifiche del sottotipo in ventricolari come miociti, utilizzando un elemento promotore specifico ventricolare. L'introduzione di sensori di tensione geneticamente codificati attraverso la trasduzione lentivirale consente l'imaging ottico di potenziali d'azione cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo.

Inizia mescolando il supernatante di coltura cellulare contenente lentivirus con un mezzo di mantenimento dei cardiomiociti, con un rapporto uno a uno. Aggiungere bromuro di esadimetherine a una concentrazione finale di 8 microgrammi per millilitro, per migliorare l'efficienza dell'infezione. E sostituire il mezzo di mantenimento dei cardiomiociti nel piatto di coltura di cardiomiociti derivato dalle cellule IPS, con il mezzo di infezione.

Coltura i cardiomiociti infetti per 12 ore a 37 gradi Celsius e sostituire il mezzo di infezione con un mezzo di mantenimento cardiomiocitario fresco. Prima dell'imaging, scambiare il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di Tyrode, integrata con calcio. Quindi posizionare i cardiomiociti in una camera di imaging sul palco di un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di uno splitter di immagini.

Se è necessaria la stimolazione elettrica, installare elettrodi di stimolazione nella camera di imaging e collegare gli elettrodi a un generatore di stimolo. Mettere a fuoco le cellule e individuare una cellula che esprima l'indicatore di tensione geneticamente codificato al centro del campo visivo. Impostare il percorso ottico in modo che la luce emessa venga instradata allo splitter dell'immagine e passare al cubo del filtro al microscopio su quello da combinate con i filtri nello splitter dell'immagine.

Nel software che controlla la fotocamera, impostare l'impostazione di acquisizione in modo che sia possibile l'imaging ad alta velocità e impostare lo splitter dell'immagine secondo le istruzioni del produttore. Le due immagini che rappresentano le due diverse bande di lunghezza d'onda di emissione dovrebbero essere adiacenti l'una all'altra, ognuna delle quali occupa la metà dell'immagine. Controllare e regolare la messa a fuoco dell'immagine prodotta dalla fotocamera in base alle esigenze.

E regolare la luminosità della luce di illuminazione in modo da evitare la saturazione dei pixel. Impostare l'acquisizione delle serie temporali e ammazzare la luce nella stanza per evitare che la luce vagante influenzi la misurazione. Quindi aprire l'otturatore luminoso di eccitazione e iniziare l'acquisizione della serie di immagini, avviando il ritmo elettrico nel momento appropriato, come sperimentalmente appropriato.

Al termine dell'acquisizione, chiudere l'otturatore della luce di eccitazione in base alle esigenze e salvare la registrazione sul disco rigido. Quindi, lasciando invariata l'impostazione di registrazione, registrare lo sfondo su un'area del coverslip senza celle. Per l'analisi delle registrazioni potenziali della membrana ottica, aprire la pila di tiff contenente le cellule in ImageJ e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare una regione di interesse su un cardiomiocita fluorescente, nel canale rosso, facendo attenzione che l'area sia abbastanza grande da non spostarsi fuori dalla regione mentre si contrae.

Selezionare Analizza, Strumenti, Gestione area di interesse e Aggiungi T per aggiungere l'area come area di interesse 1. Trascinare l'area di interesse sulla stessa cella nel canale verde e aggiungere questa area come Area di interesse 2. Nei menu Analizza e imposta misure deselezionate tutte le opzioni ad eccezione del valore grigio medio.

In Gestione area di interesse fare clic su Altro e misura multima misura per selezionare le opzioni Misura tutte le sezioni e Una riga per sezione e fare clic su OK. Si aprirà una finestra contenente un foglio di calcolo con le tre righe. Utilizzare File e Salva con nome per salvare il foglio di calcolo in un file di valori separato da virgole. Chiudere la finestra con lo stack di immagini e la finestra del foglio di calcolo senza chiudere la finestra Gestione area di interesse e aprire lo stack di tiff contenente la misurazione in background.

In Gestione area di interesse fare clic sulle opzioni Altro e Misura multima misura per selezionare le opzioni Misura tutte le sezioni e Una riga per sezione e fare clic su OK. Quindi salvare i dati in background in un file CSV separato. Qui, viene raffigurato un singolo cardiomiocita derivato dalle cellule IPS rappresentativo con le linee tratteggiate bianche che segnano le regioni di interesse, disegnate durante l'analisi di imaging nei canali RFP e GFP. Il segnale proveniente dal canale RFP mostra un aumento periodico dell'intensità fluorescente durante ogni potenziale d'azione a causa di un crescente trasferimento forzato o di energia di risonanza causato da cambiamenti nel potenziale della membrana.

Concordemente, il segnale GFP mostra una diminuzione periodica dell'intensità fluorescente. Il rapporto RFP/GFP è il segnale biologico utilizzato nelle analisi a valle, come la durata potenziale d'azione 50 e 90 misurazioni. Ad esempio, utilizzando questo metodo, i cardiomiociti derivati dalle cellule IPS di 30 giorni, posizionati a 0,5 Hertz, hanno mostrato una durata potenziale di azione media di 50 di 439 millisecondi e una durata potenziale di azione media 90 di 520 millisecondi.

La stimolazione elettrica dei cardiomiociti derivati dalle cellule IPS ad aumentare i tassi di stimolazione ogni cinque battiti, ha dimostrato un progressivo accorciamento dei potenziali d'azione con l'aumento del tasso di battitura. Inoltre, il trattamento dei cardiomiociti derivati dalle cellule IPS che battono spontaneamente con isoproternolo, un agonista nonselective del recettore beta adreno, ha portato a un rapido aumento del tasso di battimento, che potrebbe essere ulteriormente aumentato con l'aumento delle dosi dell'agonista. Mentre questo metodo fornisce una produttività superiore rispetto alle misurazioni elettrofisiologiche classiche, bisogna essere consapevoli dei suoi limiti, inclusa una risoluzione temporale limitata dalle proprietà cinetiche intrinseche del sensore di tensione fluorescente.